<img src="/files/ftp_upload/1746/1746fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. La structure tridimensionnelle de la cystatine B complexe (bleu) à la papaïne (jaune). Mutés résidus de cystatine B sont indiquées en rouge. 1. Principes de label sans analyse de l&#39;interaction avec les systèmes Biacore Dans un type sans étiquette expérience de liaison en utilisant un système Biacore, une biomolécule dite «ligand» est fixée à la surface d&#39;une puce de capteur. Un système de canaux d&#39;écoulement apporte son partenaire de liaison, dite «analyte», en contact avec la surface de la puce, où la détection a lieu. Lorsque l&#39;analyte se lie au ligand, le changement résultant dans la masse d&#39;accumulation à la surface est détectée par résonance plasmonique de surface (SPR). La réponse RSP est proportionnelle à la quantité de liaison de l&#39;analyte. Depuis la liaison est mesurée en temps réel, la cinétique d&#39;association et de dissociation conconstantes pour une interaction spécifique peut être déterminée. A partir de ces constantes, il est possible de calculer l&#39;affinité que la constante de dissociation à l&#39;équilibre. Il est également possible de calculer à partir des données affinité état d&#39;équilibre contraignantes. Une méthode similaire peut également être utilisée pour déterminer la concentration d&#39;une protéine qui se lie spécifiquement à un ligand sur la surface. 2. Analyser les propriétés cinétiques d&#39;une interaction protéine-protéine Dans X100 Biacore, l&#39;analyse cinétique peut être effectuée en utilisant un seul cycle cinétique. Dans une expérience unique cycle cinétique, une série de concentrations de la substance à analyser est injecté dans un cycle d&#39;analyse unique sans régénération de la surface entre les deux injections. Par conséquent, un seul cycle cinétique permet une analyse cinétique quand il est difficile de trouver des conditions de régénération appropriées. Une fois que les données pour une expérience cinétique a été collecté, le logiciel d&#39;évaluation Biacore X100 génère leLes valeurs de K a, K d, K et D en ajustant les données d&#39;un modèle d&#39;interaction. 3. Approches pour déterminer la concentration de protéines L&#39;analyse des interactions entre biomolécules est important pour comprendre leur fonction. La caractérisation de la liaison des protéines à d&#39;autres protéines, de l&#39;acide nucléique, ou à de petites molécules est fondamentale à la recherche biochimique, et trouve son utilité dans de nombreux autres domaines, notamment la découverte de médicaments. Pour une mesure précise de la cinétique d&#39;interaction entre deux protéines qui interagissent, il est essentiel de connaître la concentration de protéines se liant spécifiquement dans l&#39;échantillon expérimental qui est utilisé comme analyte. Une lecture au spectrophotomètre A 280 ou dosages colorimétriques telles que celle employant réactif de Bradford est couramment utilisée pour déterminer la concentration totale en protéines. Cependant, les impuretés protéiques peuvent affecter le résultat. PlusSurtout, les deux formes active et inactive de la protéine sont inclus dans la concentration totale en protéines. En particulier dans le cas de protéines recombinantes, qui peuvent être inactives en raison de pliage incorrect, il est important de déterminer le pourcentage de protéines se liant spécifiquement dans l&#39;échantillon. Dans X100 Biacore, la concentration liée à l&#39;activité de liaison spécifique peuvent être déterminés par comparaison des niveaux de réponse de liaison à une courbe d&#39;étalonnage provenant d&#39;un étalon connu, ou en utilisant la méthode la plus récemment introduite Aucune calibration Analyse Concentration (ACCP). CFCA ne repose pas sur une norme. Par conséquent, ACCP est particulièrement utile dans le cas de l&#39;étude des formes mutantes de protéines, où les normes sont généralement pas disponibles. Dans une expérience ACCP, le taux initial de liaison est mesuré à des débits différents, dans des conditions où la diffusion de l&#39;échantillon à la surface de la puce est limitante. La diffusion coefficient de la substance à analyser, les dimensions de la cellule d&#39;écoulement et les débits sont pris en compte lors du calcul de la concentration de liaison spécifique de la liaison 1,2 taux initial. Dans une expérience de cinétique, la concentration de la substance à analyser est utilisée dans le calcul de la vitesse d&#39;association et de la constante cinétique d&#39;affinité à partir des données expérimentales. ACCP et mesure cinétique dans les systèmes Biacore reposent toutes deux sur les mêmes propriétés d&#39;interaction. Par conséquent, en utilisant la concentration de liaison spécifique déterminée par analyse Biacore, plutôt que la concentration totale en protéines, augmente la fiabilité des résultats. 4. En utilisant l&#39;analyse Biacore pour caractériser l&#39;interaction entre la cystatine B et la papaïne B cystatine mammifère est un inhibiteur réversible, protéines concurrentiel et de liaisons fortes des protéinases de cystéine papaïne-like, surtout la cathepsine B, H, K, L et S. Ces protéines sont principalement impliquées dans nonsélective dégradation des protéines intracellulaires. Cystatines sont présumés pour protéger les cellules et les tissus de la protéolyse inappropriée par ces enzymes. Ils ont également inactiver protéinases de cystéine de parasites et de virus et peut participer à la défense contre l&#39;invasion de ces agents infectieux. En outre, cystatines inhiber plusieurs protéases de cystéine de plantes, telles que la papaïne, qui est fréquemment utilisé comme modèle dans une enzyme études structure-fonction. La structure tridimensionnelle du complexe B cystatine avec la papaïne 3 montre que l&#39;interaction entre les deux protéines est dominé par les contacts hydrophobes, qui, du côté inhibiteur, sont fournis par les N-et C-terminales et deux boucles en épingle à cheveux ( Figure 1). Dans cette étude, nous examinons l&#39;importance de l&#39;extrémité C-terminale et la seconde boucle de liaison de la cystatine B pour la liaison à la papaïne en utilisant la cystatine B bovine variants contenant des mutations ponctuelles dans des domaines d&#39;interaction avec la papaïne. Nous déterminons d&#39;abord le co liaison spécifiquencentration des quatre variantes B cystatine utilisés, ainsi que celle de la protéine de type sauvage. Une fois que les concentrations de liaison spécifiques de la cystatine B actif est établie, les constantes de vitesse et d&#39;affinité de type sauvage et mutantes de variantes B cystatine liaison à la papaïne sont mesurées à l&#39;aide X100 Biacore. 5. Instruments et réactifs <ol><li> Les variantes B cystatine Cys3Ser/His75Gly, Cys3Ser/Leu73Gly, Cys3Ser/Tyr97Ala et Cys3Ser sont produites comme décrit précédemment 4. Tous les mutants contiennent une substitution de la cystéine supplémentaire à la sérine en position 3, pour empêcher la formation de ponts disulfure dimères inactifs de cystatine B. </li><li> L&#39;objectif de la papaïne est également préparé comme décrit précédemment 5. Il est le S-(méthylthio) papaïne (MMTS-papaïne) ayant un groupe méthylthio fixé à Cys25 actif dans la fente, ce qui rend la protéase catalytiquement inactif. </li><li> X100 X100 Biacore Biacore avec Plus Packl&#39;âge est utilisé pour mesurer et analyser les concentrations de liaison spécifique et de la cinétique de liaison. </li><li> MMTS-papaïne est immobilisé sur CM5 puce de capteur en utilisant le kit d&#39;accouplement Biacore Amine. </li><li> Les essais sont effectués à 25 ° C, et le tampon est le HEPES 0,01 M à pH 7,4, 0,15 M de NaCl, 0,0034 M EDTA et 0,05% de polysorbate 20. </li><li> Entre chaque variante de la cystatine B, la surface de capteur est régénérée avec NaOH 20 mM pendant 30 secondes à un débit de 10 l / min. </li></ol> 6.Immobilization du ligand MMTS-papaïne La fixation covalente de MMTS-papaïne pour CFCA analyse CFCA repose sur la mesure du taux de liaison dans des conditions où la vitesse est limitée par la diffusion des molécules d&#39;analyte à la surface (limitation de transport de masse). Ceci est favorisé par des niveaux élevés d&#39;immobilisation du ligand. Immobilisation de MMTS-papaïne a été mis en place et exécuté à l&#39;aide de l&#39;immobilisationAssistant de configuration de logiciels Biacore X100. <ol><li> Activer la surface en 2 cellule d&#39;écoulement par injection d&#39;un mélange de succinimide (NHS) et carbodiimide (EDC) pendant 7 minutes à un débit de 10 l / min. 1 cellule d&#39;écoulement n&#39;est pas modifié de manière à être utilisé comme surface de référence. </li><li> Injecter MMTS-papaïne à 50μg/ml dans du tampon acétate de sodium à pH 4,5 pendant 15 minutes à un débit de 5 l / min. </li><li> L&#39;éthanolamine est injecté pendant 7 minutes à un débit de 10 l / min pour désactiver les esters actifs restants. </li></ol> La procédure de couplage entière devrait se traduire par environ 3000 RU MMTS-papaïne immobilisé dans 2 cellule d&#39;écoulement. La fixation covalente de MMTS-papaïne pour l&#39;analyse cinétique La même procédure est utilisée pour immobiliser MMTS-papaïne pour l&#39;analyse cinétique, avec la seule différence étant que dans l&#39;analyse cinétique, le niveau de l&#39;immobilisation doit être faible afin d&#39;éviter la vitesse de liaison Becomment limitée par la diffusion. 1 cellule d&#39;écoulement n&#39;est pas modifié lors de cette étape et en vue d&#39;être utilisée comme surface de référence. <ol start="4"><li> Après l&#39;activation de la surface avec le mélange de NHS et EDC comme dans 7,1, MMTS-papaïne est injecté à 1μg/ml pour 50 secondes. Après que la surface est désactivable avec une injection d&#39;éthanolamine comme à l&#39;étape 7.3. </li></ol> Le niveau de couplage doit être d&#39;environ 50 RU après cette procédure. 7. Détermination de la concentration B cystatine utilisant le test ACCP <ol><li> L&#39;expérience ACCP est mis en place en fonction de l&#39;assistant ACCP en X100 Biacore Plus Package. Environ 10 nM de protéine est injectée à des débits de 10 à 100 l / min en double exemplaire pendant 48 secondes. La surface est régénérée avec NaOH 20 mM entre chaque cycle. </li><li> Inclure les injections vierges pour chaque débit. </li><li> La concentration en protéine est ensuite déterminée à partir de la liaison de données (figure 3) avec efonction de courrier évaluation CFCA du X100 Biacore plus le logiciel d&#39;évaluation package. <img src="/files/ftp_upload/1746/1746fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Résultats Figure 2. CFCA de l&#39;analyse de B. cystatine type sauvage Les données spécifiques de concentration de liaison a été extraite des sensorgrammes obtenus à des débits de 10 et 100 ml / min. <img src="/files/ftp_upload/1746/1746fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Concentrations Figure 3. Des mutants déterminés en utilisant une mesure 280 (n = 3) et CFCA (n = 2). Les erreurs-types sont indiquées par des barres d&#39;erreur. Les coefficients d&#39;absorption molaires ont été calculés comme décrit dans (6). Une grande différence dans les valeurs de concentration de Cys3Ser/Leu73Gly mutant déterminées par les deux méthodes peuvent être observés. </li><li> Lorsque l&#39;on compare la concentration déterminée par une mesure 280 avec que par ACCP, il est clair que, même si dans la plupart des cas, la protéine est pleinement active, pour la Cys3Ser/Leu73Gly variante, la fraction de la protéine active est très faible (figure 3). Le tableau ci-dessous présente les activités de la cystatine B variantes liées aux concentrations totales par A 280. <table border="0"><tbody><tr><td> Échantillon </td><td> CFCA par rapport à A 280 (%) </td></tr><tr><td> De type sauvage </td><td> 94 </td></tr><tr><td> Cys3Ser/His75Gly </td><td> 101 </td></tr><tr><td> Cys3Ser/Leu73Gly </td><td> 9 </td></tr><tr><td> Cys3Ser/Tyr97Ala </td><td> 99 </td></tr><tr><td> Cys3Ser </td><td> 83 </td></tr></tbody></table></li></ol> 8. Mesure de la cinétique de la cystatine B de liaison à la papaïne <ol><li> Sur la base des mesures ACCP, préparer une série de concentrations double allant de 2,5 à 40 nM pour chacune des variantes B cystatine. </li><li> L&#39;expérience cinétique est up en utilisant l&#39;assistant cinétique dans X100 Biacore avec l&#39;approche du cycle unique. La surface n&#39;est pas régénérée entre les injections, mais après la fin de chaque cycle d&#39;analyse à l&#39;aide de NaOH 20 mM en tant que solution de régénération. </li><li> Mettre en place l&#39;expérience de sorte que chaque cycle contenant l&#39;échantillon est flanquée par un cycle de vide, où un tampon est injecté à la place de l&#39;échantillon. </li><li> Utilisez la fonction d&#39;évaluation dans la cinétique X100 Biacore pour effectuer automatiquement des soustractions vierges de référence soustraite de données avant d&#39;installer un modèle d&#39;interaction 1:1. </li><li> Les données expérimentales obtenues pour la liaison de variantes B cystatine à la papaïne est illustré à la figure 4. Le tableau ci-dessous résume l&#39;association et de dissociation des constantes de vitesse et les constantes d&#39;équilibre de dissociation obtenus dans l&#39;analyse cinétique. <table border="0"><tbody><tr><td> Échantillon </td><td> k a (M -1 s -1) </td><td> k d (s -1 </sup&gt;) </td><td> K D (M) </td></tr><tr><td> De type sauvage </td><td> 1,8 x 10 6 </td><td> 0,41 x 10 -3 </td><td> 2,3 x 10 -10 </td></tr><tr><td> Cys3Ser/His75Gly </td><td> 1,1 x 10 6 </td><td> 1,7 x 10 -3 </td><td> 1,5 x 10 -9 </td></tr><tr><td> Cys3Ser/Leu73Gly </td><td> 1,1 x 10 6 </td><td> 23 x 10 -3 </td><td> 2,2 x 10 -8 </td></tr><tr><td> Cys3Ser/Tyr97Ala </td><td> 1,7 x 10 6 </td><td> 12 x 10 -3 </td><td> 7,1 x 10 -9 </td></tr><tr><td> Cys3Ser </td><td> 0,9 x 10 6 </td><td> 0,53 x 10 -3 </td><td> 5,8 x 10 -10 </td></tr></tbody></table> <img src="/files/ftp_upload/1746/1746fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. Profils cinétiques des variantes B cystatine binding à MMTS-papaïne déterminée en utilisant la cinétique du cycle simples. Sensorgrammes montrer à blanc et de référence soustraite des données avec un ajustement cinétique de 1h01 modèle d&#39;interaction recouverte de noir. </li><li> Bien que les taux d&#39;association des mutants sont comparables à celle de la protéine de type sauvage (figure 5, panneau supérieur), les constantes de vitesse de dissociation des mutants peut être supérieure de près de deux ordres de grandeur, avec une augmentation correspondante de la dissociation à l&#39;équilibre constante (figure 5, panneau inférieur). <img src="/files/ftp_upload/1746/1746fig5.jpg" alt="Figure 5" /> Figure 5. Les calculs des constantes de vitesse et d&#39;affinité ont été fondées sur les concentrations obtenues à partir de l&#39;ACCP. Les changements de K a, K d et K D, associée à des mutations sont représentées dans les graphiques. </li><li> Depuis concentration de l&#39;échantillon est un paramètre dans le calcul de la vitesse constante d&#39;association à partir des données expérimentales, il estimportante qu&#39;elle est correcte. En utilisant la concentration basée sur la A 280 à la place de mesure de l&#39;ACCP conduirait à la conclusion que Leu73 est important pour la vitesse d&#39;association, où le remplacement semble se traduire par environ 10 fois plus lente que l&#39;association les autres variantes B cystatine. Cependant, la concentration de liaison spécifique mesurée par ACCP est seulement d&#39;environ 10% des protéines totales dans ce cas. Lorsque cela est pris en compte, il devient clair que le taux association pour Leu73 est similaire à celle des autres variantes. Par conséquent, CFCA permet une évaluation correcte de K a et K D rendant ainsi possible l&#39;interprétation appropriée du mécanisme d&#39;interaction. </li></ol>

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	<li>Christensen, L. L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theoretical+analysis+of+protein+concentration+determination+using+biosensor+technology+under+conditions+of+partial+mass+transport+limitation.">Theoretical analysis of protein concentration determination using biosensor technology under conditions of partial mass transport limitation.</a> Anal. Biochem. 249, 153-164 (1997).</li><li>Sigmundsson, K., M&#226;sson, G., Rice, R., Beauchemin, N., &#214;brink, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+active+concentrations+and+association+and+dissociation+rate+constants+of+interacting+biomolecules:+an+analytical+solution+to+the+theory+for+kinetic+and+mass+transport+limitations+in+biosensor+technology+and+its+experimental+verification.">Determination of active concentrations and association and dissociation rate constants of interacting biomolecules: an analytical solution to the theory for kinetic and mass transport limitations in biosensor technology and its experimental verification.</a> Biochemistry. 41 (26), 8263-8276 (2002).</li><li>Stubbs, M. T., Laber, B., Bode, W., Huber, R., Jerala, R., Lenarcic, B., Turk, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+refined+2.4+A+X-ray+crystal+structure+of+recombinant+human+stefin+B+in+complex+with+the+cysteine+proteinase+papain:+a+novel+type+of+proteinase+inhibitor+interaction.">The refined 2.4 A X-ray crystal structure of recombinant human stefin B in complex with the cysteine proteinase papain: a novel type of proteinase inhibitor interaction.</a> EMBO J. 9 (6), 1939-1947 (1990).</li><li>Pol, E., Bj&#246;rk, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+the+second+binding+loop+and+the+C-terminal+end+of+cystatin+B+(Stefin+B)+for+inhibition+of+cysteine+proteinases.">Importance of the second binding loop and the C-terminal end of cystatin B (Stefin B) for inhibition of cysteine proteinases.</a> Biochemistry. 38 (32), 10519-10526 (1999).</li><li>Bj&#246;rk, I., Pol, E., Raub-Segall, E., Abrahamson, M., Rowan, A. D., Mort, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+changes+in+the+association+and+dissociation+rate+constants+for+binding+of+cystatins+to+target+proteinases+occurring+on+N-terminal+truncation+of+the+inhibitors+indicate+that+the+interaction+mechanism+varies+with+different+enzymes.">Differential changes in the association and dissociation rate constants for binding of cystatins to target proteinases occurring on N-terminal truncation of the inhibitors indicate that the interaction mechanism varies with different enzymes.</a> Biochem. J. 299, 219-225 (1994).</li><li>Pace, C. N., Vajdos, F., Fee, L., Grimsley, G., Gray, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+measure+and+predict+the+molar+absorption+coefficient+of+a+protein.">How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein.</a> ProteinScience. 4 (11), 2411-2423 (1995).</li></ol>

L&#39;auteur est employé par GE Healthcare qui produit des réactifs et des instruments utilisés dans cet article.

Dans ce travail, quatre mutants et sauvages cystatine type B ont été produites afin d&#39;évaluer l&#39;importance de la seconde boucle contraignant et C-terminales de l&#39;interaction entre la cystatine B et la papaïne. Cette étude a démontré l&#39;avantage et la facilité d&#39;utilisation X100 Biacore pour déterminer la concentration spécifique de liaison et d&#39;analyser la cinétique de interactions protéine-protéine pour mieux comprendre les relations structure-fonction. Nous avons montré que mesure de la concentration totale en protéines ne révèle pas les variantes de protéines qui ont réduit l&#39;activité de liaison, qui dans ce cas introduit une erreur de mesure significative dans la détermination de l&#39;affinité de liaison et de cinétique. Les concentrations spécifiques de liaison des variantes B cystatine ont été déterminés en utilisant ACCP avec X100 Biacore. Utilisation des mesures de concentration par ACCP comme entrée pour l&#39;analyse cinétique conduit à vitesse fiable et constantes d&#39;affinité, permettant ainsi à la bonne interprétation du mécanisme d&#39;interaction. Les affinités diminution des mutants étaient presque exclusivement due à une augmentation de k d-valeur, alors que k a été très peu touché. Ce comportement indique que tant la région seconde boucle de liaison et l&#39;extrémité C-terminale ne sont pas importants pour le taux de liaison de l&#39;inhibiteur à la papaïne. Au lieu de cela, ils contribuent à une affinité de liaison principalement en gardant l&#39;inhibiteur lié à l&#39;enzyme une fois que le complexe a été formé.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd"><html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en"><div><table border="1"><thead><tr><th> Nom du produit </th><th> Type </th><th> Entreprise </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commenter </th></tr></thead><tbody><tr><td> Système X100 Biacore ™ </td><td></td><td> GE Healthcare </td><td> BR-1100-1173 </td><td> <a href="http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html">http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html</a> </td></tr><tr><td> Biacore ™ X100 Plus Package </td><td></td><td> GE Healthcare </td><td> BR-1007-1098 </td><td> <a href="http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html">http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100</a>/ SYSTÈME_INFOS / index.html </td></tr><tr><td> CM5 Capteur CCD </td><td></td><td> GE Healthcare </td><td> BR-1000-1014 </td><td> <a href="http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html">http://www.biacore.com/lifesciences/products/systems_overview/x100/system_information/index.html</a> </td></tr><tr><td> Amine Coupling Kit </td><td></td><td> GE Healthcare </td><td> BR-1000-1050 </td><td></td><tr><td> Tampon acétate pH 4,5, 50 ml </td><td></td><td> GE Healthcare </td><td> BR-1003-1050 </td><td></td><tr><td> HBS-EP + tampon 10X, 4 x 50 ml </td><td></td><td> GE Healthcare </td><td> BR-1008-1026 </td><td></td><tr><td> Flacons en plastique Ø 11 mm </td><td></td><td> GE Healthcare </td><td> BR-1002-1087 </td><td></td><tr><td> Capuchons en caoutchouc, type 2 </td><td></td><td> GE Healthcare </td><td> BR-1004-1011 </td><td></td></tbody></table></div>

the importance of correct protein concentration for kinetics and affinity determination in structure-function analysis 

Dans cette étude, nous explorons l&#39;interaction entre la cystatine B cystéine protéase inhibiteur de bovins et une forme catalytiquement inactive de la papaïne (Fig. 1), une cystéine protéase végétale, en temps réel sans étiquette en utilisant l&#39;analyse Biacore X100. Plusieurs variantes B cystatine avec des mutations ponctuelles dans des domaines d&#39;interaction avec la papaïne, sont produites. Pour chaque variante B cystatine nous déterminons la concentration de liaison spécifique en utilisant le calibrage sans analyse de la concentration (ACCP) et de comparer les valeurs obtenues avec une concentration totale en protéines tel que déterminé par un<sub&gt; 280</sub&gt;. Après cela, la cinétique de chaque variante B cystatine liaison à la papaïne est mesurée en utilisant un seul cycle cinétique (SCK). Nous montrons que l&#39;une des quatre variantes B cystatine que nous examinons n&#39;est que partiellement actif pour la liaison. Cette activité partielle, révélée par ACCP, se traduit par une différence significative dans le taux de constante d&#39;association (<em&gt; K</em<sub&gt; Un</sub&gt;) Et l&#39;affinité (<em&gt; K</em<sub&gt; D</sub&gt;), Par rapport aux valeurs calculées en utilisant une concentration totale en protéines. Utilisation ACCP en combinaison avec l&#39;analyse cinétique dans une étude structure-fonction contribue à l&#39;obtention de résultats fiables, et contribue à rendre la bonne interprétation du mécanisme d&#39;interaction.

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The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

On applique l&#39;étiquette sans analyse de l&#39;interaction des protéines avec X100 Biacore structure-fonction de l&#39;analyse de la liaison de plusieurs mutants cystatine B à travers la papaïne caractérisation cinétique. Étalonnage sans analyse de concentration (ACCP) mesure la concentration de protéine avec une activité de liaison maintenu sans la nécessité d&#39;une courbe d&#39;étalonnage. Nous montrons que la confirmation de concentrations en utilisant CFCA augmente la fiabilité de l&#39;analyse cinétique et que les constantes cinétiques peut être déterminée de manière fiable même si l&#39;activité d&#39;une protéine recombinante est réduite.

L&#39;importance de la concentration de protéines correct pour Cinétique et Détermination d&#39;affinité en analyse structure-fonction

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

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Research

JoVE Journal

Biology

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

20.4K vues.  GE Healthcare Bio-Sciences AB. On applique l'étiquette sans analyse de l'interaction des protéines avec X100 Biacore structure-fonction de l'analyse de la liaison de plusieurs mutants cystatine B à travers la papaïne caractérisation cinétique. Étalonnage sans analyse de concentration (ACCP) mesure la concentration de protéine avec une activité de liaison maintenu sans la nécessité d'une courbe d'étalonnage. Nous montrons que la confirmation de concentrations en utilisant...

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Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

Détermination microvolume concentration de protéines en utilisant le spectrophotomètre NanoDrop 2000c

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

Recherche

Biologie

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is believed to aid their search for suitable environments (1). This capability is conferred by the magnetosome, a subcellular organelle that consists of a linear-chain assembly of lipid vesicles each able to biomineralize and enclose a ~50-nm crystal of magnetite or greigite. A principle component of the magnetosome that was shown to be required for the formation of functional vesicles is MamA. MamA is a highly abundant magnetosome-associated protein which is one of the most characterized magnetosome-associated proteins in vivo (2-6). This article focuses on the purification of MamA, which despite being studied in vivo, no clear functional or structural details have been identified for it. Bioinformatics analysis suggested that MamA is a tetra-tricopeptide repeat (TPR) containing protein. TPR is a structural motif found as such or forming part of a bigger fold in a wide range of proteins, it serves as a template for protein-protein interactions and mediates multi-protein complexes (7). TPRs are involved in many crucial tasks in eukaryotic cell organelle processes and many bacterial pathways (8-14). In order to understand MamA, a unique TPR containing protein, highly purified protein is required as a first step. In this article, we present the purification protocol for a stable MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Purification of the &lt;em&gt;M. magneticum&lt;/em&gt; Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&amp;Delta;41

MamA is a unique Magnetosome associated protein which was shown to be involved in magnetosome activation. Here we present the purification protocol of MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Purification de la M. magneticum Strain AMB-1 Protein magnétosome Associated MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

Analyse du développement d&#39;un phénotype morphologique en fonction de la concentration de protéines dans la levure bourgeonnante

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Analyse de la cinétique ARNm exportation nucléaire dans les cellules de mammifères par micro-injection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

Détermination de la concentration des acides nucléiques et des protéines en utilisant le micro-volume Bio-spec Spectrophotomètre Nano

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein labeled, this method can be implemented for the investigation of protein-protein interactions. It is based on one hand on the recognition of the tagged protein by cobalt coated magnetic beads and on the other hand on the interaction between the tagged protein and a second specific protein that is labeled. First, the labeled and tagged proteins are mixed and incubated at room temperature. The magnetic beads, that recognize the tag, are added and the bound fraction of labeled protein is separated from the unbound fraction using magnets. The amount of labeled protein that is captured can be determined in an indirect way by measuring the signal of the labeled protein remained in the unbound fraction. The described liquid phase affinity assay is extremely useful when conformational conversion sensitive proteins are assayed. The development and application of the assay is demonstrated for the interaction between poliovirus and poliovirus recognizing nanobodies1. Since poliovirus is sensitive to conformational conversion2 when attached to a solid surface (unpublished results), the use of ELISA is limited and a liquid phase based system should therefore be preferred. An example of a liquid phase based system often used in polioresearch3,4 is the micro protein A-immunoprecipitation test5. Even though this test has proven its applicability, it requires an Fc-structure, which is absent in the nanobodies6,7. However, as another opportunity, these interesting and stable single-domain antibodies8 can be easily engineered with different tags. The widely used (His)6-tag shows affinity for bivalent ions such as nickel or cobalt, which can on their turn be easily coated on magnetic beads. We therefore developed this simple quantitative affinity capture assay based on cobalt coated magnetic beads. Poliovirus was labeled with 35S to enable unhindered interaction with the nanobodies and to make a quantitative detection feasible. The method is easy to perform and can be established with a low cost, which is further supported by the possibility of effectively regenerating the magnetic beads.

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. It is a reliable technique based on the interaction between magnetic beads and tagged proteins (e.g. nanobodies) on one hand and the affinity between the tagged protein and a second, labeled protein (e.g. poliovirus) on the other.

Un essai en phase liquide d&#39;affinité de capture utilisant des billes magnétiques pour étudier interaction protéine-protéine: Le poliovirus Exemple-Nanobodies

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

Un protocole pour l&#39;identification des interactions protéine-protéine Basé sur<sup&gt; 15</sup&gt; N marquage métabolique, immunoprécipitation, la spectrométrie de masse quantitative et d&#39;affinité de modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Protein Purification méthode sans la détermination de l&#39;affinité de liaison par thermophorèse Microscale

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Using recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules is an efficient means to discover interactions. The technique has largely been used to discover protein-protein interactions but the bait molecule to be challenged need not be restricted to proteins. The protocol presented here has been optimized to allow a modest number of baits to be screened in replicates to maximize the identification of independent clones presenting the same protein. This permits greater confidence that interacting proteins identified are legitimate interactors of the bait molecule. Monitoring the phage titer after each affinity selection round provides information on how the affinity selection is progressing as well as on the efficacy of negative controls. One means of titering the phage, and how and what to prepare in advance to allow this process to progress as efficiently as possible, is presented. Attributes of amplicons retrieved following isolation of independent plaque are highlighted that can be used to ascertain how well the affinity selection has progressed. Trouble shooting techniques to minimize false positives or to bypass persistently recovered phage are explained. Means of reducing viral contamination flare up are discussed.

Phage display is a powerful technique to capture proteins or protein moieties that interact with an immobilized molecule of interest. Once a decision of the type of phage cDNA library to create and screen has been made, the protocol described here permits efficient affinity selection leading to identification of interactors.

Un protocole pour Phage Display et Affinity sélection en utilisant appâts protéine recombinante

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks

Multi-tissue paraffin blocks provide high throughput analysis with increased efficiency, experimental uniformity, and reduced time and cost. Tissue microarrays make up the majority of multi-tissue paraffin blocks, but increasingly, researchers are using non-arrayed blocks containing larger tissues from multiple individuals which can provide many of the advantages of tissue microarrays without substantial investment in planning and equipment. A critical component of any multi-tissue analysis is the orientation method used to identify each individual tissue. Although methods exist to maintain proper orientation and identification of tissues in multi-tissue blocks, most are not well-suited to non-arrayed blocks, may consume valuable space within an array and/or are difficult to produce in the standard histology laboratory. The Specimen Orientation Tag (SpOT) is a simple, low cost orientation tool that is clearly visible in paraffin blocks and all tissue sections for reliable specimen identification in arrayed and non-arrayed layouts. The SpOT provides advantages over existing orientation methods for non-arrayed blocks as it does not require any direct modification to the tissue and allows for flexibility in the arrangement of tissue pieces.

The purpose of the Specimen Orientation Tag (SpOT) is to function as an orientation tool to aid in individual tissue identification in multi-tissue paraffin blocks. These protocols demonstrate how it is constructed easily from common, low-cost histology materials and serves as a reliable visual marker in paraffin blocks and sections.

Repérer les tissus correcte à chaque fois dans les blocs multi-tissus

Multi-tissue paraffin blocks provide high throughput analysis with increased efficiency, experimental uniformity, and reduced time and cost. Tissue ...