LightBoxソフトウェアを開き、画像取得を行います。レーザーセットとフィルターセットを選択するには、染色に使用する色素を色素リストから選択して、オレンジ色素のパラメーターを使用します。概要を使用して、ライブをクリックしてセルに焦点を合わせます。
ステッド取得の場合は、励起レーザーを15〜20%に、定常空乏レーザーを20〜25%に設定し、10ラインアキュムレーションを行います。ピクセル滞留時間は 4 マイクロ秒、ピクセル サイズは 20 から 25 ナノメートルです。タイムラプスを実行するには、時間ドロップダウンメニューを選択し、反復回数を5回、時間間隔を25秒または30秒に設定します。
Zスタックは、ボリュームオプションを使用し、希望のZボリューム範囲とステップサイズを調整することで取得できます。ステッド・イメージ・デコンボリューション・ソフトウェアを開き、ソフトウェア・アルゴリズムを使用して生のステッド・イメージをデコンボリューションします。微視的パラメータが正しいことを確認した後、エクスプレスボタンを選択し、デコンボリューションパワーの程度が異なる場合、デコンボリューションタイプを速すぎる、標準、アグレッシブ、または控えめに設定します。
デコンボリューションを実行します。画像をICS2形式で保存します。画像Jで、ファイルをクリックしてから開き、デコンボリューションソフトウェアからICS2ファイルを開きます。
プラグインを選択し、セグメンテーション、トレーニング可能な Weka セグメンテーションの順に選択して、トレーニング可能な Weka セグメンテーション プラグインでデコンボリューションされたステッド イメージを開きます。セグメンテーション設定で、ガウスぼかし、膜投影、ソーベルフィルター機能を選択します。1 つのクラスを cristae としてラベル付けし、もう 1 つのクラスを background としてラベル付けします。
次に、いずれかのクラスに割り当てる構造体の上に線を引きます。次に、右側にある追加ボタンを選択して、クリステまたは背景のいずれかを選択します。次に、左側の [分類子のトレーニング] ボタンを選択して、プラグインに提供された情報に基づいてマップを生成します。
[分類子の保存] ボタンをクリックして、今後のセグメンテーションのために分類子の設定を保存します。クリステ確率マップを使用して、イメージ J のイメージのしきい値を設定してバイナリ マスクを生成し、解析、パーティクルの解析の順に進みます。最後に、多点線を描き、線の太さを数ピクセル幅に調整し、ミトコンドリアに合うように線をスプラインします。
本研究では、レチノイン酸分化SH-SY5Y細胞の未分化細胞におけるミトコンドリアのイメージングを、図のようにタイムラプスイメージングで行いました。デコンボリューションされたステッド画像は、特定の領域におけるクリステの周期性と、クリステのサイズと形状の測定値を決定するために使用できます。
