我々の外科的処置により、レプトメニンゲ細胞の特定の遺伝子編集は、神経発達および細菌性髄膜炎の広がりなどの多くの生理学的および病理学的状態においてその機能を研究することを可能にする。エンドキシフェンの内膜送達中の損傷を最小限に抑えるために、頭蓋骨の尾縁に対して固定できる曲げ針を利用して、組織の深部に浸透するのを防ぎます。この手順は、機能実験の喪失および利益を通じてレプトメニンゲ細胞を発現する遺伝子の役割を調査するために使用することができる。
また、脳脊髄液の流れを追跡するために採用することができます。この方法の視覚的なデモンストレーションは、内膜注射のための注射部位の同定に成功し、後頭部骨に対して針を固定する方法についての理解を確実にする。注射用の30ゲージのベブリング針でハミルトン注射器を準備することから始めます。
鉗子を使用して、針を先端から3ミリメートル30度に曲げます。次に、10%DMSOでエンドキシフェンを1ミリリットル当たり1ミリグラムの濃度に希釈し、シリンジをバックフィルする。イオフルランチャンバーで動物を麻酔します。
次に、マウスピースが手術用テーブルの表面から約30度の角度になるようにマウスヘッドホルダーを調整し、動物の頭部をホルダーに固定します。水槽マグナへのアクセス性を向上させるために、体の残りの部分と120度の角度を確立し、シスターナマグナへのアクセスを容易にするために首の後ろに拡張する頭を下に傾けたテーブルの表面から約30度に動物の体を配置します。動物が適切に配置されたら、眼科軟膏を塗布し、首の後ろを剃り、アルコール拭きとベタジンで地域を消毒します。
手術用はさみを使用して、後頭部骨のレベルから始まり、後頭部に伸びる正中線切開を行います。水槽マグナの上に硬膜を露出させる細かい先端ピンセットで中線から横に引っ張ることによって、表面的な結合組織と首の筋肉を穏やかに分離します。小さな外科用分離器を配置して、手順全体を通して水槽マグナを可視化できるようにします。
後頭部骨の尾端を特定し、以前に曲がった針をすぐ下に挿入します。硬膜が穿穿られたら、よりよい安定性を保障する動物のボディに対してシリンジを穏やかに引っ張ることによって、針の曲がった先端が表面の下に浸透することを許す。脳脊髄液の自然な流れとの干渉を避けるために、化合物をゆっくりと注入する。
注射後、針を1分間中に置き、細かい先端鉗子の助けを借りて慎重に取り除きます。シアノクリレート接着剤の数滴で皮膚を閉じ、注射部位で局所麻酔薬を塗布します。動物をホルダーから取り出し、暖房パッドのきれいなケージに入れます。
その後、意識を取り戻すまで動物を監視してください。Cx30プロモーターの下でCreERを発現するトランスジェニックマウスにおけるエンドキシフェンのインタビシカル注射は、誘導可能な蛍光レポーターであり、皮質中の表層アストロサイトおよびカレンキカルアストロサイトを発現する隣接するCx30に標識することなく、レプトメニンゲ細胞の特異的組み換えを可能にする。この注入プロトコルは脳脊髄液の生理学的動きを利用して、エンドキシフェン溶液がくも膜下腔全体に分布し、嗅球、皮質、小脳を重ねたレプトメニンゲ細胞を効率的に再結合する。
この溶液は、脳の髄膜バリアを越えたり、口腔を通じた全身投与とは対照的に、パレンチマの星状細胞と接触したりしない。インタビシターナル注射後のレプトメニンゲザル細胞の再結合は、Gfapを発現する表面および層状のアストロサイトが標識されていないままである一方でPdgfr-α反応性を通じて同定された。この実験を試みる際には、インタビシナーリナルデリバリー用の注射部位を見つけることが重要である。
この視覚的なデモンストレーションは、その下の神経組織を損傷するリスクを最小限に抑えながら、手順を実行するための技術的なノウハウを提供します。この技術を用いて遺伝子切り替え研究を行い、コルチコ形成におけるレプトメニンゲ細胞の役割と脳脊髄液形成の調節を調べ、くも膜下腔内の細菌を広げるための追加部位を同定することができる。
