このプロトコルは、角膜四肢上皮幹細胞をヒト多能性幹細胞と区別するための定義済みのフィーダー細胞フリー法を導入した。四肢上皮幹細胞は、健康な眼における角膜上皮を更新する責任がある。これらの細胞への損傷は、四肢幹細胞欠乏症として知られている状態につながり、角膜の明瞭さの損失につながる。
ここに示される細胞培養法は、将来の角膜細胞置換療法のための四肢上皮幹細胞の効率的な生産を可能にする。まず、テキストプロトコルに概説されているように、フィーダーフリーヒト多能性幹細胞培養を通過および維持する。分化の出発材料として、高品質のヒト多能性幹細胞のみを使用するようにしてください。
胚の身体形成を誘発する準備ができたら、必要な材料および試薬のすべてを層流フードの室温まで温める。各ウェルに500マイクロリットルのゼノフリートリプシンEDTAを加えることによって、フリーヒト多能性幹細胞を送気に取り外します。5%CO2で摂氏37度でインキュベート。
3分後、培養器から細胞を取り出し、細胞形態をチェックしてトリプシン除去に最適な相を決定します。細胞が切り上げられたが完全に剥離していない場合、細胞を注意深く観察して、キセノフリートライスピンEDTAを除去するのに最適な時間を決定します。最適なタイミングで、細胞からキセノフリートリプシンEDTAを除去する。
定義されたトリプシン阻害剤を追加し、穏やかにピペットを使用して細胞を取り外します。50ミリリットルの遠心分離チューブに単一細胞懸濁液を回収します。300gで5分間遠心分離機。
次いで、上清を取り除き、1ミリリットルの培養培地で細胞を再懸濁する。細胞を数えた後、5つのマイクロモルブレビスタチンを補った3ミリリットルの基底誘導培地で2〜300万個の細胞を低い付着6ウェルプレートの各ウェルに分配する。5%CO2で摂氏37度で一晩インキュベート。
翌日、胚体の品質を顕微鏡で確認します。培地を取り除き、人間の基本的なグラスファイバー成長因子の1ミリリットル当たり10マイクロモルSB-505124および50ナノグラムを添加した基底誘導培地の3ミリリットルに置き換えます。5%CO2で摂氏37度でインキュベートを続けます。
次の2日間、培地を取り出し、3ミリリットルの基底誘導培地に置き換え、骨形態形成タンパク質4の1ミリリットル当たり25ナノグラムを補う。次に、前の条件を使用してインキュベーションを継続する。4日目には、ラミニン-521の平方センチメートルあたり0.5マイクログラム、およびヒト胎盤コラーゲン4型の平方センチメートル当たり5マイクログラムの混合物を調製し、カルシウム2とマグネシウム2イオンを含むDPBSで希釈した。
この混合物を使用して、1皿当たり5ミリリットルの総コーティング量で付着分化するために100ミリメートルの組織培養皿をコーティングする。プレートを密封し、一晩で摂氏4度で保管します。5日目には、必要な材料と試薬をすべてラミナーフローフードで室温まで温めます。
この後、コーティング溶液を取り除き、各皿に10ミリリットルの事前温め分化培地を加えます。ピペットを使用して、胚体を2〜3個の組織培養皿全体で単一プレートウェルから移す。次に、各培養皿を穏やかに振って胚体を均等に分配する。
次の2週間半から3週間は5%CO2で37°Cの付着培養で細胞を維持し、培地を週に3回10ミリリットルの新鮮な分化培地に置き換えることを確認します。位相コントラスト顕微鏡を使用して、細胞の正しい上皮形態の出現を定期的にチェックします。まず、凍結保存媒体を除いて、必要なすべての材料および試薬をラミナーフローフードで室温に予め温めます。
次に、ヒト多能性幹細胞由来の四肢上皮幹細胞を、キノフリートリプシンEDTAを添加し、5%CO2で摂氏37度でインキュベートすることにより、単一細胞懸濁液に切断する。5分後、培養器から細胞を取り出し、細胞形態をチェックしてトリプシン除去に最適な相を決定します。細胞が切り上げられたが完全に剥離していない場合、細胞を注意深く観察して、キセノフリートリプシンEDTAを除去するのに最適な時間を決定します。
最適なタイミングで、細胞からキセノフリートリプシンEDTAを取り出し、先に述べたように細胞を取り外します。細胞を数えた後、5分間300gで遠心分離する。培地を吸引し、予冷排他凍結保存培地で細胞を再懸濁する。
ピペットを使用して、各凍結管が凍結保存培地の1ミリリットルに500,000から100万個の細胞を含むように、単一細胞懸濁液をクライオチューブに移します。チューブを凍結容器に入れます。5分以内に、一晩保管するためにマイナス80°Cの冷凍庫に移します。
翌日、長期保存のためにチューブを液体窒素に移します。細胞を解凍する前に、必要なすべての皿とプレートウェルに、人間の胎盤コラーゲンタイプ4タイプ5マイクログラム、LM-521の平方センチメートルあたり0.5マイクログラムの混合物でコーティングし、必要なすべての材料と試薬を層状流れフードの室温に事前に温めます。次に、食器およびプレートウェルからコーティング溶液を取り出し、適切な量の事前温め分化培地を加えます。
15ミリリットルの円錐管に事前に温めた分化培地を加えます。細胞を室温まで素早く解凍します。解凍したら、すぐに細胞懸濁液を円錐状遠心分離管に移す。
300gで5分間遠心分離機。培地を吸引し、分化培地中の細胞ペレットを再懸濁して、凍結保存培地を除去する。40,000〜50,000個の細胞/平方センチメートルの密度で分化培地で予めコーティングされた皿に細胞をプレートします。
細胞を摂氏37度の5%CO2に維持し、分化培地を週3回置き換えます。ラミニン-521では、未分化の高品質フィーダーフリーヒト多能性幹細胞は、最初に鋭いエッジを持つ別個のコロニーを形成し、合流時に均質な単層に結合する。基礎誘導培地で培養し、24時間の5つの微小臼歯ブレビスタチンを補い、典型的には様々な大きさのタイトで規則的な胚体の懸濁液を生じ、胚性体形態は懸濁液中の表面外胚誘導の間に劇的に変化してはならないが、発生体がコラーゲン型4型にメッキされた後すぐに現れるのが見られる。
分化の21〜25日以内に、細胞は、多角形形態を有する、上皮細胞に典型的であるコンフルエント同種層を形成する。細胞は、生存率と形態が解凍後によく保存されるため、後で使用するために凍結保存され得る。分化の24日目に、大部分の細胞は、ペアドボックスタンパク質、PAX6、眼の発達の主要な調節因子、ならびにp63アルファ、広く認められたLESCマーカーを発現した。
デルタNp63は、ほとんどのp63α陽性細胞で共発現し、最も角膜特異的なデルタNp63α陽性細胞表現型を確認する。他のマーカーは部分的に発現しているが、他のマーカーはこの時点では検出できないが、単一の四肢上皮前駆体に向かって分化が進んでいるが、成熟した角膜上皮細胞への末端分化はまだ起こっていない。平均して、各未分化フィーダー遊離ヒト多能性幹細胞は、25日目までに0.7細胞を生成する。
少なくとも65%δ Np63アルファ陽性細胞集団は24日目までに期待できる。凍結保存は細胞集団をさらに浄化する。全体的に、ここで紹介する方法は比較的単純ですが、成功への重要なポイントがいくつかあります。
出発材料の高品質は、一般的に穏やかで流暢な細胞培養技術と同様に不可欠です。このプロトコルは、臨床応用のためだけでなく、様々な研究目的のために、四肢上皮幹細胞を製造するための堅牢な手段を提供します。また、この方法は、網膜色素上皮細胞の分化のために容易に修飾することができる。
