新設計のシンクロトロンX線蛍光ナノプローブは、試料の元素分布の可視化を可能にする。極低温アプローチの使用は、X線放射損傷を遅くするために必須である。そのため、凍結した水和細胞を得るためには、細胞構造の保存と化学的完全性を最適化するために、迅速な凍結が不可欠です。
シンクロトロン研究のための細胞製剤の特異性は、凍結水和細胞単層を獲得するためのこのプロトコルの最適化につながります。視覚的なデモンストレーションは、細胞単層サンプルを操作して氷の薄い層に埋め込まれた再現可能な凍結細胞を達成する方法を理解するために重要です。窒化珪素膜支持剤を用意するには、膜支持剤を含むカプセルを開き、カプセルを軽く絞って支持を軽く緩めます。
薄いピンセットを使用して、フレームの中央にある窒化シリコン膜に触れないように注意してシリコンフレームの一角をつかみ、フレームを薄層フローキャビネットの中の覆われたペトリ皿に入れます。その後、UVは25〜30分間膜を殺菌する。滅菌の終わりに、ポリL-リジンなどの付着係数を10マイクロリットル加える。
摂氏37度で25分間、湿度で5%の二酸化炭素でインキュベートします。その後、滅菌48ウェルプレートのウェルに、0.22マイクロメートルの200〜250マイクロリットルの超純粋で超微量水を井戸ごとに充填します。細かいピンセットを使用して、1つの水の井戸に3つの連続した10秒のすすいで膜を垂直に慎重に水没させます。
すすった後、薄層流れフードの下に無菌96ウェルプレートの空の井戸に膜を垂直に置き、乾燥するまで一晩放置します。目的の細胞の播種のために、無菌4ウェルプレートの1つの井戸に平らな面を向けてコーティングされた膜を置きます。膜に触れることなく、適切な培養培地の4つの細胞に10回5倍の10を加え、窒化ケイ素膜の表面に添加する。
ドロップは膜全体を覆うはずです。その後、37°Cで細胞を培養し、湿度5%の二酸化炭素を培養します。細胞が基材に付着し始めると、各膜を覆う各ウェルの壁に完全な培養培地を1ミリリットルゆっくりと加える。
その後、37°Cで細胞を培養し、湿度5%の二酸化炭素を培養します。細胞製剤の凍結固定化のために、まず自動プランジ冷凍庫をオンにし、37°Cの酢酸アンモニウムバッファーで12ウェルプラスチックプレートに適切な数の井戸を充填します。膜をすすいで急落する直前に、インキュベーターからサンプルを取り出し、クイックリリースピンセットの黒いクランプリングを使用してピンセットのロックを解除します。
ロック解除されたピンセットを使用して膜支持体をつかみ、アセテートアンモニウム緩衝液内に膜を垂直に浸します。余分なバッファーを取り除くために、膜支持体の底部を濾紙に押し付け、膜が紙に触れることなく、フレームの両側を濾紙にブロットします。余分なバッファーが取り外されたら、環境室のドアを開き、ピンセットを鉗子インターロックに素早くスライドさせ、チャンバーのドアを閉めます。
ブロットを押す プランジ。窒化ケイ素膜を保持するピンセットは、すぐにクライオゲンに突入します。急落凍結後、あらかじめ冷却された鉗子で転写容器の蓋を取り外し、移圧を行います。
窒化ケイ素膜は、クライオゲンの上にわずかに移動します。素早い単一の動きで、ピンセットを鉗子インターロックから少し傾けて、ピンセットを窒素液体で満たされた移送容器のクライオボックスの空のスロットに直接持ち込みます。その後、黒いクランプリングを解放して膜を解放します。
プランジ冷凍セルの凍結乾燥の場合は、凍結乾燥器具のリアパネルにあるロッカースイッチを使用して機器の電源をオンにします。サンプルをロードする準備ができたら、ディスプレイに Enter キーが表示されます。1番目の真鍮片の上端から約1〜2ミリメートル下に液体窒素のレベルを保つポリスチレン貯蔵容器に、サプライヤーが提供するサンプル転写ホルダーの上にシリコン窒化膜真鍮ホルダーを取り付けます。
真鍮ホルダー番号付きキャビティにセルサンプル側を向けて膜を置き、液体窒素充填ポリスチレンフォームボックスに転送ロッドを事前に冷却します。ロッドを使用して完全なアセンブリにロックし、Enterキーを押して真空を破って凍結乾燥機室の蓋を解放し、すぐに凍結乾燥機室でサンプルを移し、凍結乾燥機室の蓋を閉じます。その後、すぐに凍結乾燥サイクルを続行するために開始を押します。
凍結乾燥サイクルの終わりに、停止してチャンバーを通気し、完全なアセンブリを取り除き、凍結乾燥したサンプルにアクセスします。ここで示されるようにポリL-リジン被覆された窒化ケイ素膜支持体上にサブ培養された凍結水和乳癌細胞細胞の代表的な光学ビデオ顕微鏡図が示されている。凍結水和細胞の蛍光X線元素マッピングは、カリウム、硫黄および亜鉛などの生理学的元素の分布を明らかにする。
この代表例では、密結合した硫黄元素を、カリウムについて観察されたのと同様のパターンで細胞内に均等に分布し、細胞質量プロファイルの良好な推定値を表している。しかし、亜鉛分布は、細胞質ゾルと核との間のシグナルの明確に定義された分離を伴うサイトゾルよりも高いシグナルを有する。この典型的なブライトフィールド顕微鏡では、示されているように、シリコン窒化膜上で直接培養された凍結乾燥一次マウス海馬ニューロンの顕微鏡観察において、細胞は、その培養法または保存方法の影響を受けない典型的な神経形態を示す。
プランジ冷凍細胞の蛍光X線イメージングは、これらの代表的な凍結乾燥細胞が50〜100ナノメートルの空間分解能で示す典型的な元素分布も明らかにしている。シリコン窒化物ウィンドウをプロットすることは、急落凍結後に細胞の可能な限り薄い氷層を得るために重要です。細胞内レベルで細胞の化学的完全性を維持することで、細胞のメタロメをシンクロトロンナノプローブや他の微小分析技術で探索することができます。
すべてのシンクロトロンナノプローブ分析が極低温で行われるわけではないので、凍結された水和細胞をさらに凍結乾燥させて室温で分析を容易にすることができる。液体窒素を使用する際は、適切な個人用保護具を使用し、常に炎から離れたヒュームフードでエタンガスを使用することを忘れないでください。
