この方法は、ミトコンドリア酸化還元状態が病態生理学的状態でどのように影響を受けるかを調べることができます。また、ミトコンドリアの保護を目的とした治療戦略の有効性を評価するために使用することができます。この技術の主な利点は、リアルタイムでミトコンドリア酸化還元状態の動的およびトレースの変化の器官および特異的な評価を可能にすることです。
この方法は、同時に記録する追加の指標と組み合わせることができ、例えば、レドックス状態に加えてミトコンドリア膜電位またはカルシウム濃度。このプロトコルは、培養細胞、組織外植物およびスライス培養物に適用することができる。まず、走査型共焦点顕微鏡の設定を最適化します。
これを行うには、検出器を12ビットまたは16ビットに設定し、シーケンシャルスキャンモードを有効にして、2番目のシーケンス/トラックを追加します。どちらのチャンネルでも、露出が少ないピクセルを示す擬似色参照テーブルを選択し、対象のオブジェクトに適した目的を選択します。細胞を含むカバースリップをイメージングチャンバーに取り付けます。
1ミリリットルのイメージングバッファーを追加し、チャンバーを顕微鏡に置きます。接眼レンズと透過光を使用して細胞に焦点を当てます。異なるピクセル形式とピンホールサイズで画像を記録します。
次に、異なるレーザー強度で画像を記録し、それに応じて検出器のゲインとしきい値を調整します。最後に、異なるスキャン速度とフレーム平均の異なる数で画像を記録します。ライブイメージングの場合は、タイムラプス間隔を30秒に、持続時間を25分に設定します。
次に、細胞を取り付け、顕微鏡上にチャンバーを置き、前に示したように細胞に焦点を当てます。スキャンモードに切り替え、ライブビューで488ナノメートルチャンネルを使用して、画像撮影用の細胞に焦点を当てて位置付けます。必要に応じて、1 回の実行で記録されるセルの数を増やすには、マルチポイント関数を使用して、カバースリップごとに 2 ~ 3 個の視野をイメージします。
タイムラプス取得を開始し、5つの画像を2分間のベースライン記録として記録します。30マイクロモルの最終濃度を達成し、10分間のNMDA応答として追加の20画像を記録するために、3X NMDA溶液の500マイクロリットルをチャンバに加えます。次に、4X DA溶液500マイクロリットルをチャンバーに加え、さらに6枚の画像を記録します。
イメージングチャンバーからバッファーを吸引し、1ミリリットルのDTT溶液に交換します。10以上の画像を記録した後、記録を終了し、画像シリーズを保存します。画像解析ソフトウェアでデータをインポートするには、プラグインをクリックし、バイオフォーマットを選択してから、バイオフォーマットのインポーターを選択します。
ダイアログボックスで、ビュースタックでハイパースタックを選択し、カラーモードをデフォルトとして設定し、自動スケールを選択します。イメージをクリックし、種類を選択して 32 ビットにイメージ形式を変更し、オプションから 32 ビットを選択します。カラーチャンネルを別々のウィンドウに分割するには、画像をクリックし、色に移動して、分割チャンネルを選択します。
画像をクリックし、調整としきい値を選択して、分析用のミトコンドリアを選択するためにしきい値を調整します。ダイアログボックスで、デフォルトの赤い暗い背景とスタックヒストグラムを選択します。選択したピクセルが赤く表示されたら、適用をクリックします。
次に、すべての画像をナンに設定して、チャンネル2に対して同じ手順を実行するように設定します。405~488ナノメートル比を可視化するには、プロセスと画像計算機をクリックして比率画像を作成します。ダイアログ ボックスで、イメージ 2 の操作チャネル 2 で、イメージ 1 の分割でチャネル 1 を選択します。
次に、[新しいウィンドウを作成]を選択し、すべての画像を処理します。イメージをクリックし、参照テーブルを選択して、イメージを疑似色に比率イメージの参照テーブルを変更し、起動します。画像を解析するには、個々の細胞またはミトコンドリアの周囲に、比率画像にROIを描画します。
ROI マネージャに ROI を追加するには、分析に進み、ツールをクリックし、ROI マネージャを選択して、[追加] をクリックして [すべて表示] を選択します。個々の細胞の405〜488ナノメートルの比率を測定するには、ROIマネージャをクリックし、コントロールAを押してすべてのROIを選択し、さらに進んでマルチメジャーを選択します。ダイアログボックスで、すべてのスライスとスライスごとに 1 つの行を測定するを選択します。
測定をスプレッドシートソフトウェアにエクスポートした後、405ナノメートルの画像を選択し、すべてのROIの強度を測定し、再度スプレッドシートソフトウェアに測定値をエクスポートします。同様に、488ナノメートル画像のROI強度を測定します。後で参照するためにROIを保存するには、コントロールAを押してすべてのROIを選択し、さらに進んで保存を選択します。
タイムラプス記録からのこれらの代表的なスナップショットは、NMDA治療の前後およびDAおよびDTTによる最大/分較正後のニューロンの比率画像を示す。30マイクロモルNMDAでのニューロンの治療は、数分以内にミトコンドリア酸化を誘導した。個々の蛍光チャネルの分析は、NMDA誘発ミトコンドリアアシドーシスが405と488ナノメートルの両方の励起にGFP蛍光の低下を引き起こしたことを明らかにした。
対照実験では、DAによる前処理は、NMDAによるそれ以上のミトコンドリア酸化を排除した。したがって、405〜488比は、酸化還元感受性GFP2蛍光強度のかなりの急弱にもかかわらず変化しなかった。この実験により、405~488ナノメートル比のpH変化の影響を受けないことを確認した。
別の実験では、ミトコンドリア膜電位、酸化還元状態、および形態を並行して評価した。60ミクロモルNMDAを用いたニューロンの治療は、テトラメチルRhodamineまたはTMREシグナルの損失をもたらし、405〜488ナノメートルのrho GFP比の増加に続いて、ミトコンドリアのいくつかの遅延切り上げが続いた。この方法を使用し始めるとき、慎重に顕微鏡の設定を最適化するために時間を取ることが非常に重要です。
これは、あなたの実験中に神経細胞を健康に保つのに役立ちます.また、常にレーザーの安全規則を尊重することも非常に重要です。ライブ録画中に改ざんする薬物を追加する場合は、レーザー放射にさらされないようにしてください。
