著者は技術的なステップを支援してくれたNandini NallappanとSharon Yeoに感謝したいと思います。この研究は、Lee Kong Chian School of Medicine、Nanyang Technological UniversityからのKGCへのスタートアップグラント、シンガポール保健省のNational Medical Research Council（NMRC）からLT（NMRC / CSA / 045/2012）およびNMRCの助成金により、KGCおよびLT（NHIC-12D-1409007）に国立衛生イノベーションセンターによって管理されている。

この研究で使用されたすべての眼球試料は、SingHealth Centralized Institutional Review BoardとSingapore Nanyang Technological University Institutional Review Boardによって承認されたシンガポール国立眼センターのドライアイクリニックから収集されました。 注：被験者は、ICを実施する前に、炎症の程度および涙の機能障害の重篤度を評価するために臨床試験を受けた。臨床試験には、非侵襲的涙液分泌時間（NI-TBUT） 14および結膜の赤み（hyperemia） 15,16が含まれ、診断装置、Schirmerの試験17 、標準的患者の眼乾燥（SPEED）質問18 、および角膜染色19 。 ICによる眼球試料の採取<ol><li>臨床状態の決定後、麻酔上眼球結膜と下眼円蓋に1〜2滴の局所麻酔薬、塩酸プロパラカインを適用することにより、参加者の眼を刺激する。麻酔薬の刺すような感覚が消えるまで4〜5分待ちます。 </li><li> 2つの印象細胞学装置を用いて、鼻および眼球結膜結膜から試料を採取する。 注記：2つのインプレッションサンプルの収集に1つのデバイスが使用されます。ここでは、4つの印象膜の収集のために2つの装置を使用した。 <ol><li>印象細胞学装置を結膜上に接線方向に配置する。プッシュボタンを静かに押し、2〜3秒間押し続けます。 注記：デバイスにはメンブレンが付属しています。ボタンを押すと自動的に圧力が解放されます。圧力を解放して装置を取り外すのに数秒しかかかりません。 </li></ol></li><li> 1mLの培養培地（ロズウェルパークメモリアルインスティチューション培地（RPMI）+ 10％ウシ胎仔血清（FBS）+ 1％ペニシリン - ストレプトマイシン（Pen Strep））をメスにより投与した。 </li><li> 10μLのピペットチップで約1分間連続掻爬することにより、デバイスの膜から細胞を分離する。 注記：膜の表面が不均一になると削り取りが完了します。各膜からの細胞数は可変である（100〜500細胞/膜）。収集の2〜3時間以内に試料を処理する。 </li></ol> 2.フローサイトメトリーによる細胞の免疫表現型解析<ol><li>培地を除去するために、室温で5分間400xgで細胞を遠心分離する。フローサイトメトリー染色バッファー（リン酸緩衝食塩水（PBS）+ 0.05％ウシ血清アルブミン（BSA））50μLで細胞ペレットを再懸濁する。 </li><li> CD4アロフィコシアニン-H7（APC-H7）（SK3）、CCR7フィコエリトリン（PE）-A、CD45RO PE-シアニン7（PE- Cy7）-A、および生存/死細胞マーカー7-ADD）を室温で20〜30分間、ダーク。製造元のプロトコールに従って、ストックから抗体を直接使用する。 注：抗体濃度は、CD3-BV510 2.5μL、CD4-APC-H7、CD45RO-PE-Cy7、7-AAD 1.25μLおよびCCR7-PE 10μLを使用してください。末梢血単核細胞（PBMC）を使用して、異なる濃度の抗体を滴定する。滴定には、メーカーのプロトコールに記載されている抗体濃度を使用し、推奨濃度の1/2を使用する。抗体の最小濃度を使用して、他の蛍光色素チャネルへのこぼれを避ける。上記の抗体濃度では、明確なシグナルが観察された。この補償は、当初、Williams et al 。試験のために、PBMCをここで使用した同じセットの抗体と共にインキュベートし、単一および複数の抗体染色を比較することによって補正した。 </li><li>インキュベーション後、ペリチューブに染色バッファー1 mLを添加し、よく混合し、450 xgで5分間室温で遠心分離する。 200μLの染色バッファーに細胞を再懸濁する。 </li><li>フローサイトメトリー機でサンプルを分析する。 <ol><li>データを取得する前に、サイトメーターセットアップおよびトラッキング（CS＆T）ビーズでフローサイトメーターチャネル電圧を較正して、メーカーの指示に従って異なる日にデータ収集を標準化します。 <ol><li>フローサイトメトリーデータ収集ソフトウェアを開き、 &quot;Set up＆QC&quot;ボタンをクリックし、正しいCS＆Tビーズロット番号を選択し、ビーズをロードして、 &quot;Start&quot;ボタンをクリックします。 </li></ol></li><li>サンプルを装置にロードする前に、チューブを静かにタップして細胞を再懸濁します。データ収集ソフトウェアを開き、[プレビュー]をクリックします。閾値率が安定したら、「取得」をクリックします。サンプルがなくなると、サンプルレベルを監視し、「停止」をクリックします。 注：1サンプルにつき10,000のイベントを取得します。 </li&gt; <li> 10,000イベントを取得した後、ワークシートにSSC-AおよびFSC-Aドットプロットを生成します。 <ol><li> 「ポリゴンゲート」ボタンをクリックし、FSC-A値&gt; 5 x 10 4のすべてのイベントにゲート（これはP1）を描き、デブリを除外します。 &quot;ドットプロットを作成&quot;ボタンをクリックして新しいドットプロットを生成し、ドットブロットを右クリックし、 &quot;プロパティ&quot;を選択して &quot;プロットエディタ&quot;ウィンドウを開き、 &quot;P1&quot;を選択します。 P1ドットプロットのx軸上のFSC-Aをクリックし、CD3-BV510に変更します。 「ポリゴンゲート」を描き、CD3 +の母集団を選択し、それを「P2」と命名します。 </li><li> &quot;ドットプロットを作成&quot;ボタンをクリックして新しいドットプロットを生成し、ドットブロットを右クリックし、 &quot;プロパティ&quot;を選択して &quot;プロットエディタ&quot;ウィンドウを開きます。 P2ドットプロットのx軸上のFSC-Aをクリックし、7-AADに変更します。 7-AAD母集団のための「ポリゴンゲート」を描き、「P3」を選択します。ここでのP3はCD3 +生きている細胞。 </li><li> &quot;ドットプロットを作成&quot;ボタンをクリックして新しいドットプロットを生成し、ドットブロットを右クリックし、 &quot;プロパティ&quot;を選択して &quot;プロットエディタ&quot;ウィンドウを開きます。 x軸のCD3-BV510をクリックし、P3ドットプロットのy軸のCD4-APCH7をクリックします。四角形の上辺と下辺にそれぞれ「P4」と「P5」を選択します。 P4は生CD3 + CD4 +であり、P5は生CD3 + CD4 - T細胞である。 </li><li> &quot;ドットプロットを作成&quot;ボタンをクリックして新しいドットプロットを生成し、ドットブロットを右クリックし、 &quot;プロパティ&quot;を選択して &quot;プロットエディタ&quot;ウィンドウを開きます。 x軸上のCD45RO PE-Cy7をクリックし、P4とP5の両方のプロットのy軸上のCCR7-PEをクリックします。このドットプロットで「クアッドゲート」を描く。 注：ここでは、左上、右上、右下、左下の四分円はナイーブな中央メモリ（T CM ）、e（T EM ）、最終分化したエフェクターメモリー（T EMRA ）T細胞である。 </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dominant+human+conjunctival+epithelial+CD8alphabeta++T+cell+population+is+maintained+with+age+but+the+number+of+CD4++T+cells+increases.">The dominant human conjunctival epithelial CD8alphabeta+ T cell population is maintained with age but the number of CD4+ T cells increases.</a> Age (Dordr). 34 (6), 1517-1528 (2012).</li><li>Mrugacz, M., Zak, J., Bakunowicz-Lazarczyk, A., Wysocka, J., Minarowska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+HLA-DR+antigen+in+conjunctival+epithelial+cells+of+patients+with+cystic+fibrosis.">Flow cytometric analysis of HLA-DR antigen in conjunctival epithelial cells of patients with cystic fibrosis.</a> Eye (Lond). 21 (8), 1062-1066 (2007).</li></ol>

著者らは、競合する金銭的利益を宣言していない。

これは、スクレイピング、拭き取り、ピペッティングまたは吸収性濾紙1,2のような従来の技術とは対照的に、比較的迅速な免疫プロファイリングのために外来診療所で使用することができる、簡単で迅速かつ侵襲性の低い技術である。この技術の変種はすでに研究セッティング22で使用されています。提案された方法論の将来の適用は、眼疾患、特に免疫表現型検査を必要とする臨床試験における患者層別化である。 この技術の主な課題は、印象採取および掻爬後に回収される比較的少ない免疫細胞である。個体当たり4回のインプレッションから回収されたCD3 + T細胞の総数は、約500〜1,000個の細胞から変動した。眼球試料をフローサイトメトリー分析の前に最小限の回数洗浄して、さらなる細胞喪失を回避したs。プロトコール内に残る重要なステップおよび課題は、より高い細胞数を達成するために、眼球サンプルの効率的な収集および膜の適切な掻爬である。それにもかかわらず、この制限は特定の免疫表現型に偏っているとは考えにくい。細胞の収率を最大にするためにここで行われたトラブルシューティングは、抗体のインキュベーションの前後の洗浄工程の数を減らすことであった。 ICの使用には他の制限があります。スティーブンジョンソン症候群のような重度の角質化または線維化した眼球表面を有する患者では、細胞収量は本研究のそれよりも少なくてもよい。免疫細胞の割合は、試料が同じ日に分析される代わりに保存される場合に変化し得る。ある種の細胞型が他の細胞型よりも貯蔵に耐性があるかどうかを予測することは困難である。以前の研究では、結膜上皮細胞におけるHLA-DR発現レベルの上昇が報告されているため、HLA-DRと特異的免疫細胞のレベルとの間の相関を評価するために評価した。免疫細胞はまた、ケモカインの発現レベルと関連し得る。これらの問題は今後の研究で取り上げられるべきである。

印象細胞学（IC）は1977年にThatcher et al 。彼らは、スクラップ、拭き取り、またはピペッティングなど、その時に利用可能な他の技術の代わりに、患者から結膜細胞を収集するためにプラスチック印象ディスクを使用した1 。 ICの現在の技術は、吸収性濾紙2を用いて球膜および眼瞼結膜を刻印し、結膜細胞の最も表面の層を集める。分化の最終段階に達したこれらの細胞は、連続して涙を流す3 。上皮細胞4 、杯細胞3,5 、および粘膜関連リンパ組織（上皮関連エフェクターT細胞または樹状細胞6）の 3つの主要な細胞集団がIC標本に見出される。 ICSAMにおける眼球表面細胞プレートは、顕微鏡検査、免疫ブロッティングおよび逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR） 7によって分析することができる。最近、ICメンブレン8を擦って集めた免疫細胞の解析にフローサイトメトリーが使用されています。興味深いことに、IC 6,9は、乾性角結膜炎、ビタミンA欠乏症、瘢痕性食細胞性アポトーシス、アトピー性疾患、上肢角結膜炎、春季角結膜炎および上皮性扁平上皮化生を含む多くの眼表面疾患の評価に使用されている。 ICはまた、コンタクトレンズの装着、眼球表面の微生物の検出、および縦走試験10,11,12における治療的介入の治療有効性および耐性の試験の影響を評価するために使用されている。 医療機器（EyePrim）は、ポリフローサイトメトリー（OSIC-フロー）による眼の印象細胞学の技術について以前に検証されており、縦走サンプリングを使用して疾患の進行および処置に対する応答（ 例えば 、詳細粘膜膜類天疱瘡における進行性結膜線維症の推定上の疾患マーカーとして定義される上皮内白血球の分析） 13 。初期の研究者は、手動印象を必要とするオートクレーブされたPESフィルターを使用した。その結果、利回りは変動し、ユーザーに依存していました。この医療用具の利点は、使いやすさ、標準化圧力（PaまたはN / m 2 ）であり、再現性、再現性および一貫した細胞回復を可能にする。この技術は外科手術ではなく、容易に実施でき、迅速であるため、外来診療所で有用である。これは、指令93/42 / CEE、CE 0499（SNCH）に従ったクラスI（無菌）医療機器です。必要なのは眼球表面の完全性の維持を確実にする処置中の局所麻酔である。 ICに続いて、細胞をフローサイトメトリーのために直ちに処理することができる。さらに、非眼科技術者および看護師が眼表面をサンプリングするように訓練されることが可能である。 他の技術に対するICの改善にもかかわらず、いくつかの課題が残っている。例えば、ICの位置に応じて、サンプリング領域および眼球結膜における地域差に起因する変動が存在し得る。変動の別の原因は、IC中に異なる量の圧力を印加することによるものである。その他の方法論的問題には、細胞処理の標準化が含まれる：これらには、持続期間および固定方法、およびサンプリングされた材料の安定性に影響を与える可能性のある貯蔵条件が含まれる。 この技術の全体的な目標は、眼の印象サンプルの分離方法を開発することである。tは使いやすく、非侵襲性であり、臨床サンプルの免疫学的特徴付けに適用することができる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="940">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Reagents</td>
			<td style="width:300px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">anti-human CD3 BV510</td>
			<td style="width:300px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right">563109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">anti-human CD4 APCH7</td>
			<td style="width:300px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right">641398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">anti-human CD45RO PECy7</td>
			<td style="width:300px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right">337168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">7-AAD solution</td>
			<td style="width:300px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right">555816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">anti-human CCR7 PE</td>
			<td style="width:300px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right">552176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Pippetes</td>
			<td style="width:300px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:143px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Local Anaesthesia</td>
			<td style="width:300px;">Alcaine</td>
			<td style="width:143px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Fluorescein sodium solution</td>
			<td style="width:300px;">Bausch &#38; Lomb U.K Limited</td>
			<td style="width:143px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:331px;">Name</td>
			<td style="width:300px;">Company</td>
			<td style="width:143px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Equipments</td>
			<td style="width:300px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Keratograph 5M</td>
			<td>Oculus</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Slit lamp BioMicroscope</td>
			<td>Haag Streit</td>
			<td>BM900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:331px;">EyePrim</td>
			<td>Opia Technologies</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">FACS Verse</td>
			<td style="width:300px;">BD BioSciences</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:331px;">Name</td>
			<td style="width:300px;">Company</td>
			<td style="width:143px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Softwares</td>
			<td style="width:300px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">GraphPad 6.0</td>
			<td style="width:300px;">Prism</td>
			<td style="width:143px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">FACSVerse analysis software</td>
			<td style="width:300px;">BD</td>
			<td style="width:143px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a non-invasive way to isolate and phenotype cells from the conjunctiva

伝統的に、眼表面細胞学は、スパチュラ技術およびブラシ技術などの技術を用いて研究されている。これらの技術の問題点は、眼の表面に外傷性の病変を誘発し、瘢痕化、眼瞼変形、角膜幹細胞欠損症に進行し、場合によっては被験者に大きな不快感を引き起こす可能性があることである。これらの臨床上の問題を回避するために、乾性眼疾患およびその後の新形成、アトピー性疾患、春季角結膜炎および乾性角結膜炎を診断するための印象細胞学（IC）が開発された。典型的には、臨床医は手動で濾紙を必要な形状に切断し、これらを眼の表面に適用する。ここでは、市販の医療機器を使用してICを実行する方法について説明します。この技術は、フローサイトメトリーによる免疫表現型解析の後に続いて説明される。この技法は、手作業の取り扱いが少なくて済み、眼表面の損傷をより少なくする。

この臨床装置によるICにより、眼表面を損なわずに眼球表面免疫細胞を単離することができた。 図1は、ICの実行方法を示しています。サンプルが収集された眼の異なる部位がマークされる。 図2は、10人の健常対照から収集したフローサイトメトリーの代表的な結果を示す。ゲーティングには、生細胞と死細胞を区別するためにSSCと7-AADを使用します。 7-AAD -細胞は生細胞として同定される。これらの生細胞は、CD3 +およびCD4 +マーカーによってさらに特徴付けられる。さらに、CD4 +およびCD4 -集団は、それぞれ、CCR7およびCD45ROマーカーを有するNaive、T EM 、T CMおよびT EMRAとしてさらに特徴付けられた。 CD3 + T細胞の中では、エフェクターメモリーT細胞がヒトの眼の表面で優勢である。以前のeではまた、CD8 +記憶細胞は、健常個体20の結膜上皮T細胞の主要な集団であることも示されている20 。 図3は、研究された10人の健常対照において、CD4 +およびCD8 +エフェクターメモリーT細胞（T EMおよびT EMRA ）がヒト眼表面の主要なサブセットであることを示す。図に記載された各集団は、マーカー表現型および名前（Naive、T CM 、T EM 、T EMRA ）で通知される 。赤い数字は人口の割合を示します。この図のデータは、平均±SEM <img alt="図1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55591/55591fig1.jpg" /> 図1：インプレッションサイトロジーデバイスによる眼球表面からのICサンプルの収集。側球から試料を採取したar領域を含む。 <img alt="図2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55591/55591fig2.jpg" /> 図2：フローサイトメトリーを用いたドットプロットグラフ。ライブ7-AAD -細胞を選択した。 CD3 +細胞を最初にゲーティングし、次いでこの集団をCD4 +およびCD4 -サブセットにゲートした。ナイーブ（CCR7 + CD45RO - ）、中央記憶（CCR7 + CD45RO + ）およびエフェクター記憶（CCR7 - CD45RO + ; CCR7 - CD45RO - ）サブセットの割合は、CCR7およびCD45ROマーカーの助けを借りて決定された。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55591/55591fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55591/55591fig3.jpg" /> F図3：健康なヒト眼球表面のCD4 +およびCD8 + T細胞における免疫細胞サブタイプ。健康なヒトコントロールにおける結膜のCD4 +およびCD8 +ナイーブ、セントラルメモリー（T CM ）、およびエフェクターメモリー（T EMおよびT EMRA ）サブセットの分布 ;各データ点は、別個の平均±SEMを示す。母集団の割合は、各母集団の名前の下に赤色で表示されます。 CD4 + T EMRA集団は、前述の散布図に含まれていないため（Bose ら 21から改変されている）、集団の総百分率は98％である。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55591/55591fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>

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A Non-invasive Way to Isolate and Phenotype Cells from the Conjunctiva

露出した正常眼球表面は、角膜および結膜からなる。上皮細胞、杯細胞および免疫細胞が結膜内に存在する。ここでは、非侵襲的な印象細胞学の技術が印象細胞学装置とフローサイトメトリーを用いて結膜内の免疫細胞を分析することが記載されている。

結膜から細胞を単離して表現する非侵襲的方法

Traditionally, ocular surface cytology is studied with techniques such as spatula technology and brush technology. The problem with these techniques is ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.2K ビュー.  Nanyang Technological University. 露出した正常眼球表面は、角膜および結膜からなる。上皮細胞、杯細胞および免疫細胞が結膜内に存在する。ここでは、非侵襲的な印象細胞学の技術が印象細胞学装置とフローサイトメトリーを用いて結膜内の免疫細胞を分析することが記載されている。 

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Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

白血球ホーミングと移行の非侵襲的イメージング in vivoで</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

免疫・感染学

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although the isolation methods of liver macrophages have been well-described4-6, most of these methods require sophisticated equipment, such as a centrifugal elutriator and technical skills. Here, we provide a novel method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity from mixed primary cultures of adult rat liver cells, as schematically illustrated in Figure 1.
After dissociation of the liver cells by two-step perfusion method7,8,a fraction mostly composed of parenchymal hepatocytes is prepared and seeded into T75 tissue culture flasks with culture medium composed of DMEM and 10% FCS.Parenchymal hepatocytes lose the epithelial cell morphology within a few days in culture, degenerate or transform into fibroblast-like cells (Figure 2). As the culture proceeds, around day 6, phase contrast-bright, round macrophage-like cells start to proliferate on the fibroblastic cell sheet (Figure 2). The growth of the macrophage-like cells continue and reach to maximum levels around day 12, covering the cell sheet on the flask surface. By shaking of the culture flasks, macrophages are readily suspended into the culture medium. Subsequent transfer and short incubation in plastic dishes result in selective adhesion of macrophages(Figure 3), where as other contaminating cells remain suspended. After several rinses with PBS, attached macrophages are harvested. More than 106 cells can be harvested repeatedly from the same T75 tissue culture flask at two to three day intervals for more than two weeks(Figure 3).The purities of the isolated macrophages were 95 to 99%, as evaluated by flow cytometry or immunocytochemistry with rat macrophage-specific antibodies (Figure 4).The isolated cells show active phagocytosis of polystylene beads (Figure 5), proliferative response to recombinant GM-CSF, secretion of inflammatory/anti-inflammatory cytokines upon stimulation with LPS, and formation of multinucleated giant cells9.
In conclusion, we provide a simple and efficient method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity without complex equipment and skills.This method might be applicable to other mammalian species.

A novel method to obtain macrophages from primary culture of rat liver cells is described. This method utilizes the proliferation of macrophages in the culture, followed by shaking of culture flasks and purification by selective attachment to plastic dishes. This technique efficiently provides liver macrophages without complex equipment and skills.

成人肝細胞の混合初代培養からマクロファージを分離するためにシンプルかつ効率的な方法

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth defects upon congenital infection. The lytic replication cycle is characterized by three stages: 1. active invasion of a nucleated host cell; 2. replication inside the host cell; 3. active egress from the host cell. The mechanism of egress is increasingly being appreciated as a unique, highly regulated process, which is still poorly understood at the molecular level. The signaling pathways underlying egress have been characterized through the use of pharmacological agents acting on different aspects of the pathways1-5. As such, several independent triggers of egress have been identified which all converge on the release of intracellular Ca2+, a signal that is also critical for host cell invasion6-8. This insight informed a candidate gene approach which led to the identification of plant like calcium dependent protein kinase (CDPK) involved in egress9. In addition, several recent breakthroughs in understanding egress have been made using (chemical) genetic approaches10-12. To combine the wealth of pharmacological information with the increasing genetic accessibility of Toxoplasma we recently established a screen permitting the enrichment for parasite mutants with a defect in host cell egress13. Although chemical mutagenesis using N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) or ethyl methanesulfonate (EMS) has been used for decades in the study of Toxoplasma biology11,14,15, only recently has genetic mapping of mutations underlying the phenotypes become routine16-18. Furthermore, by generating temperature-sensitive mutants, essential processes can be dissected and the underlying genes directly identified. These mutants behave as wild-type under the permissive temperature (35 &deg;C), but fail to proliferate at the restrictive temperature (40 &deg;C) as a result of the mutation in question. Here we illustrate a new phenotypic screening method to isolate mutants with a temperature-sensitive egress phenotype13. The challenge for egress screens is to separate egressed from non-egressed parasites, which is complicated by fast re-invasion and general stickiness of the parasites to host cells. A previously established egress screen was based on a cumbersome series of biotinylation steps to separate intracellular from extracellular parasites11. This method also did not generate conditional mutants resulting in weak phenotypes. The method described here overcomes the strong attachment of egressing parasites by including a glycan competitor, dextran sulfate (DS), that prevents parasites from sticking to the host cell19. Moreover, extracellular parasites are specifically killed off by pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), which leaves intracellular parasites unharmed20. Therefore, with a new phenotypic screen to specifically isolate parasite mutants with defects in induced egress, the power of genetics can now be fully deployed to unravel the molecular mechanisms underlying host cell egress.

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Forward genetics is a powerful method to unravel the molecular level of how Toxoplasma egresses from its host cell. Protocols are provided to chemically mutagenize parasites, enrich for mutants with defects in induced egress, and validate the phenotype of cloned mutants.

分離するために遺伝学的スクリーニングトキソプラズマホストセル出口変異体

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 to 40% attributable mortality6. Systemic candidiasis is normally controlled by innate immunity, and individuals with genetic defects in innate immune cell components such as phagocyte NADPH oxidase are more susceptible to candidemia7-9. Very little is known about the dynamics of C. albicans interaction with innate immune cells in vivo. Extensive in vitro studies have established that outside of the host C. albicans germinates inside of macrophages, and is quickly destroyed by neutrophils10-14. In vitro studies, though useful, cannot recapitulate the complex in vivo environment, which includes time-dependent dynamics of cytokine levels, extracellular matrix attachments, and intercellular contacts10, 15-18. To probe the contribution of these factors in host-pathogen interaction, it is critical to find a model organism to visualize these aspects of infection non-invasively in a live intact host. 
The zebrafish larva offers a unique and versatile vertebrate host for the study of infection. For the first 30 days of development zebrafish larvae have only innate immune defenses2, 19-21, simplifying the study of diseases such as disseminated candidiasis that are highly dependent on innate immunity. The small size and transparency of zebrafish larvae enable imaging of infection dynamics at the cellular level for both host and pathogen. Transgenic larvae with fluorescing innate immune cells can be used to identify specific cells types involved in infection22-24. Modified anti-sense oligonucleotides (Morpholinos) can be used to knock down various immune components such as phagocyte NADPH oxidase and study the changes in response to fungal infection5. In addition to the ethical and practical advantages of using a small lower vertebrate, the zebrafish larvae offers the unique possibility to image the pitched battle between pathogen and host both intravitally and in color. 
The zebrafish has been used to model infection for a number of human pathogenic bacteria, and has been instrumental in major advances in our understanding of mycobacterial infection3, 25. However, only recently have much larger pathogens such as fungi been used to infect larva5, 23, 26, and to date there has not been a detailed visual description of the infection methodology. Here we present our techniques for hindbrain ventricle microinjection of prim25 zebrafish, including our modifications to previous protocols. Our findings using the larval zebrafish model for fungal infection diverge from in vitro studies and reinforce the need to examine the host-pathogen interaction in the complex environment of the host rather than the simplified system of the Petri dish5.

The rapid development, small size and transparency of zebrafish are tremendous advantages for the study of innate immune control of infection1-4. Here we demonstrate techniques for infecting zebrafish larvae using the fungal pathogen Candida albicans by microinjection, methodology recently used to implicate phagocyte NADPH oxidase activity in control of fungal dimorphism5.

ゼブラフィッシュ幼生における播種性カンジダ症の非侵襲的イメージング

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 ...

Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse

The lymphatic vascular system is an important component of the circulatory system that maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and mediates fat absorption in the gut. Yet despite its critical function, there is comparatively little understanding of how the lymphatic system adapts to serve these functions in health and disease1. Recently, we have demonstrated the ability to dynamically image lymphatic architecture and lymph "pumping" action in normal human subjects as well as in persons suffering lymphatic dysfunction using trace administration of a near-infrared fluorescent (NIRF) dye and a custom, Gen III-intensified imaging system2-4. NIRF imaging showed dramatic changes in lymphatic architecture and function with human disease. It remains unclear how these changes occur and new animal models are being developed to elucidate their genetic and molecular basis. In this protocol, we present NIRF lymphatic, small animal imaging5,6 using indocyanine green (ICG), a dye that has been used for 50 years in humans7, and a NIRF dye-labeled cyclic albumin binding domain (cABD-IRDye800) peptide that preferentially binds mouse and human albumin8. Approximately 5.5 times brighter than ICG, cABD-IRDye800 has a similar lymphatic clearance profile and can be injected in smaller doses than ICG to achieve sufficient NIRF signals for imaging8. Because both cABD-IRDye800 and ICG bind to albumin in the interstitial space8, they both may depict active protein transport into and within the lymphatics. Intradermal (ID) injections (5-50 &mu;l) of ICG (645 &mu;M) or cABD-IRDye800 (200 &mu;M) in saline are administered to the dorsal aspect of each hind paw and/or the left and right side of the base of the tail of an isoflurane-anesthetized mouse. The resulting dye concentration in the animal is 83-1,250 &mu;g/kg for ICG or 113-1,700 &mu;g/kg for cABD-IRDye800. Immediately following injections, functional lymphatic imaging is conducted for up to 1 hr using a customized, small animal NIRF imaging system. Whole animal spatial resolution can depict fluorescent lymphatic vessels of 100 microns or less, and images of structures up to 3 cm in depth can be acquired9. Images are acquired using V++ software and analyzed using ImageJ or MATLAB software. During analysis, consecutive regions of interest (ROIs) encompassing the entire vessel diameter are drawn along a given lymph vessel. The dimensions for each ROI are kept constant for a given vessel and NIRF intensity is measured for each ROI to quantitatively assess "packets" of lymph moving through vessels.

Recently developed imaging techniques using near-infrared fluorescence (NIRF) may help elucidate the role the lymphatic system plays in cancer metastasis, immune response, wound repair, and other lymphatic-associated diseases.

マウスのリンパ脈管構造の非侵襲的光イメージング

The lymphatic  vascular system is an important component of the circulatory system that  maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying Salmonella-host interactions are&#160;important to elucidate the molecular pathogenesis of Salmonella infection. The Gentamicin protection assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in phagocytic cells was adapted to allow high-throughput screening to define the roles of deletion mutants of Salmonella enterica serotype Typhimurium in host interactions using RAW 264.7 murine macrophages. Under this protocol, the variance in measurements is significantly reduced compared to the standard protocol, because wild-type and multiple mutant strains can be tested in the same culture dish and at the same time. The use of multichannel pipettes increases the throughput and enhances precision. Furthermore, concerns related to using less host cells per well in 96-well culture dish were addressed. Here, the protocol of the modified in vitro Salmonella invasion assay using phagocytic cells was successfully employed to phenotype 38 individual Salmonella deletion mutants for association, invasion and intracellular replication. The in vitro phenotypes are presented, some of which were subsequently confirmed to have in vivo phenotypes in an animal model. Thus, the modified, standardized assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in macrophages with high-throughput capacity could be utilized more broadly to study bacterial-host interactions.

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

A high-throughput assay to in vitro phenotype Salmonella or other bacterial association, invasion, and replication in phagocytic cells with high-throughput capacity was developed. The method was employed to evaluate Salmonella gene knockout mutant strains for their involvements in host-pathogen interactions.

表現型のハイスループットアッセイ<em&gt;サルモネラ菌</em&gt;ネズミチフス菌協会、侵略、およびマクロファージにおける複製

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal features of the natural infection. This protocol describes procedures for the establishment and evaluation of systemic infection due to neuropathogenic Escherichia coli K1 in the neonatal rat. Colonization of the gastrointestinal tract leads to dissemination of the pathogen along the gut-lymph-blood-brain course of infection and the model displays strong age dependency. A strain of E. coli O18:K1 with enhanced virulence for the neonatal rat produces exceptionally high rates of colonization, translocation to the blood compartment and invasion of the meninges following transit through the choroid plexus. As in the human host, penetration of the central nervous system is accompanied by local inflammation and an invariably lethal outcome. The model is of proven utility for studies of the mechanism of pathogenesis, for evaluation of therapeutic interventions and for assessment of bacterial virulence.

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Here, a procedure is described for the establishment of systemic infection in the neonatal rat with cultures of Escherichia coli K1. This non-invasive procedure permits colonization of the gastrointestinal tract, translocation of the pathogen to the systemic circulation, and invasion of the central nervous system at the choroid plexus.

神経病原の非侵襲的モデル<em&gt;エシェリヒア·コリ</em&gt;新生ラットにおける感染

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

Complete Thymectomy in Adult Rats with Non-invasive Endotracheal Intubation

Thymectomy in neonatal rodents is an established and reliable procedure for immunological studies. However, in adult rats, complications of hemorrhage and pneumothorax from pleural disruption can result in a significant mortality rate. This protocol is a simple method of rat thymectomy that utilizes a mini-sternotomy and endotracheal intubation. Intubation is accomplished with a non-invasive and easily reproducible method and allows for positive pressure ventilation to prevent pneumothorax and a controlled airway that allows sufficient time for careful thymus dissection to minimize pleural disruption. A 1.5 cm sternal incision decreases contact with mediastinal vessels and pleura, while still providing full visualization of the thymus. Following exposure of the mediastinum, the thymus is removed by blunt dissection under magnification. The pleural space is then sealed by suture closure of the pre-tracheal muscles followed by the application of surgical glue. The thorax is then closed by suture closure of the sternum, followed by suture closure of the skin. All thymectomies were complete as evidenced by immunohistochemical (IHC) staining of mediastinal tissue, and absence of na&#239;ve T-cells by flow cytometry, and the procedure had a 96% survival rate. This method is suitable when complete thymectomy with minimal complications is desired for further immunological studies in athymic adult rats.

Rodent thymectomy is a valuable technique in immunological research. Here, a protocol for complete thymectomy in adult rats using a mini-sternotomy along with non-invasive intubation and positive pressure ventilation to minimize perioperative morbidity and mortality is described.

非侵襲的気管挿管と成体ラットにおける完全な胸腺摘出

Thymectomy in neonatal rodents is an established and reliable procedure for immunological studies. However, in adult rats, complications of hemorrhage and ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of causing systemic disease in both fish and humans. A better understanding of S. iniae disease pathogenesis requires an appropriate model system. The genetic tractability and the optical transparency of the early developmental stages of zebrafish allow for the generation and non-invasive imaging of transgenic lines with fluorescently tagged immune cells. The adaptive immune system is not fully functional until several weeks post fertilization, but zebrafish larvae have a conserved vertebrate innate immune system with both neutrophils and macrophages. Thus, the generation of a larval infection model allows the study of the specific contribution of innate immunity in controlling S. iniae infection.
The site of microinjection will determine whether an infection is systemic or initially localized. Here, we present our protocols for otic vesicle injection of zebrafish aged 2-3 days post fertilization as well as our techniques for fluorescent confocal imaging of infection. A localized infection site allows observation of initial microbe invasion, recruitment of host cells and dissemination of infection. Our findings using the zebrafish larval model of S. iniae infection indicate that zebrafish can be used to examine the differing contributions of host neutrophils and macrophages in localized bacterial infections. In addition, we describe how photolabeling of immune cells can be used to track individual host cell fate during the course of infection.

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

のゼブラフィッシュ幼生モデルにおける先天性免疫応答の非侵襲的イメージング<em&gt;ストレプトコッカスイニエ</em&gt;感染

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging task, since mammalian RNA mostly dominates the lysates of infected cells. Here we describe an optimized method for RNA isolation of Listeria monocytogenes bacteria growing within bone marrow derived macrophage cells. Upon infection, cells are mildly lysed and rapidly filtered to discard most of the host proteins and RNA, while retaining intact bacteria. Next, bacterial RNA is isolated using hot phenol-SDS extraction followed by DNase treatment. The extracted RNA is suitable for gene transcription analysis by multiple techniques. This method is successfully employed in our studies of Listeria monocytogenes gene regulation during infection of macrophage cells 1-4. The protocol can be easily modified to study other bacterial pathogens and cell types.

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.

RNA精製は、細胞内から成長します<em&gt;リステリア菌</em&gt;マクロファージ細胞で

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...