We thank Sidney Walker for providing technical help. This work was supported in part by a grant from the National Institute of Health (1R01EY024712-01A1).

倫理文：動物を対象とする手順は、バージニア工科大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されています。 注意：このプロトコルで使用されるいくつかのコンポーネントを処理し、廃棄する際エクストリーム予防措置を講じなければなりません。使用前に、地元の施設の指針と健康と安全慣行を確立し、従わなければならない、特に揮発性および非常に有毒である四酸化オスミウム、ため、重金属やソース放射能の、および硝酸鉛の両方である酢酸ウラニル、あります重金属毒。チオカルボ（TCH）は、取扱いを誤ると、爆発や有毒ガスを生成するために分解することができます。多くの機関は、これらの試薬は、日常的に利用され、支援を提供することができるでEMの中核施設を持っています。 脳組織とSBFSEMイメージングの作製<ol><li> 5％のisoflura - 4を使用して、C57黒色マウス（C57BL / 6J株） - 若い（4カ月齢〜2）麻酔機関のガイドライン以下のね。筋緊張、随意運動と尾のピンチのような嫌悪刺激に対する応答の欠如の損失を監視することによって麻酔を確認してください。 </li><li>解剖トレイの上でマウスをピンと腹側正中線に沿って皮膚に切開を行います。マウスの胸郭を公開するために、皮膚のさらなる切開を行います。横隔膜を切開し、慎重に拍動する心臓を露出するように外周に沿って胸腔を解剖してから、右心房に切開を行います。 </li><li>蝶のカニューレを使用して、左心室にカニューレを挿入。失血は、肝臓の色の変化によって確認されるまで、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）pH7.2の20mlの - 10を使用して経マウスを灌流。 注：肝臓の色の変化は、失血の程度を決定するためのガイドとして使用されます。赤褐色から肝臓の色の変化はピンクの淡いすることを確認してください。 </li><li> 2％のグルタルの20ミリリットル - 経10を用いてマウスを灌流アルデヒドおよび4％パラホルムアルデヒドが内から急速に脳組織を固定するために、0.10 Mカコジル酸緩衝液（pH 7.2）で行われました。固定テール硬化を観察することによって監視されます。 注：pHを調整し、水で100mlにボリュームを作るために塩酸を追加し、80ミリリットルの水にカコジル酸ナトリウムの2.14グラムを溶解することにより、0.10 Mカコジル酸緩衝液（pH 7.2）を準備します。 </li><li> 4 O℃で48時間、2％グルタルアルデヒドおよび4％パラホルムアルデヒドを含有する0.10 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液（pH 7.2）に固定することにより、その後、灌流に続いて、マウスの首を切る、脳を解剖</li><li> 48時間後ビブラトームを用いて400μmの冠状切片を作成した後、慎重に解剖顕微鏡42の下（例えば、海馬）脳内の関心領域を分析。慎重に組織をトリミングして、向きを保存するための写真を撮ります。 注：処理方法SBFSEMで組織染色のポストは中の重金属染色の様々な方法を組み合わせて順序は、分解能を向上させるとDeerinck ら 40によって以前に開発された方法に基づいています。 </li><li> 0.1 Mカコジル酸緩衝液（pH 7.2）にグルタルアルデヒド固定組織を3回、各5分洗浄します。 </li><li> 0.1 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液（pH 7.2）でタンニン酸を溶解することにより、0.1％タンニン酸溶液を調製します。溶解するまで旋回し、必要に応じて、0.45μmのフィルターでろ過します。 </li><li> RTで60分 - カコジルとPostfixの組織は、30のための1ミリリットルの試薬でインキュベートすることにより、0.1％タンニン酸緩衝しました。 注：インキュベーション時間は、組織のサイズに依存するが、30分には、ほとんどの組織に最適です。 </li><li>ウォッシュは、カコジル酸緩衝液（pH 7.2）で、5分ごとに3回を組織します。 </li><li> 0.3グラムのフェロシアン化カリウムおよびH 2 O（ の dH 2 O）10mlの蒸留で0.86グラムのカコジル酸ナトリウムを溶解させます。氷上のフェロシアン化カリウム溶液を保管してください。使用直前に、4％の四酸化オスミウム（OsO 4）の10ミリリットルを追加します。 </li><li> 2％のOSで組織を染色氷上で90分間mium-フェロシアンソリューション、。 dH 2 Oで3回、各5分洗浄</li><li> 1％チオカルボヒドラジド（TCH）溶液を10mlのdH 2 O中の0.1 gでTCHを溶解することによって調製します完全に溶解するまで10分ごとに旋回することにより、60℃で溶解します。 TCHの処理中に安全上の注意事項を守って、特に金属の使用を避けるように注意してください、高温に加熱、または溶液を乾燥させること。 </li><li> RTで20分間、新たに調製した1％TCHのサンプルを扱います。 dH 2 Oで3回、各5分洗浄</li><li> dH 2 Oで2％ま ​​でのOsO 4 4％を希釈し、1時間インキュベートすることにより2％水性四酸化オスミウムで染色組織。 dH 2 Oで洗浄組織3回、各5分</li><li> 4℃での dH 2 O中の1％酢酸ウラニルでサンプルO / Nインキュベートします。 </li><li> （Deerinck ら 40によって記載されるように）ウォルトンのリードアスパラギン酸溶液を調製します。 <ol><li> 250ミリリットルのdH 2 O中に0.998グラムのL-アスパラギン酸を溶かしpHが5.5に達するまで、次に滴下様式で、10Nの水酸化カリウム（KOH）を加えます。 pH調整した後、30分間60℃に10ミリリットルにアスパラギン酸ストックと熱を硝酸鉛の0.066グラムを追加します。 </li></ol></li><li> dH 2 Oで組織をすすぎ、60℃のオーブンで30分間ウォルトンのリードアスパラギン酸染色でインキュベートします。 dH 2 Oで3回、各5分洗浄</li><li> 100％エタノール、続いて、5分ごとに20％、50％、75％、85％および95％エタノールの冷蔵溶液を用いてアルコールを段階的な一連の3回、10分毎にサンプルを脱水します。 注：開かれたエタノールは、空気中から水分を吸収するように、新たにオープンした瓶から100％エタノールを使用すると失敗する埋め込む引き起こします。インキュベーション時間が長いほど、より大きな組織サンプルでは必要になります。 </li><li>プロピレンオキシドで洗浄サンプル2回、15分ずつ。 </li><li> NMA（ナジックメチル無水物）と1ミリリットルmlで10.5、25ミリリットルの樹脂を用いたプラスチック包埋樹脂を作るDDSA（ドデセニル無水コハク酸）、15.5DMP-30（2,4,6-トリスジメチルアミノメチルフェノール）。振盪することにより、樹脂を混ぜます。スピンとは、樹脂が泡決意するまで放置します。 注：これは、標準培地硬度のレシピです。電子顕微鏡の他のタイプ（EM）プラスチック樹脂を用いてもよいが、必ずしもすべての樹脂はSBFSEMのために働くように、事前に非必須の対照試料を用いて試験されるべきです。 </li><li> 10時間 - プロピレンオキシドは、約8の期間にわたって蒸発するように、2時間後に、最初はその後、非キャップキャップされているバイアルに、包埋樹脂とプロピレンオキシドの50ミックス：50で組織O / Nインキュベートします。 </li><li> 2時間きれいなバイアルに100％の新鮮な埋め込み樹脂に組織を転送します。 </li><li>平坦な金型中で新鮮な埋込樹脂で埋め込んだサンプルは、紙ラベルを印刷し、そして48時間60℃のオーブンでそれらを硬化含有します。約1時間後、再び組織の配置および整列をチェックし、必要に応じて調整します。 </li><li>関心のある領域にサンプルをトリミングしてgellinを使用したアルミニウムピンにマウントその後グラムシアノアクリレート瞬間接着剤または導電性エポキシ樹脂、アルミ端子に導電性経路を提供するために、ブロックの側面の周りのコロイド銀ペーストでコート。 </li><li>チャンバ内ウルトラミクロトームステージと低kVの反射電子検出器32を備えた走査型電子顕微鏡システムを使用して組織標本を調べます。 注：走査型電子顕微鏡（SEM）を使用中の楽器とサイトトレーニングを取得し、許可されたユーザになります。また、小規模なプロジェクトのための研究者や中核施設との連携が可能です。 SEM写真は、X線を発生させるように放射訓練も必要とされ得ます。 </li><li>サンプル画像には、次の設定を使用します。2.25 kVで、5時 - 10ナノメートル/ピクセルの解像度、80の間のフィールドサイズの - xの250μmであり、Y（他のフィールドが可能なサイズ）、および50のスライス厚 - 100 nmで、 20時間の期間 - 16で600スライス - 250の合計。 注意：設定が異なる顕微鏡の間で実質的に変化し、INDIvidualサンプル、および所望の解像度。これらの設定は、多くのサンプルのために容易に解釈されている画像を生成する必要があります。 </li></ol> 2.イメージングデータセットを分析注：画像J /フィジーのソフトウェアは、データセットを分析するために使用され、TrakEM2プラグインに依存します。前処理ステップは、ソフトウェアのさまざまな方法を使って行ってもよいし、豊富なまたは経験レベルに応じて軽微であってもよいし、スタックが得られました。オープンソースソフトウェア（1.50b版ImageJの、フィジーは2015年10月1日のダウンロード）を使用して、メインの変換は、ここで説明されています。 <ol><li>ソフトウェアで開き、→8ビットのメニュー項目画像→タイプを選択することで、元の独自の16ビット画像から8ビットTIFF形式に画像を変換します。 <ol><li>このステップの間、自動コントラスト/明るさ変換​​は画像のための理想的でない場合は、16ビット画像を再度開き、プレスイメージ→→明るさ/コントラストを調整します。すべての画像のために働く範囲を選択し、[Apply]を押します。その後、Cを実行しますonversion。注：一部のSEMでは、このステップは、顕微鏡メーカーのソフトウェアが必要な場合があります。 </li><li>スライス間の許容できない画像の動きに、必要な場合（ 例えばによる充電にドリフト）、登録/画像スタック（メニュー項目のプラグイン→登録→リニアStackAlignmentWithSIFT）を合わせます。ほとんどの登録ソフトウェアでは、「翻訳のみ」モードではなく、「剛体」に設定されました。 SIFT登録プラグインの多くのアプリケーションのための作品や仮想スタックのバージョンがあります：多くのアプローチとソフトウェアが動作する可能性があります注意してください。 <ol><li>必要な場合は、登録前にキャンバスサイズを拡大する（画像→→CanvasSizeを調整）または利息（画像→クロップ）の領域にそれを減らします。 いくつかのドリフトや扇形に開くが発生する可能性があり、および他のプラグインやソフトウェアをしようとすると、より良い結果を生む可能性があります注意してください。マニュアルオプションも（ 例えば ImageJを/ FIJI、プラグイン→登録→のManualLandmarkSelection）ご利用いただけます。 </li></ol></li><li>デザイアーズ場合編、より小さく、より管理しやすいサイズにスケール画像（ 例えば 25％）のImageJ（画像→スケール）を使用。 </li></ol></li><li>ソフトウェアを起動し、[ファイル]→[インポート]→[画像シーケンス、その後、TIFFファイルを選択します。 </li><li> （空白）新→TrakEM2→ファイルを選択して、プラグインを起動します。 2つのウィンドウが開きます。一つのプロジェクトとarea_listsを管理し、他のトレース管理し、「キャンバス」と呼ばれます。 </li><li>キャンバス、インポート時に右クリックを行うことで、プラグインに画像スタックをロードします。インポートを選択して、インポート・スタックをクリックしてください。ポップアップオプションでは、仮想スタックのためのチェックボックスをオンにします。 注：画像スタックが既にソフトウェアで開かれているが、彼らはまた、プラグインでオープンする必要があります。仮想スタックボックスがチェックされている場合は、コンピュータをより円滑に実行することができます。 </li><li>ミップマップが作成され、スタックがロードされた後、右側のプラグインウィンドウの下にプロジェクトの名前をクリックします。テンプレートCOLの「新しいプロジェクト」を右クリックしますUMN、およびそのプロジェクトのための「新しい子を追加」を選択します。右の「area_list &#39;を選択するには、もう一度クリックします。 </li><li>キャンバス上で右クリックし、元の電子顕微鏡写真の設定に同意するプロジェクトのZ軸スケールを設定し、表示をクリックして、キャリブレーションを選択します。また、右側のスケールZと厚さを選択する]をクリックし、プラグインウィンドウ内のすべてのレイヤを選択することにより、Z-スケールを設定。 </li><li>クリックして、「プロジェクト」とプロジェクトがキャンバスウィンドウ内の「Zスペース]タブの[地域のリスト」を作成するセクションオブジェクトにすべての「子供」をドラッグします。 </li><li>色を選択し、設定する「領域リスト」を選択し、右クリックし。さて、電子顕微鏡写真の画像では、このようなミトコンドリアなどのオブジェクトを追跡するためにペイントブラシツールを使用します。使用「Shiftキー+クリック」でズームイン、ズームアウト、および消しゴムにペイントブラシカーソルをオンにする「Altキー+クリック」するには、「Ctrlキー+スクロール」、囲まれた円形に記入します。 </li><li> 15ミクロン - 〜10の二つの領域を選択します10で - 画像の左上隅と右下隅の15ミクロンとすると、各データセット内のミトコンドリアの公平なサンプリングを可能にするために、これらの領域内のすべてのミトコンドリアを識別します。 </li><li> 「キャンバス」で、セクション全体のミトコンドリアを観察し、トレースします。注：ミトコンドリアは同様のサイズの非常に暗い/稠密に現れる細胞小器官、直径が緩く円筒形です。内膜によって形成されたユニークなクリステはこの細胞小器官の内部に容易に区別可能です。 </li><li>トレースが終了したら、右、Zスペース]タブの下のarea_listをクリックして「3Dで表示」を​​選択します。これは、トレースされた画像の3D再構成を表示するには、3Dビューアプラグインを起動します。 <ol><li>ミトコンドリアの体積測定、3Dビューアで選択したオブジェクトを実行するには、「編集」タブをクリックし、[オブジェクトのプロパティ]を選択します。ミトコンドリアの体積推定値は、いくつかの他の測定値と一緒に表示されています。 </li></ol></li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests. Emily K Benson is a paid employee of Renovo Neural Inc., and Grahame J Kidd serves as Scientific Director for 3DEM at Renovo Neural Inc., which is a commercial provider of serial block-face SEM services and analysis.

神経系の複雑さは、大きな組織のボリュームを再構築し、そのような十分な解像度を持つミトコンドリアなどの細胞小器官の形態や分布の分析に重要な課題を提起します。 3次元に拡張する多数のプロセスとニューロン、オリゴデンドロサイトおよびアストロサイトを含む複数の細胞が脳組織43内で相互作用します。ミトコンドリアは細胞や遠くの過程の細胞体の両方に存在するので?...

ミトコンドリアは細胞骨格との緊密な相互作用において、そのようなニューロン1におけるカルシウム電流などの細胞事象に応答して、携帯手がかりやニーズに応じて、その形状と位置を変更する動的な細胞小器官です。ミトコンドリアはまた、他の細胞小器官と相互作用順番に彼らのダイナミクスと代謝2を調節する小胞体を、 例えば 。ミトコンドリアの形態、 すなわち異なる細胞型における不均一性を示しています。細胞小器官の形状は、筒状のシート、袋や楕円3からなるものに変化します。ミトコンドリアの融合および分裂周期タンパク質は、ミトコンドリア4の位置、大きさ、形状及び分布を調節することができることが示されています。また、ミトコンドリアの形状の変化は、神経変性、神経可塑性、筋萎縮、カルシウムシグナル伝達、活性酸素種の生成だけでなく、寿命及び細胞死関与股関節に関連していますT細胞特異的なミトコンドリアの形態は、正常な細胞機能5-11の維持に重要です。 ミトコンドリアの主要な生体エネルギー機能は、TCAサイクルを介して、完全な栄養素の破壊（ すなわち 、グルコース、脂肪酸、酸またはアミノ酸）を含んでおり、OXPHOSが12を経路代謝反応のシリーズを実行することにより、アデノシン三リン酸（ATP）を生成することです。人間の脳は、体重のわずか2％しかし、それは〜それを器官13を要求する非常にエネルギーを作る製造全エネルギーの20％を消費する構成します。ヒトにおけるミトコンドリア機能障害は、神経学的症状14-17の多くをもたらすことは驚くべきことではありません。 5000個人、およびmの最も一般的な原因の1：ATP生成を損なうOXPHOSコンポーネントの遺伝的変異は、臨床的に不均質な〜1の有病率と疾患群であるミトコンドリア病17,18につながり、子供と大人でetabolic障害。ミトコンドリア由来のATPの赤字は、脳、心臓および骨格筋は、主にこれらの患者14,17,18に影響されるような高エネルギー厳しい臓器で複数の器官系に影響を与えます。近年では、複数の研究では、神経発達と神経変性疾患15-17,19,20両方におけるミトコンドリア機能障害のための証拠を提供しました。ミトコンドリアが不可欠と脳の発達と機能に重要であるので、健康と病気の両方の状態の下で脳ミトコンドリアの形態、構造、大きさ、数および分布の変化を分析することができるプロトコルを開発することが不可欠です。ミトコンドリア標的化緑色蛍光タンパク質（GFP）を有するマウスモデルは、脳21,22ミトコンドリア運動および局在化を可視化するために製造されています。これはミトコンドリアの運動性と一般的な分布を調べるために非常に便利なツールですが、INCLUDいくつかの欠点があります電子限られた解像度および蛍光顕微鏡の感度。これらの属性は、それが困難な比較的小さなサイズのミトコンドリアを追跡することを可能にします。同様に、シリアル伝送電子顕微鏡が正常シナプスミトコンドリア23を表示するために使用されてきたが、この方法は非常に時間がかかります。ミトコンドリアの形態は、それらが連続的な分裂および融合サイクルを受けるように非常に動的であることが知られており、大部分の細胞においてミトコンドリアは非常に接続されたネットワーク24〜26に維持されます。ニューロンは、複数の樹状突起と拡張軸索と高度に極性細胞であり、細胞体で接続された網状ネットワークを形成するミトコンドリアは、彼らがこれらの神経突起を介して自分の道（ 図1）を作るように分離する必要があります。これは、大きさや形状が極めて多様な脳ミトコンドリアを作ります。例えば、シリアルブロックフェイス走査電子顕微鏡を用いて（SBFSEM）技術は、我々が以前に観察されたシナプスmitochondrの体積またはサイズの違いとりわけ神経終末に存在するミトコンドリアに限り16として倍の27とすることができます。 ボリュームを実施するためのいくつかのアプローチがありますウルトラSEM 30収集シリアルセクションのTEM 29、自動化されたテープを含む、28の分析は、イオンビームSEM 31、およびSBFSEM 32を集中しました。 SBFSEM分析は、脳、1ミリメートルまでの領域におけるミトコンドリアのように、それは形態学的形状、大きさ、分布、および細胞小器官の数の定量的データを提供するために解像度を有するという利点を有します。技術的な操作は、以前のEMの経験が不足している多くの生物学的研究室の能力の範囲内のデータ収集と分析しても、少なくとも厳しいです。連続切片のような画像を生成するための市販の装置の出現は、組織の3次元超微細構造解析を行っている、さらに迅速かつ繰り返し可能な方法28で公平な容積測定分析を可能にするルーチン技術、 </SUP&gt;。 SBFSEMは、最初1981年33でレイトンによって導入されたアイデアをもとに、2004年32に記載されており、神経生物学の分野で使用された。それ以来、複数の研究は、神経回路34の再建分析の主要なツールとして、この技術を確立しました。また、多くの小規模なプロジェクトのために、それは、細胞小器官27,35-39を識別するために、再構成分析を提供します。以降、取得された画像は、低電圧後方散乱電子から誘導され、別の既知の重金属染色技術を組み合わせた新たな染色プロトコルは、解像度40を増加させるために開発されました。 本稿では、3次元電子顕微鏡イメージング、以前に私たちと他の人38,39,41によって使用されている方法に基づいて脳ミトコンドリアの容量分析を利用するためのプロトコルを提供します。組織後処理方法として以前Deerinck らによって記載された使用40。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Jackson laboratory&#160;</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>VETone, tradename Fluriso</td>
			<td>501017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection tray</td>
			<td>Fisher scientific&#160;</td>
			<td>S65105&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scissors</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>1316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butterfly canula</td>
			<td>Exel International</td>
			<td>26704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (0.45 micron)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>NC0813356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome sectioning system</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>Vibratome 3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate</td>
			<td>EMS</td>
			<td>12300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tannic Acid</td>
			<td>EMS</td>
			<td>21700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Ferrocyanide</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>14459-95-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide 4% Solution</td>
			<td>EMS</td>
			<td>19150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide</td>
			<td>EMS</td>
			<td>21900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>43731000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead Nitrate</td>
			<td>EMS</td>
			<td>17900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMbed-812 EMBEDDING KIT</td>
			<td>EMS</td>
			<td>14120</td>
			<td>Contains Embed 812&#160; resin, DDSA, NMA, and DMP-30.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 25% EM Grade</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>1909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td>19202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>EMS</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene Oxide</td>
			<td>EMS</td>
			<td>20400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding Mold</td>
			<td>EMS</td>
			<td>70907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum specimen pin</td>
			<td>EMS</td>
			<td>70446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colloidal Silver Liquid</td>
			<td>EMS</td>
			<td>12630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor</td>
			<td>EMS</td>
			<td>72000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue (Loctite Gel Control)</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>234790</td>
			<td>Hardware/craft stores carry this item</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive epoxy</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>16043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning electron microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Sigma VP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In chamber ultramicrotome for SEM</td>
			<td>Gatan Inc.</td>
			<td>3View2</td>
			<td>Can be designed for other SEMs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimming microscope for pin preparation</td>
			<td>Gatan Inc.</td>
			<td colspan="2">supplied as part of 3View system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low kV backscattered electron detector</td>
			<td>Gatan Inc.</td>
			<td>3V-BSED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/ Fiji processing package&#160;</td>
			<td colspan="2">ImageJ ver 1.50b, FIJI download Oct 1, 2015</td>
			<td><a href="http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf">http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://rsb.info.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf">http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://fiji.sc/TrakEM2">http://fiji.sc/TrakEM2</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of brain mitochondria using serial block-face scanning electron microscopy

人間の脳は、主燃料源として、グルコースに依存している臓器を消費する高エネルギーです。グルコースは、アデノシン三リン酸（ATP）の形態の細胞エネルギーを産生するために、解糖、トリカルボン酸（TCA）サイクル及び酸化的リン酸化（OXPHOS）経路を介して脳ミトコンドリアによって異化されます。ミトコンドリアのATP産生の障害は、顕著な神経学的および筋疾患の症状を臨床的に提示するミトコンドリア障害を引き起こします。ミトコンドリアの欠陥はまた、神経発達障害（ 例えば 、自閉症スペクトラム障害）および神経変性疾患に存在している（ 例えば 、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病およびパーキンソン病）。このように、健康と病気の両方の状態の下でミトコンドリアの形態、構造と分布の3次元解析を行うためのフィールドへの関心の高まりがあります。脳ミトコンドリアの形態は、特にいくつかのミトコンドリアで、中のものは極めて多様ですシナプス領域は、従来の光学顕微鏡の解像限界以下である&lt;200 nmの直径の範囲にあります。脳内のミトコンドリア標的化緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現することは著しく、共焦点顕微鏡によるオルガネラの検出を強化します。しかし、大型ミトコンドリアの画像を過飽和することなく、比較的小サイズのミトコンドリアの検出感度の制約を克服していません。シリアル透過電子顕微鏡が正常神経シナプスにおいてミトコンドリアを特徴付けるために使用されてきたが、この技術は非常に時間のかかる複数のサンプルを比較する場合は特にです。シリアルブロックフェイス走査電子顕微鏡（SBFSEM）技術、組織、およびデータ収集の撮像ブロックを切片の自動化プロセスを含みます。ここでは、急速にミトコンドリアの形態を再構築し、視覚化するげっ歯類の脳から定義された領域のSBFSEMを実行するためのプロトコルを提供します。このハイテクniqueはまた、定義された脳領域におけるミトコンドリアの数、量、サイズおよび分布に関する正確な情報を提供するために使用することができます。得られた画像の解像度は、（典型的には10nm未満）高いため、任意の総ミトコンドリアの形態学的欠陥も検出することができます。

我々は、脳ミトコンドリアの形態と大きさが異なるニューロンのサブコンパートメントにおいて不均一であることを示しています。ミトコンドリアを標的と緑色蛍光タンパク質を発現するレンチウイルスで形質導入された低密度の神経細胞培養上の共焦点顕微鏡は、遠位神経突起に存在するものは個別の細長い形態（ 図1 AB）を示すのに対し、神経細胞の...

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Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

シリアルブロック・フェイス走査型電子顕微鏡を用いて脳ミトコンドリアの解析

Mitochondrial visualization and analysis from mammalian brain tissue is a challenging task. Here, we describe how three dimensional (3D) reconstruction analysis from the serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) can be used to gain insights on the morphological and volumetric analysis of this critical energy generating organelle.

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...

analysis-brain-mitochondria-using-serial-block-face-scanning-electron

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.0K ビュー.  Virginia Tech Carilion Research Institute. Mitochondrial visualization and analysis from mammalian brain tissue is a challenging task. Here, we describe how three dimensional (3D) reconstruction analysis from the serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) can be used to gain insights on the morphological and volumetric analysis of this critical energy generating organelle. 

ビデオ: Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron microscope (FIB/SEM). The samples are fixed with aldehydes, heavy metal stained using osmium tetroxide and uranyl acetate. They are then dehydrated with alcohol and infiltrated with resin, which is then hardened. Using a light microscope and ultramicrotome with glass knives, a small block containing the region interest close to the surface is made. The block is then placed inside the FIB/SEM, and the ion beam used to roughly mill a vertical face along one side of the block, close to this region. Using backscattered electrons to image the underlying structures, a smaller face is then milled with a finer ion beam and the surface scrutinised more closely to determine the exact area of the face to be imaged and milled. The parameters of the microscope are then set so that the face is repeatedly milled and imaged so that serial images are collected through a volume of the block. The image stack will typically contain isotropic voxels with dimenions as small a 4 nm in each direction. This image quality in any imaging plane enables the user to analyse cell ultrastructure at any viewing angle within the image stack.

This protocol describes how resin embedded brain tissue can be prepared and imaged in the three dimensions in the focussed ion beam, scanning electron microscope.

集束イオンビームは、粉砕し、脳組織の走査型電子顕微鏡

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

神経科学

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

超音波血液脳関門の破壊とマンガン増強MRIを用いた脳機能イメージングの試み

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

小脳顆粒ニューロンの遺伝子操作<em&gt;体外</em&gt;と<em&gt;インビボ</em&gt;ニューロンの形態と移行を研究するために、

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

モデルとしての嗅覚系は、軸索の成長パターンと形態を研究する<em&gt;インビボ</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, formed by ribosomes, mRNAs, several proteins and non-coding RNAs, represent integrated platforms where translational controls take place. However, while the ribosome has been widely studied, the organization of polysomes is still lacking comprehensive understanding. Thus much effort is required in order to elucidate polysome organization and any novel mechanism of translational control that may be embedded. Atomic force microscopy (AFM) is a type of scanning probe microscopy that allows the acquisition of 3D images at nanoscale resolution. Compared to electron microscopy (EM) techniques, one of the main advantages of AFM is that it can acquire thousands of images both in air and in solution, enabling the sample to be maintained under near physiological conditions without any need for staining and fixing procedures. Here, a detailed protocol for the accurate purification of polysomes from mouse brain and their deposition on mica substrates is described. This protocol enables polysome imaging in air and liquid with AFM and their reconstruction as three-dimensional objects. Complementary to cryo-electron microscopy (cryo-EM), the proposed method can be conveniently used for systematically analyzing polysomes and studying their organization.

While ribosome structure has been extensively characterized, the organization of polysomes is still understudied. To overcome this lack of knowledge, we present here a detailed preparation protocol for accurate imaging of mammalian polysomes by atomic force microscopy (AFM) in air and liquid.

原子間力顕微鏡で脳ポリソームでピアリング

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

プレ埋め込み免疫組織化学および電子顕微鏡のための非ヒト霊長類脳組織の調製

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent development of thin, flexible ECoG electrodes has enabled conduction of stable recordings of large-scale cortical activity. We have developed a whole-cortical ECoG array for the common marmoset. The array continuously covers almost the entire lateral surface of cortical hemisphere, from the occipital pole to the temporal and frontal poles, and it captures whole-cortical neural activity in one shot. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain. Marmosets have two advantages regarding ECoG recordings, one being the homologous organization of anatomical structures in humans and macaques, including frontal, parietal, and temporal complexes. The other advantage is that the marmoset brain is lissencephalic and contains a large number of complexes, which are more difficult to access in macaques with ECoG, that are exposed to the brain surface.These features allow direct access to most cortical areas beneath the surface of the brain. This system provides an opportunity to investigate global cortical information processing with high resolutions at a sub-millisecond order in time and millimeter order in space.

We have developed a whole-cortical electrocorticographic array for the common marmoset that continuously covers almost the entire lateral surface of cortex, from the occipital pole to the temporal and frontal poles. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain.

一般的なセットの全皮質のシェットランドシープドッグ配列の慢性注入

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...

Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study of neuroscience as cellular function is determined by the composition and activity of cellular proteins. In this article, we describe how immunocytochemistry can be combined with near-infrared high-resolution scanning to provide a semi-quantitative measure of protein expression in distinct brain regions. This technique can be used for single or double protein expression in the same brain region. Measuring proteins in this fashion can be used to obtain a relative change in protein expression with an experimental manipulation, molecular signature of learning and memory, activity in molecular pathways, and neural activity in multiple brain regions. Using the correct proteins and statistical analysis, functional connectivity among brain regions can be determined as well. Given the ease of implementing immunocytochemistry in a laboratory, using immunocytochemistry with near-infrared high-resolution scanning can expand the ability of the neuroscientist to examine neurobiological processes at a systems level.

Here, we present a protocol that uses near-infrared dyes in conjunction with immunohistochemistry and high-resolution scanning to assay proteins in brain regions.

げっ歯類の脳におけるタンパク質発現を測定するために近赤外蛍光と高解像度走査を用いること

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study ...

Delivery of Antibodies into the Brain Using Focused Scanning Ultrasound

Only a small fraction of therapeutic antibodies targeting brain diseases are taken up by the brain. Focused ultrasound offers a possibility to increase uptake of antibodies and engagement through transient opening of the blood-brain barrier (BBB). In our laboratory, we are developing therapeutic approaches for neurodegenerative diseases in which an antibody in various formats is delivered across the BBB using microbubbles, concomitant with focused ultrasound application through the skull targeting multiple spots, an approach we refer to as scanning ultrasound (SUS). The mechanical effects of microbubbles and ultrasound on blood vessels increases paracellular transport across the BBB by transiently separating tight junctions and enhances vesicle- mediated transcytosis, allowing antibodies and therapeutic agents to effectively cross. Moreover, ultrasound also facilitates the uptake of antibodies from the interstitial brain into brain cells such as neurons where the antibody distributes throughout the cell body and even into neuritic processes. In our studies, fluorescently labeled antibodies are prepared, mixed with in-house prepared lipid-based microbubbles and injected into mice immediately before SUS is applied to the brain. The increased antibody concentration in the brain is then quantified. To account for alterations in normal brain homeostasis, microglial phagocytosis can be used as a cellular marker. The generated data suggest that ultrasound delivery of antibodies is an attractive approach to treat neurodegenerative diseases.

Presented here is a protocol to transiently open the blood-brain barrier (BBB) either focally or throughout a mouse brain to deliver fluorescently-labeled antibodies and activate microglia. Also presented is a method to detect the delivery of antibodies and microglia activation by histology.

集束走査超音波を用いた脳への抗体の送達

Only a small fraction of therapeutic antibodies targeting brain diseases are taken up by the brain. Focused ultrasound offers a possibility to increase ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) for the Study of Dendritic Spines

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In addition, some features of dendritic spines, such as volume of the spine and post-synaptic density (PSD) (representing post-synaptic part of the synapse), presence of presynaptic terminal, and smooth endoplasmic reticulum or atypical form of PSD (e.g., multi-innervated spines), can be observed only with 3D EM. By employing serial block-face scanning electron microscopy (SBEM) it is possible to obtain 3D EM data easier and in a more reproducible manner than when performing traditional serial sectioning. Here we show how to prepare mouse hippocampal samples for SBEM analysis and how this protocol can be combined with immunofluorescence study of dendritic spines. Mild fixation perfusion allows us to perform immunofluorescence studies with light microscopy on one half of the brain, while the other half was prepared for SBEM. This approach reduces the number of animals to be used for the study.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBEM for the Study of Dendritic Spines

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) is applied to image and analyze dendritic spines in the murine hippocampus.

樹状脊椎研究のためのシリアルブロック顔走査電子顕微鏡(SBEM)

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In ...

シリアルブロック・フェイス走査型電子顕微鏡を用いて脳ミトコンドリアの解析

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