まず、磁気セパレーターをスタンドに取り付けます。選択カラムを磁気分離器に接続し、選択カラムの上に70ミクロンのセルストレーナーを置きます。選択カラムの下に50ミリリットルのチューブを置き、流量を収集します。
マウスの脳細胞が80%のコンフルエントに達したら、培地を吸引し、PBSで細胞をすすぎます。0.25%トリプシンを添加して接着細胞を剥離し、摂氏37度で5分間インキュベートします。次に、停止バッファーを追加します。
細胞懸濁液を300gで5分間遠心分離し、上清を除去します。抗体染色の場合は、100マイクロリットルのPBSに7つの細胞に10個を再懸濁します。次に、10マイクロリットルのLYVE-1抗体溶液を加え、完全に混合します。
混合物を摂氏4度の暗闇で30分間インキュベートします。インキュベーション後、細胞を遠心分離し、上清を廃棄します。次に、1ミリリットルのPBSを添加し、300 gで5分間遠心分離して細胞をすすぎます。
マイクロビーズ標識の場合は、ペレットを100マイクロリットルのPBSおよび20マイクロリットルのマイクロビーズに再懸濁します。膨潤させ、摂氏4度の暗闇で30分間インキュベートします。次に、懸濁液を遠心分離し、ペレットを1ミリリットルのPBSで洗浄します。
ここでも、遠心分離機にかけ、ペレットを4ミリリットルのPBSに再懸濁し、磁気陰性を排除します。細胞懸濁液を70ミクロンのストレーナーに通し、凝集塊を取り除きます。選択カラムを3ミリリットルのPBSで洗い流して調製します。
次に、選択列にセル懸濁液を追加します。カラムを3ミリリットルのPBSで洗浄し、LYVE-1陰性細胞を50ミリリットルのチューブに集めます。磁気ポジティブセレクションの場合は、6ミリリットルのPBSを選択カラムにピペットで移します。
次に、プランジャーを選択カラムにしっかりと押し込んで磁気標識セルを洗い流し、LYVE-1陽性LLECを得ます。次に、陽性細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去します。1平方センチメートルあたり5番目の細胞を5ミリリットルの培地を入れたT25フラスコに10〜10個をプレートします。
培地の50%を隔日で交換して培養を維持します。細胞のコンフルエント度が80%に達したら、細胞継代を行う前に、前述のように細胞を剥離します。フローサイトメトリー解析により、継代2のLYVE-1陽性細胞の割合は、MACS後の継代3と有意差がなく、純度が95%を超えることが明らかになりました免疫蛍光染色により、LYVE-1とPDPN、VEGFR-3、およびPROX1との共染色が確認され、LLECの同一性が確立されました。
LYVE-1陽性細胞はF48および血小板由来成長因子ベータを発現しておらず、LLECをマクロファージおよび線維芽細胞と効果的に区別した。MACS以前の軟髄膜細胞は、丸い球体から融合した繊維形状まで、不均一な形態を示しました。しかし、MACS後のLLECは、紡錘体や丸石の形状など、典型的な内皮のような特徴を示しました。
