この方法は、目の敵対的な環境のために挑戦している実行可能な眼結膜微生物を識別します。これは、眼マイクロバイオームが存在するかどうか、および細菌の存在が眼疾患でどのように変化するかを答えるのに役立ちます。生存可能な微生物と生存不可能な微生物の両方を識別するDNAシーケンシングとは対照的に、この方法は生存可能な微生物のみを識別し、眼部のコメンザルコミュニティを明確に理解する結果となる。
研究は、非自己免疫および自己免疫ドライアイのような眼疾患を診断することは困難であり、独特の眼細菌存在を有することを示唆している。この方法は、特徴的な微生物シグネチャを持つ眼疾患を診断するために使用することができます。スワッピングするマウスの数に合わせて綿のバッティングと爪楊枝を適切な量に詰め込み、長さ1/2センチメートルの長い綿のバッティングをつまみ、端を引っ張ってバッティングがばらばらになる直前に平らな単一の多孔質層を形成していじめます。
爪楊枝の鋭い端の1つの周りにバッティングを軽く持って、爪楊枝の先端に伸ばした部分をねじって回します。完成した目の綿棒は、先端から約1/2〜1センチメートル離れた先端の上に伸ばされた綿の非常に薄い層を持つことになります。小さなビーカーに綿棒を挿入し、綿棒の側面を下に置き、それらをカバーしてオートクレーブします。
消毒剤で作業領域をきれいにして、0.5ミリリットルの無菌脳心注入、またはBHI培地を標識された1.5ミリリットルの無菌マイクロ遠心チューブに最小限に抑えます。チューブをラックにキャップし、ラックを氷の上に置く。実験マウス、空の滅菌ケージ、室温麻酔、25ゲージ針、1ミリリットルの注射器を備えたケージを含むマウス麻酔ステーションから左から右にワークフローを設定します。
次に、氷の上に引用されたBHI、滅菌された目綿棒、潤滑点眼薬、バイオハザードコンテナ、きれいなペーパータオル、および70%イソプロパノールスプレーを含む目スワッピングステーションを準備します。最後に、常温の血液寒天プレート、10マイクロリットルピペット、10マイクロリットルの滅菌使い捨てチップ、およびバイオハザード廃棄物容器を備えためっきステーションを設置します。後ろ足パッドを絞ってマウスが正しく麻酔されていることを確認します。
動きがない場合にのみ進みます。麻酔付きマウスを扱う片手と、目の綿棒と培養を処理するもう一方の手を割り当てます。ケージからマウスを取り出し、左目を露出させた状態で側面に配置された作業面の上に置きます。
手袋をした手にイソプロパノールをスプレーし、ペーパータオルで乾かします。専用のメディアハンドリングハンドでラベル付きのBHIマイクロ遠心分離管をアンキャップし、ラックに戻します。BHIに目の綿棒の綿でコーティングされた先端を浸し、その後、余分な液体を取り除くために内側のチューブに対して2回渦巻きながら、チューブから綿棒を引き出します。
マウスハンドで、首の擦り傷でマウスをそっと握りしめる。一方、左目の内側結膜領域に対して、目の先端をスワブに置きます。眼球を軽く押し下げ、下眼瞼と眼の間の洗浄運動で綿棒を10回動かし、一定の圧力を維持する。
毛皮に触れることなく、綿棒の先端を挿入した場所に垂直にそっと取り除きます。綿棒綿を下に下に置き、BHI培地付きのラベル付きマイクロ遠心管に直接入れる。スワッピングアイに目のドロップを適用します。
必要に応じて、コントロールサンプル用の皮膚または毛皮綿棒を取得し、各綿棒の間に適切に手袋を殺菌する。終了したら、マウスをケージに戻します。綿棒を氷の上で10〜15分間放置し、手袋をした手を殺菌し、10回転のためにメディアの先端を混合しながら綿棒を取り除きます。
5回転のためにチューブの内壁に先端を旋回させることによって綿棒を引き出し、バイオハザード容器に処分します。各マウスに対してこの手順を繰り返します。37°Cで1時間静かにチューブをインキュベートしてサンプルを濃縮します。
インキュベーション中に、マウスの目の綿棒またはコントロール綿棒ごとに1つの室温TSAプレートにラベルを付け、半分に分割します。濃縮されたサンプルをインキュベーターから取り出し、氷の上に置きます。サンプルを簡単に渦を混ぜて混合し、次にサンプルの10マイクロリットルをTSAプレートにアリコートし、プレートを傾けてストリップを形成する。
これを 2 回繰り返します。プレート分割線の反対側に、それぞれ10マイクロリットルのサンプルを含む10ドットを作成します。寒天プレートの乾燥を防ぐクリーンチャンバーで、18時間、2日、4日間、摂氏37度でプレートをインキュベートします。
ストリップ内のコロニーを数えます。形態に注意し、形態学的に類似した分離物のための綿棒ごとのコロニー形成単位を計算する。ユニークな生物がストリップに捕獲されていない点を見てください。
可視化を容易にするために、真ん中と右のプレートに細菌を密にメッキしました。典型的には、目の綿棒プレートの細菌がはるかに少ない観察を受けた。時折、目の綿棒は回復可能な細菌を得ることができないことに注意してください。
C57ブラックシックスマウスからの形態学的に多様な分離株を有する代表的な眼綿棒板をここに示す。それぞれの異なる分離について、コロニーをストリップで数え、相対的な存在量を計算してプロットした。微生物学的特徴化のために、細菌は、マスターTSAプレートを生成するために、個々のマウス目綿棒プレートから選ばれた。
成長が現れたとき、微生物を特徴付けるか、または識別するために追加のテストが行われました。マスタープレートは、それぞれの分離株を拡大するのに十分な接種を提供するために使用された。分離株を同定するために、TSAプレートをストリークして一晩インキュベートし、MALDI-TOF MSを実施した。
ここに示す分離株の例は、レンサ球菌アシドミニムスおよびアエロコッカスビリダンとして同定された。男性および女性C57黒6匹のマウスから有意に異なるレベルのコメンザル生物が回収された。連鎖球菌酸菌、アエロコッカス・ビリダンスは、負のブドウ球菌および大腸菌をC57黒6Nマウスから単離した。
このプロトコルを試みるとき、綿棒を薄くコーティングし、目の綿棒のステップの間に時間を取ることによって最良の結果が達成されることを覚えておいてください。MALDI-TOF MSへのアクセスが制限されている場合、分離株は微生物学的および生化学的試験によって同定され得る。
