まず、インキュベートする前に、150マイクロリットルの0.01%〜0.1%の細胞接着溶液でマイクロウェルディッシュをコーティングします。皿が風乾したら、80マイクロリットルの金ナノ粒子溶液を乾燥した表面に滴下します。翌日、添加した培地をマイクロウェルから取り出します。
次に、ガラス表面の固定化された金ナノ粒子の上に、トランスフェクションした細胞を2ミリリットル加えます。実験開始前にプレートをインキュベートします。臓器レーザーを488ナノメートルに設定した共焦点顕微鏡を使用して、アネキシンタンパク質からのGFP蛍光を観察します。
ヘリウムネオンレーザーを633ナノメートルにセットし、金ナノ粒子の反射を観察します。細胞膜の重なりを防ぐために、細胞クラスターではなく単一細胞を選択します。固定化された金ナノ粒子が単一粒子として存在し、温度勾配の増加を防ぐために適切な間隔を空けてください。
光ピンセットを使用して、金ナノ粒子を1秒間照射し、原形質膜を破壊します。巨大単層小胞(GUV)を生成するには、90マイクロリットルの加温した5%PVAゲルをスライドガラスに塗布します。ゲルをスライド上に均一に広げます。
次に、スライドを摂氏50度の加熱キャビネットで50分間乾燥させます。次に、ガラスシリンジを使用して、30マイクロリットルの脂質混合物を塗布します。針の先で、混合物を薄膜に広げます。
窒素ガスを穏やかに流して、脂質混合物のクロロホルムを蒸発させます。次に、スライドを真空下で1.5〜2時間乾燥させます。別の2ミリリットルのチューブに、400マイクロリットルの増殖緩衝液を加えます。
次に、目的の組換えタンパク質を最終濃度の500ナノモルに添加します。400マイクロリットルの希釈したタンパク質を組み立てられた社内チャンバーにピペットで移し、チャンバーをPERIFILで包みます。1時間のインキュベーション後、400マイクロリットルのチャンバー内容物を2ミリリットルのチューブに移します。
収集した溶液に1ミリリットルの観察バッファーを加えて、カプセル化されていないタンパク質を除去します。次に、溶液を600Gで13°Cで10分間遠心分離します。次に、上清1ミリリットルを観察バッファーと交換し、静かにピペットでGUVを分散させます。
実験が始まるまで冷蔵してください。GUVに穴を開けるには、まず35mmのガラス底皿の表面をベータカゼインでコーティングします。次に、塩化カルシウムを含むGUV混合物に、150ナノメートルの金ナノシェルを5マイクロリットル加えます。
混合物をチャンバーに移し、顕微鏡ステージに取り付けます。光ピンセットを使用して、個々の金ナノシェルをGUV表面に閉じ込めます。トラップされたナノシェルがGUVメンブレンに密着している場合は、レーザー出力を上げてターゲット部位に穴を開けます。
ナノ粒子の照射は膜損傷をもたらし、カルシウムの流入に続いて損傷部位へのアネキシンの急速な動員を引き起こしてリング状の構造を形成しました。GUV実験では、アネキシンの非存在下で膜穿刺が迅速に再密封されました。アネキシンA4タンパク質のユニークな生物物理学的特性は、膜を転がす能力のためにGUVの破裂につながりました。
GUV中のアネキシンの存在は、膜穿刺後の損傷部位に急速な蓄積を引き起こしました。細胞実験におけるアネキシンA5環の解析は、それらが時間と空間にわたって一定に保たれていることを示しました。サーモプラズモニクスを用いた原形質膜破壊は、カルシウムイオン濃度の上昇を引き起こした。
細胞は6.6秒で最大カルシウム強度に達し、この時点は創傷閉鎖の時間に対応すると推定される。
