抗体は、実験室の技術で日常的に使用され、それらの治療および診断アプリケーションは急速に拡大しています。迅速かつ正確な抗原抗体結合特性は、これらのアプリケーションにとって非常に重要です。質量フォトメトリーは、非常に少量の材料を使用して結合親和性を迅速に測定します。
標識や固定化は不要で、同じ実験からタンパク質オリゴマー化と純度に関する情報を得ることができます。このプロトコルは、抗体の研究だけでなく、50キロダルトンを超える分子質量を持つタンパク質の強力なタンパク質タンパク質結合を測定するためにも使用できます。まず、ソフトチップ鉗子と洗浄ボトルを使用して、蒸留水、エタノール、蒸留水、イソプロパノール、蒸留水で上から下まで24%50ミリメートルのカバーリップを順次洗い流します。
最後の洗浄後、同じ方向にきれいな窒素の流れでカバースリップを乾燥させて、鉗子からの汚染を移動させないようにします。24を24ミリメートルのカバーリップに蒸留水とエタノールを示すように洗い流し、続いてきれいな窒素の流れを乾燥させる。乾燥後、24 x 24ミリメートルのカバースリップをアルミホイルの上に置き、両面テープのストリップをカバースリップに置きます。
その後、ホイルから24ミリメートルのカバースリップで24ミリメートルをカットし、穏やかに24の作業側にホイルを50ミリメートルカバースリップ押し出します。アフィニティー測定用の抗体抗原サンプルを調製するには、0.22ミクロンのシリンジフィルターを介して少なくとも2ミリリットルのPBSを濾過し、ほこり粒子および凝集体を除去し、対象の抗体および抗原ストックを遠心分離する。抗体および抗原ストックの280ナノメートルのUV吸収を測定して実際の濃度を決定し、サンプル当たり50マイクロリットルの最終体積で適切な範囲の抗原濃度で抗体抗原混合物の滴定シリーズを調製します。
次に、抗原抗体混合物を室温で約10分間インキュベートし、結合反応が化学平衡に達することを可能にする。質量光測定による抗体抗原親和性を評価するには、顕微鏡浸漬油を器具の目的に塗布し、流れチャンバーを顕微鏡のステージに置きます。フローチャンバチャネルの一端に10マイクロリットルの濾過済みPBSを加えます。
バッファは毛管の作用によってチャネルに入ります。データ収集ソフトウェアのフォーカス制御タブで、粗いステージの移動上下ボタンを使用して初期調整を行い、シャープネスをクリックしてシャープネス信号の読み出しを表示します。細かい上下調整ボタンを使用してシャープネスの値を最大化し、フォーカスとロックフォーカスを設定してフォーカス追跡機能を有効にします。
きれいなスライドの画像は、示されているように、第1の抗体抗原サンプルの20マイクロリットルを0.05%以下のシグナル値にし、小さなブロッティングペーパーで他方の端から液体を吸い込む必要があります。ロード直後にレコードをクリックして、100 秒のデータに相当する適切なフレーム数を取得します。データ収集期間の終了時に、データのファイル名を入力し、「OK」をクリックしてからサンプルをサンプルで保存します。
質量フォトメトリーデータを解析するには、対象ファイルを開いて[解析]をクリックします。[load]をクリックしてキャリブレーション機能をロードし、ファイルをクリックして結果を保存して、解析したデータを保存します。サンプル中の各種の相対濃度を求めるには、適合したイベントを開く。
csv ファイルを使用して、列 M のデータを適切なプロットおよび解析ソフトウェアにコピーし、プロット統計ヒストグラム関数を使用して分子質量分布をプロットします。ヒストグラムをダブルクリックしてプロットプロパティウィンドウを開き、自動ビン分割を無効にして、2.5 キロダルトンのビンサイズを選択します。ビンの中心とカウント データを作成するには、[適用] をクリックして移動します。
ヒストグラムをガウス関数に合わせるには、ビンの中心とカウント列を選択し、解析ピークとベースラインの複数のピークフィットメニュー機能をクリックします。分布プロットのピーク位置をダブルクリックして示し、[オープン NL フィット]をクリックします。XCピークセンターの固定チェックボックスをチェックし、その値をフリー抗体および単一および二重抗原抗体複合体の予想される分子質量に設定します。
幅パラメータの共有オプションをオンにして、[フィット]をクリックします。ガウス成分の適合ピーク高さの値は、サンプル中の各種の相対的な濃度を表します。次に、この式を使用して、各種の濃度分率をピーク高さの値から計算します。
スプレッドシートプログラムを使用して平衡定数を計算するには、解離定数計算を開きます。xlsx ワークシート。このワークシートでは、行 1 から 10 の黄色で強調表示されたセル値を変更して平衡定数計算を実行できます。
ナノモル単位の解離定数値を細胞B1およびB2に入力します。推定解離定数値が不明な場合は、セル B1 および B2 のデフォルト値は変更しないでください。ナノモル単位の抗体および全抗原濃度を細胞D2およびE2に入力し、各種の計算された分数値を細胞F2、G2、およびH2に入力します。滴定のグローバル分析を実行する場合は、適切なデータ分数値を行 2 ~ 10 に追加します。ソルバ パラメータ ウィンドウで、設定した目的ボックスにセル B15 を選択し、変数セル ボックスを変更して、セル B1 から B2 を選択します。
[to]オプションの[min]ボタンを選択し、[拘束されていない変数を負でないものにする]チェックボックスをオンにして、ソルバ法としてGRG非線形を選択し、[解決]をクリックします。最適解離定数値はセル B1 と B2 に表示されます。そして、二乗誤差の最終的な合計はセルB15に表示されます。本代表的実験では、抗ヒトトロンビン抗体を固定25ナノモル濃度と0、7.5、15、30、60、および120ナノモルヒトα-トロンビン濃度で滴定系列に行い、抗原抗体混合物と抗体のみを試料の分子質量分布を得た。
ガウス成分の最適フィットピーク高さパラメータを正規化し、種濃度画分を得た。次に濃度画分値をグローバルに適合させ、抗原抗体結合親和性を得た。その後、遊離抗体、単一抗原抗体複合体、および二重抗原複合体の実験濃度画分およびグローバルフィット結果をプロットすることができた。
正確なKD値を得るためには、すべての反応種を投入するためにタンパク質濃度を慎重に選択する必要があります。さまざまな抗原濃度を用いて滴定シリーズを用意することをお勧めします。データをフィッティングした後、誤差投影法を使用してフィッティング誤差を得ることができますが、実験を繰り返し、平均結合アフィニティー値の標準偏差を計算することをお試しください。
