まず、FBS中のSH-SY5Y細胞の凍結ストックを速やかに融解します。10%DMSOを添加し、予め温めた培地で10倍に希釈します。次に、細胞を遠心分離し、上清を除去します。
細胞ペレットを予熱した5ミリリットルの培地に再懸濁し、細胞をT25フラスコに播種します。PDLでコーティングされたカバースリップを調製するには、600マイクロリットルの50マイクログラム/ミリリットルのPDL溶液を滅菌チャンバーカバースリップの各ウェルに塗布します。各ウェルに添加されるPDLの量は、ウェルのサイズによって異なります。
カバースリップをインキュベートし、室温で1時間設定します。インキュベーション後、PDL溶液を取り除き、カバースリップを1.8ミリリットルの蒸留水で3回すすぎます。コーティングされたチャンバーを2時間風乾させます。
SH-SY5Y細胞が80〜90%のコンフルエントに達したら、トリプシン溶液を添加して解離します。予め温めたDMEM培地を添加してトリプシンを中和します。細胞懸濁液を遠心分離し、ペレットをDMEMに再懸濁します。
自動セルカウンターでセルをカウントします。次に、10 の 1.5 倍の密度で、1 平方センチメートルあたり 4 番目の細胞を PDL コーティングされたチャンバー付きカバーガラスに播種します。1日目と3日目に、それぞれ5%または2%FBS、1%抗生物質抗真菌薬、および同じ添加量の10マイクロモルRAまたは95%エタノールを添加したDMEMで培地を交換し、分化のためのビヒクルコントロールとして使用します。
分化状態に応じて2%または10%FBS、1%抗生物質抗真菌薬、および20ミリモルヘップを添加した、予熱したフェニルレッドフリーDMEMでPKMOストックを調製します。6日目に、細胞をイメージング培地で2回すすぎ、細胞を37°Cおよび5%二酸化炭素のPKMO溶液で30分間インキュベートします。染色後、予め温めたイメージングメディアで細胞を3回すすぎます。
最終洗浄では、細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%で30分間インキュベートします。インキュベーション後、最終洗浄液を20ミリモルのヘペを含む新しい予熱したイメージングメディアと交換します。
