リンバルニッチ細胞(LNC)の単離を行い、超クリーンな作業台で無菌状態で作業します。中期角膜記憶培地から辺縁組織を回収します。滅菌手術用の丸い刃を使用して、角膜の周りの虹彩と内皮をこすり落として取り除きます。
次に、滅菌手術用の丸い刃で、辺縁部組織を12等分に切断し、角膜と強膜の両側に1ミリメートルの組織だけを残します。その後、12個の輪部組織片を35ミリメートルの培養プレートに移し、1ミリリットルのコラゲナーゼAを加えて組織をプレートに完全に浸します。培養プレートを摂氏37度の細胞インキュベーターで18時間インキュベートして組織を消化します。
マトリゲルまたは基底膜マトリックスを摂氏4度に設定した冷蔵庫で融解します。200マイクロリットルと1ミリリットルのチップ、15ミリリットルの遠心チューブ、6ウェルプレートを含む滅菌バッグを準備し、バッグをマイナス20度またはマイナス80度で20分間置きます。チラーからチップ、遠心分離管、および6ウェルプレートを取り出したら、超クリーンな作業台で次のステップを実行します。
あらかじめ冷やした200マイクロリットルのチップを使用して、50マイクロリットルの融解した基底膜マトリックスを1ミリリットルのMESCMにピペットで移し、静かに混合します。ピペットに取り付けた予冷した1ミリリットルのチップを使用して、得られた5%塩基膜マトリックスを、事前に冷却した6ウェル培養プレートの1つのウェルに移します。6ウェルプレートを水平に静かに振とうしてから、摂氏37度のインキュベーターに約1時間入れて、5%マトリゲルコーティング培養プレートを調製します。
18時間の消化後、コラゲナーゼA消化された辺縁組織を回収し、そのほとんどに小さな目に見える塊が含まれています。実体顕微鏡下で作業し、200マイクロリットルのピペットチップを使用して、未消化の強膜組織からクラスターを剥離します。剥離したクラスターを0.25%トリプシン-EDTAに35ミリメートルの培養プレートに浸し、プレートを15分間インキュベートします。
次に、10%ノックアウト血清を含む1ミリリットルのMESCMをプレートに加え、細胞消化を急冷します。懸濁液を1ミリリットルのピペットチップで上下に静かにピペットで移し、クラスターを個々の細胞に分解します。細胞懸濁液を15ミリリットルの遠心チューブに移し、室温で200Gで5分間遠心分離します。
細胞ペレットを乱すことなく、上清を慎重に除去し、1ミリリットルのMESCMを添加して細胞を再懸濁します。1ミリリットルのピペットチップを使用して、内容物を上下に2〜3回ピペットで固定し、ペレット全体がMESCMに再懸濁されるようにします。懸濁液から20マイクロリットルを採取し、細胞を計数します。
次に、1ミリリットルのピペットを用いて、細胞懸濁液を5%基底膜マトリックスコート6ウェルプレートに移す。MESCMを追加して、ウェル内の総容量を2.5ミリリットルにします。6ウェルプレートを水平に静かに振って、細胞が均一に分布するようにします。
細胞をイメージングした後、摂氏37度の細胞培養インキュベーターに移します。実証されたプロトコルは、角膜強膜縁組織を正常に消化し、顕微鏡下で視覚化できるクラスターを生成しました。予想通り、塊は毛虫の形に似ていました。
初代LNCはゆっくりと成長し、培養に約12日を要した。1号機から8号機までのLNCは、通過までに約3日を要したが、9号機通過後のLNCの成長速度は著しく低下した。形態学的には、LNCは紡錘形をしており、通路0では丸い。
3番以降は、大きさが均一な紡錘形をしていた。細胞倍増数(NCD)は、LNCの増殖速度を表しています。NCDと累積NCD曲線から、LNCは継代3から継代5に最も速く成長することが明らかになりました。
