この方法は、軟骨再生に使用できるネイティブ組織に由来する足場を作成する方法を提示する。この技術の主な利点は、ネイティブ軟骨の成分が、インビトロおよびインビボで軟骨形成および再生を促進することができる足場に保存される点である。これらの方法は馬の息苦しい関節からの軟骨を使用するが、他のどの関節からの軟骨も同様に使用することができる。
まず、軟骨分離のための無傷のキャダビリック関節を取得し、付随するテキストプロトコルに記載されているように、皮膚過剰な脂肪および筋肉組織を除去する。次に、関節の延長変曲を行って関節が明瞭な位置を定義します。関節腔に到達するために水平切開を行います。
次に、関節領域を開くために垂直切開を行います。関節腔は、正しい切開を行う場合に空洞から滴り落ちる可能性が高い滑液で満たされています。過度の脂肪、筋肉、腱を取り除き、関節を一緒に保つ腱を切断することによって、関節を完全に開き続けます。
軟骨に大きな損傷がないか慎重に検査してください。関節軟骨が光沢のある滑らかな外観を持っていない場合、または証拠、水疱、裂け目または欠陥が存在する場合は、軟骨を捨てて、再び開始します。骨から軟骨を除去するために無菌メスを使用してください。
深いゾーン軟骨を取り除くために軟骨下骨まで切り下ろします。取り出した軟骨スライスを、以前に調製した軟骨洗浄液を含む50ミリリットルのチューブに回収します。加工中、軟骨の洗浄液を軟骨に滴下し、軟骨が乾燥するのを防ぎます。
関心のあるすべての領域から軟骨を収集した後、5分間液体窒素で軟骨スライスを凍結スナップします。その後、軟骨スライスを50ミリリットルのチューブに移し、凍結したスライスを凍結乾燥機に入れます。凍結乾燥機で軟骨スライスを24時間凍結乾燥します。
終了したら、凍結乾燥軟骨スライスを室温で乾燥した場所に保管します。手動処理の場合は、モルタルと害虫を液体窒素で予め冷やし、凍結乾燥した軟骨スライスをモルタルに入れ、それらを水没させ、液体窒素を水没させます。サンプルを直接手で約45分間粉砕し、十分に粉砕します。
あるいは、粉砕機を用いてサンプルを自動的に粉砕し、液体窒素を加えて粉砕機の粉砕室を予め冷却することから始める。その後、凍結乾燥軟骨スライスを追加し、1分間まで数秒間、そのプリセット速度でサンプルを粉砕します。すべてのパーティクルが地面であり、粉砕コンパートメントの底に粒子が残らないようにしてください。
最後に、スキャフォールドを形成する前に付随するテキストプロトコルに記載されている脱細胞化技術と共に従ってください。小さなラベルを持つ軟骨粒子を円筒形のプラスチック金型に移します。スキャフォールド内の空洞を避けるためにすべての気泡を押し出し、金型を完全に充填します。
足場の空洞を避けるために、軟骨粒子で金型を充填しながら気泡を押し出すことを確認してください。形成後、マイナス20°Cで10分間金型を凍結します。次いで、凍結乾燥機で24時間、カビ内の軟骨足場を凍結乾燥します。
凍結乾燥後、慎重にカビから足場を取り除きます。足場を365ナノメートルの波長UV光の下に置き、一晩交差させます。滅菌された足場を3ミリメートルの厚さのスライスに切断することによって足場ディスクを形成する。
その後、足場を6つのウェルプレートの別々の井戸に移します。足場の上にコンドロシット拡張培地を1ミリリットル加え、30分間水分補給します。足場が水分補給しながら、あらかじめ浸した足場の上に調製した細胞懸濁液の細胞およびピペット50マイクロリットルを調製する。
その後、スキャフォールドを摂氏37度で1時間インキュベートします。軟骨細胞を使用する場合は、分化した細胞の数を最小限に抑えるために、最初の通路を越えて拡張していないことを確認してください。1時間後、プレートを培養フードに戻し、足場を慎重にひっくり返します。
残りの50マイクロリットルの細胞懸濁液を足場にピペットし、摂氏37度でさらに1時間インキュベートする。インキュベーションの後、足場でウェルに3ミリリットルの培地を加えます。培地を足場に直接ピペット化することは避け、細胞の剥離を避けるために培養プレートを穏やかに扱ってください。
プレートをインキュベーターに戻し、培養細胞はスキャフォールドを摂氏37度で送ります。組織染色とDNA定量の組み合わせが使用され、この記事で提示された方法が十分な軟骨足場脱細胞化をもたらすことを示しています。得られた足場には、検出不可能なレベルのDNAと一緒に細胞が含まれていないことが判明した。
彼らはまた、グリコサミノグリカンを欠き、コラーゲンIIが豊富です。ここでは、4週間培養した間葉系幹細胞でセシングされた足場にネオマトリックス形成が観察されます。グリコサミノグリカンの形成は4週間後に豊富です。この手順を試みた後、任意のアプリケーションでそれを使用する前に、脱細胞化が成功したかどうかを調べることが重要です。
この手順に従って、ウエスタンブロット分析装置のような追加の生化学的分析を行い、成長因子などの他の成分の存在に関する特定の質問に答えることができます。この技術は、組織工学の分野の研究者が、同種および同系の情報源からの脱細胞化組織を用いた軟骨再生の戦略を探求する道を開いた。ラボコートや手袋を着用するなどの注意事項は必ずお受けください。
