Plunge Freezing of Electron Microscopy (EM) Grids for Cryotomography

細胞を含む電子顕微鏡グリッドをプランジ凍結する前に、倒立光学顕微鏡でグリッドを検査します。各グリッドの細胞密度を記録して、プランジ凍結中のブロッティング時間を調整します。2〜3ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水またはPBSを空のプレートで摂氏37度で温めます。

金フィデューシャルの調製には、50マイクロリットルの10ナノメートルの金コロイドビーズ溶液を清潔な1.5ミリリットルのチューブにピペットで移します。それに2マイクロリットルのウシ血清アルブミンを加え、マイクロピペッティングで繰り返しホモジナイズします。チューブを 15 、 000 〜 20 、 000 G で 15 分間遠心分離します。

マイクロピペットを使用して、ペレットを乱すことなく上清を慎重に除去します。前述のように、ペレットを50マイクロリットルのPBSに再懸濁し、チューブを再度遠心分離します。10マイクロリットルのチップを使用して4マイクロリットルのペレットを吸引し、清潔な1.5ミリリットルのチューブに移します。

恒温槽は湿度95%、摂氏30度に設定してください。5×15本のピンセットを使用してグリッドを選択し、PBSで洗浄します。洗浄したグリッドをプランジピンセットに移します。

グリッドが固定されたら、5×15ピンセットを取り外し、プランジピンセットのクランプをスライドさせます。クランプを固定したまま、グリッドをプランジフリーザーに挿入します。グリッドの裏側に1マイクロリットルの金指標を追加します。

次に、グリッドの炭素側に2〜3マイクロリットルのPBSを追加します。自動ブロッティングを利用してグリッドの裏側を吸い取り、凍結して液体エタンに沈めます。トランスフェクションされたU2OS細胞のクライオ相関光学および電子顕微鏡画像により、HIV産生細胞の存在が明らかになりました。

クライオ電子線トモグラフィー画像は、U2OS細胞の原形質膜から複数のHIV粒子が発芽していることを示しました。