Desideriamo ringraziare Jesper Nylandsted per averci fornito le proteine annessine ricombinanti e i plasmidi che codificano per le annessine. Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dal Consiglio danese per la ricerca indipendente, Scienze naturali (DFF-4181-00196), dal Programma di sinergia interdisciplinare della Fondazione Novo Nordisk 2018 (NNF18OC0034936), dal Comitato scientifico della Società danese per il cancro (R90-A5847-14-S2), dalla Fondazione Lundbeck (R218-2016-534) e dal Centro di eccellenza della Fondazione Lundbeck (Biomembrane in nanomedicina).

Puntura termoplasmonica indotta da laser per lo studio della riparazione della membrana plasmatica

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Lo studio evidenzia l'approccio termoplasmonico come una tecnica promettente per esplorare le risposte proteiche nelle cellule viventi e modellare le membrane a seguito della rottura della membrana. Questo metodo non solo fornisce ampie informazioni sul reclutamento delle proteine, ma anche sulla funzione biofisica delle proteine coinvolte nella dinamica proteina-membrana. Di conseguenza, facilita l'identificazione dei componenti molecolari responsabili della riparazione superficiale e fa progredire la comprensione del complesso ma vitale meccanismo di riparazione della membrana plasmatica. Sebbene esistano vari metodi per indurre la rottura della membrana, come tecniche meccaniche, chimiche e ottiche, questi metodi soffrono di limitazioni, come essere non specifici per le cellule, generare lesioni multiple alla membrana cellulare o causare danni significativi alla membrana e ablare il materiale cellulare interno lungo il percorso laser quando si utilizzano laser pulsati ad alta potenza. Sebbene l'integrazione della microscopia confocale e delle pinzette ottiche offra le informazioni più complete, potrebbero essere utilizzate anche modalità di imaging alternative. Ad esempio, poiché l'imaging della nanoparticella plasmonica si ottiene utilizzando la microscopia a riflessione, una modalità di imaging incorporata nei microscopi confocali Leica, ulteriori tecniche di imaging, come la microscopia in campo oscuro65,66, altri metodi di scattering come iSCAT67,68 o la marcatura fluorescente della nanoparticella, potrebbero essere impiegate per la visualizzazione AuNP, anche se ciò potrebbe limitare l'applicabilità del metodo.
Il metodo presentato è inoltre in grado di indurre fori nanoscopici nelle membrane modello, consentendo lo studio degli effetti sinergici tra diverse annessine. Ciò si ottiene incapsulando annessine ricombinanti marcate in modo diverso, ad esempio RFP e GFP, rispettivamente, seguite da puntura termoplasmonica. Questo sistema modello fornisce informazioni su come le annessine interagiscono con le membrane in prossimità dei bordi liberi, come dimostrato nella Figura 2D. Tuttavia, a differenza delle cellule, i fori inflitti ai GUV continuano ad espandersi, seguiti dalla destabilizzazione della vescicola. L'imaging dell'evoluzione del foro mediante microscopia confocale può essere difficile a causa della rapida espansione del diametro del foro, ma può essere ottenuto catturando diverse pile z nel tempo. Un metodo alternativo sarebbe quello di utilizzare un disco rotante confocale per un imaging più veloce. Inoltre, l'approccio termoplasmonico produce in genere un numero limitato di risultati ottimali all'ora quando viene applicato a singole cellule o esperimenti GUV, di solito da due a tre, a temperature del campione comprese tra 20 °C e 30 °C. Per ottenere un'osservazione più accurata della dinamica proteina-membrana, si raccomanda di conservare le cellule in un tampone contenente HEPES e di sostituire il campione ogni ora. In alternativa, la finestra sperimentale potrebbe essere estesa eseguendo gli esperimenti in una camera di incubazione cellulare, cioè a una temperatura costante di 37 °C con il 5% di CO2 . Inoltre, la combinazione di questo approccio con altre tecniche di imaging, come la microscopia stocastica a ricostruzione ottica (STORM), potrebbe fornire una comprensione più approfondita della funzione biofisica e dell'interazione delle proteine chiave coinvolte nella riparazione della membrana a livello di singola molecola. Ciò potrebbe fornire informazioni dettagliate sul sito della lesione, compresa la geometria della ferita e la posizione delle proteine annessina, nonché identificare altri attori chiave coinvolti nella riparazione della superficie della membrana.
Al fine di ottenere la massima efficacia e precisione nell'indurre lesioni alla membrana, è imperativo verificare la posizione del fuoco laser prima di ogni esperimento e assicurarsi che la posizione assiale del fuoco laser coincida con il fuoco confocale. Questo allineamento ottimizza l'intensità durante l'imaging AuNP, il che porta a un massimo aumento della temperatura locale e alla conseguente lesione della membrana a una potenza laser inferiore. Questo processo viene eseguito manualmente e quindi suscettibile di variabilità nell'efficienza di rottura della membrana poiché il fuoco viene tradotto manualmente in una posizione che coincide con la posizione della particella. Nei microscopi che non dispongono di una modalità di riflessione, come in alcuni sistemi commerciali, la co-localizzazione del fuoco laser e della particella può essere impegnativa. In questi casi, è possibile utilizzare modalità di imaging alternative (ad esempio, campo chiaro) e eseguire una scansione raster lenta intorno alla posizione prevista della particella. Va notato che è probabile che una bassa potenza laser induca solo la permeabilizzazione della membrana, mentre un'elevata potenza laser può generare temperature intorno al NP che superano il punto di ebollizione dell'acqua, anche se la superficie del vetro ha un effetto di raffreddamento. Si stima che la formazione di nanobolle che circondano le NP avvenga tra 200 °C e 300 °C25,48, dove il calore esplosivo può provocare lo spostamento delle particelle dal fuoco laser o la frammentazione delle particelle. Inoltre, la formazione di nano o microbolle durante il riscaldamento rappresenta una sfida per questo metodo. Poiché l'aria si interfaccia con le membrane deumidificate e può causare la destabilizzazione delle proteine, il che è indesiderabile, è imperativo limitare il riscaldamento quando si studia la riparazione della membrana. In particolare, i nanogusci d'oro non tollerano le alte temperature e si degradano in queste condizioni, come dimostrato dalla microscopia ad alta risoluzione58.
Questo articolo fornisce un protocollo dettagliato per l'utilizzo della termoplasmonica per eseguire punture altamente localizzate nelle membrane, applicabile sia alle cellule che alle membrane modello. Per ridurre ulteriormente l'entità del riscaldamento, è possibile utilizzare nanoparticelle più piccole che risuonano con la luce NIR, consentendo punture intracellulari negli endosomi, nel reticolo endoplasmatico e nell'involucro nucleare. Tali nanoparticelle, tra cui bastoncelli e nanomatrioske48, possono essere utilizzate per studiare la riparazione dell'involucro nucleare prendendo di mira le nanoparticelle d'oro endocitate che vengono prontamente assorbite sulla superficie cellulare e trafficate verso il nucleo69. Nel complesso, questa tecnica consente l'identificazione e l'esame dei componenti molecolari chiave coinvolti nella PMR, chiarendo la loro funzione biofisica e il loro ruolo, preservando al contempo la vitalità delle cellule.

La membrana cellulare, che funge sia da barriera fisica che da piattaforma di segnalazione, è vitale per la sopravvivenza cellulare1. Durante il suo intero ciclo cellulare, la membrana plasmatica (PM) è soggetta a danni, come lesioni meccaniche 2,3,4,5 e chimiche 6 indotte dallo stress. Per mantenere l'integrità della membrana e garantire la sopravvivenza cellulare, la cellula ha sviluppato robusti meccanismi di riparazione della membrana plasmatica (PMR). Questi meccanismi dipendono da varie strategie, come la riorganizzazione del citoscheletro, la fusione della membrana e le strategie di sostituzione della membrana 7,8,9,10,11, che si basano tutte sul reclutamento di proteine specifiche. In particolare, i membri della famiglia delle proteine annessine sono stati identificati come proteine chiave associate ai processi di PMR 1,9,12,13,14,15,16. A seguito di una lesione da PM, la cellula subisce un afflusso di ioni calcio (Ca2+), che rappresenta una minaccia immediata per la sopravvivenza della cellula17. In risposta all'afflusso di Ca2+, le proteine annessine, che si trovano prevalentemente nel citosol, si legano al lembo interno della membrana plasmatica danneggiata come parte delle strategie PMR18. L'annessina A2 (ANXA2) è stata uno dei primi membri della famiglia delle annessine ad essere associata alla PMR nella distrofia muscolare da deficit di disferlina ed è stato suggerito per mediare la riparazione fondendo le vescicole intracellulari al PM vicino al sito della lesione 5,19,20,21. Successivamente, diverse funzioni sono state attribuite alle annessioni22 e il loro ruolo nella PMR ha attirato una maggiore attenzione negli ultimi 20 anni. Tuttavia, l'esatto ruolo delle annessine nella PMR non è ancora pienamente compreso 15,18,21,22.
Questo articolo propone un metodo per studiare l'interazione proteina-membrana e la dinamica della membrana in modo controllato e altamente localizzato, utilizzando una combinazione di microscopia confocale, pinzette ottiche e nanoparticelle d'oro (AuNP). Questo metodo consente lo studio quantitativo delle interazioni tra proteine, lipidi e piccole molecole in risposta al danno alla membrana e all'afflusso di Ca2+ . Nonostante la complessità e la molteplicità dei componenti coinvolti nel processo di riparazione della membrana, sono stati impiegati sistemi a membrana semplificati che imitano la membrana plasmatica per ottenere una comprensione meccanicistica più profonda della dinamica della membrana e della risposta delle proteine annessine alla rottura della membrana16. Le vescicole lipidiche unilamellari giganti (GUV) sono state scelte come sistema di membrana modello con una composizione lipidica specificata. I GUV sono stati generati utilizzando il metodo di idratazione assistita da gel, in particolare l'idratazione su gel di alcol polivinilico, come descritto da Weinberger et al.23, che ha permesso un efficiente incapsulamento delle annessine nei GUV.
L'utilizzo dell'irradiazione laser nel vicino infrarosso (NIR) su nanoparticelle metalliche (NP) induce un significativo riscaldamento delle NP, rendendolo un metodo efficace per stabilire una fonte di calore locale sfruttata nelle applicazioni biomediche24. Il metodo è stato inizialmente utilizzato per misurare direttamente la temperatura che circonda una singola AuNP in saggi biomimetici 2D e 3D. In questi saggi25,26, le nanoparticelle plasmoniche sono state irradiate su un doppio strato lipidico supportato o intrappolate otticamente vicino a GUV sottoposti a una transizione di fase termica locale dopo riscaldamento locale, consentendo la quantificazione e il controllo dell'esatto profilo di temperatura intorno alla particella. Questo profilo di temperatura di riferimento è stato utilizzato durante l'indagine o la manipolazione di campioni biologici. Ulteriori progressi nel metodo hanno facilitato l'induzione di pori nanoscopici nelle membrane27, consentendo la fusione di vescicole e cellule28,29. Altri studi hanno studiato il comportamento delle proteine di membrana periferiche nei GUV29 e nelle proteine transmembrana30 creando nuove vescicole ibride, mentre la somministrazione di farmaci cellulo-specifici è stata esplorata anche per controllare e studiare le risposte cellulari o l'espressione genica 28,29,31,32,33. Recentemente, il metodo è stato utilizzato per studiare le risposte proteiche al danno di membrana 32,34,35.
Esistono diversi metodi per interrompere la membrana plasmatica per esplorare le risposte cellulari e la riparazione della membrana. Questi includono punture con microaghi, scuotimento di microsfere e raschiamento cellulare, che possono interrompere meccanicamente la membrana cellulare 14,36,37. Il danno indotto chimicamente può essere ottenuto aggiungendo detergenti 5,38 o tossine batteriche39,40 che destabilizzano il doppio strato lipidico e generano pori di membrana attraverso la membrana plasmatica. Inoltre, le lesioni otticamente indotte da laser ad onda continua e pulsati sono state utilizzate per studiare i componenti PMR, come le proteine annessina 5,14,21,41, in combinazione con nanoparticelle plasmoniche 42,43,44,45. Nonostante l'efficienza dei laser pulsati ad alta potenza, possono causare lesioni significative e danni all'interno della cellula lungo il percorso del raggio. Inoltre, i cambiamenti dettagliati che si verificano nella materia biologica in seguito all'irradiazione laser pulsata e se crea un poro ben definito rimangono da indagare ulteriormente. In questo articolo viene presentato un metodo alternativo, che impiega la termoplasmonica per indurre fori nanoscopici nel PM in modo controllato 34,35 senza causare danni significativi alle strutture interne. Ciò si ottiene esponendo le NP plasmoniche a un laser NIR altamente focalizzato, con conseguente aumento della temperatura estremamente localizzato che può facilmente raggiungere temperature superiori a 200 °C, che possono portare a piccole esplosioni nanoscopiche 25,46,47. Questo processo può essere controllato regolando l'intensità del laser, nonché le dimensioni, la forma e la composizione degli NP48. Impiegando questa tecnica, i ricercatori possono esplorare il ruolo delle proteine nella riparazione del PM nelle cellule viventi, il che potrebbe aiutare a rispondere ad alcune delle domande senza risposta riguardanti il coinvolgimento delle proteine annessina nella riparazione della membrana senza compromettere la vitalità cellulare.
L'intrappolamento ottico delle nanoparticelle plasmoniche è stato ben stabilito da precedenti studi 25,49,50,51,52; tuttavia, ulteriori approfondimenti sulle proprietà termoplasmoniche delle nanoparticelle 53,54,55 possono essere ottenuti nei materiali supplementari (Supplementary File 1). Il metodo termoplasmonico può essere utilizzato per creare fori nanoscopici nel PM allo scopo di studiare la risposta cellulare e i meccanismi di riparazione. Più precisamente, la puntura può essere ottenuta attraverso il riscaldamento ottico delle AuNP in prossimità della membrana, come mostrato nelle Figure 1A e B. Questa puntura localizzata consente l'afflusso di Ca2+, che è stato verificato da un sensore di calcio, attivando così il meccanismo PMR. Per gli esperimenti su cellule vive, le AuNP con un diametro di 200 nm sono state immobilizzate sulla superficie sotto la cellula per monitorare il ruolo di ANXA2 nella PMR tramite microscopia confocale. Il laser NIR (Figura 1A,B), con una lunghezza d'onda di 1064 nm, irradia l'AuNP, sfruttando le sue proprietà plasmoniche (Figura 1C), provocando un sostanziale riscaldamento locale (Figura 1D) nella finestra di trasparenza biologica49 e causando danni minimi alla cellula stessa. La regione ad alta temperatura che circonda l'AuNP diminuisce rapidamente del 30-40% a una distanza corrispondente al raggio dell'NP, come illustrato nella Figura 1E, consentendo una lesione estremamente limitata in tutte e tre le dimensioni.
Fascicolo supplementare 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65776/Supplementary%20File%201_updated.zip" target="_blank">Fare clic qui per scaricare il file.</a>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65776/65776fig01.jpg"> Figura 1: Schema del metodo sperimentale. (A) le cellule trasfettate con ANXA sono situate sopra nanoparticelle d'oro immobilizzate (AuNP) sulla superficie, o (B) le vescicole unilamellari giganti (GUV) con ANXA incapsulate sono sospese in un mezzo contenente AuNP. (C) Una singola AuNP viene irradiata dalla trappola ottica NIR, dove l'interazione tra il campo elettromagnetico in ingresso e gli elettroni di conduzione porta all'oscillazione collettiva degli elettroni all'interno della NP. (D) Questo processo provoca un aumento della temperatura altamente confinato ma significativo. Per stimare la temperatura sulla superficie NP, viene utilizzata la teoria di Mie, e viene calcolato un profilo di temperatura (E) per un AuNP con un diametro di 200 nm e intensità laser I = 6,36 x 108 W/cm2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65776/65776fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Per ridurre al minimo l'effetto termico sulla membrana cellulare, le AuNP vengono irradiate solo per ~1 secondo. Ciò provoca un'esplosione di riscaldamento transitoria e locale, che riduce il danno alle proteine che in genere richiedono più tempo per dispiegarsi. Dopo la puntura della membrana, le proteine annessina vengono reclutate in una frazione di secondo e, nel giro di pochi secondi, si forma un'impalcatura ad anello di annessina attorno al sito della lesione (Figura 2). Questo approccio è stato applicato anche per esplorare il coinvolgimento di ANXA5 sia nelle cellule viventi che nelle membrane modello16 nel tentativo di far luce sullo schema completo dei processi di riparazione. Mentre l'attenzione principale si è concentrata sul reclutamento correlato di varie proteine annessine, gli aspetti biofisici del meccanismo di riparazione devono ancora essere chiariti.
Per implementare pienamente il metodo proposto, sono necessari tre componenti chiave: microscopia confocale, pinzette ottiche e nanoparticelle metalliche. Le pinzette ottiche vengono utilizzate per intrappolare le AuNP e la loro costruzione può essere ottenuta seguendo la procedura descritta da Neuman et al.49. Tuttavia, se la costruzione di una pinzetta ottica si rivela troppo impegnativa, è possibile utilizzare un laser NIR strettamente focalizzato per irradiare le AuNP immobilizzate sotto le cellule. Mentre le AuNP sferiche sono state scelte per questo protocollo, una varietà di particelle plasmoniche con spettri di assorbimento sintonizzabili potrebbe anche essere utilizzata per ottenere un gradiente di temperatura altamente localizzato all'interno della regione NIR48.
L'imaging a fluorescenza è necessario per osservare il ruolo delle proteine marcate con fluorescenza e, pertanto, la microscopia a riflessione interna totale (TIRF)56 potrebbe essere considerata un'alternativa all'imaging confocale. Tuttavia, questa tecnica consente solo l'imaging di superficie e non sarebbe compatibile con gli esperimenti sulle vescicole di membrana modello. Di conseguenza, sia le pinzette ottiche che il microscopio confocale sono essenziali per la localizzazione precisa della nanoparticella e per l'indagine dettagliata dell'area locale che circonda la lesione cellulare. Per irradiare efficacemente la nanoparticella con un fuoco laser limitato alla diffrazione, è necessario visualizzare la nanoparticella. Ciò può essere ottenuto in modo ottimale con la microscopia a riflessione, che è una caratteristica di imaging standard dei microscopi confocali Leica. Tuttavia, se l'imaging a riflessione o a dispersione non è disponibile, possono essere presi in considerazione metodi alternativi, come la marcatura fluorescente AuNP meno efficiente.
In sintesi, il metodo termoplasmonico altamente controllabile e localizzato presentato in questo studio ha il potenziale per fungere da eccellente piattaforma per studiare i componenti molecolari coinvolti nelle risposte cellulari e nei meccanismi di riparazione del PM nelle cellule viventi. Oltre a studiare la risposta proteica al danno da PM, questo approccio può essere utilizzato anche per perforare localmente le vescicole, consentendo così un'indagine della risposta proteica sia nella dinamica proteina-proteina che in quella proteina-membrana. Inoltre, questo metodo consente un'analisi quantitativa delle interazioni tra proteine, lipidi e piccole molecole quando le membrane vengono interrotte. Collettivamente, questi progressi hanno il potenziale per far luce su alcune delle questioni irrisolte riguardanti l'intricato e complesso meccanismo di riparazione della membrana plasmatica.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1064 nm trapping laser</td>
			<td>Spectra Physics</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Spectra Physics J201-BL-106C, Nd: YVO4 NIR laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>160 nm Gold Nanoshells</td>
			<td>NanoComposix</td>
			<td>NCXGSIR150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 nm Gold Nanoparticles</td>
			<td>BBI Solutions</td>
			<td>EM.GC200/7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass surface MatTex microwell</td>
			<td>MATTEK</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber-glass vials</td>
			<td>Supelco Sigma Aldrich</td>
			<td>243438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin A2 plasmids</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin A4 recombinant-protein&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N-terminal GFP tagged ANXA4 received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin A5 recombinant-protein&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N-terminal GFP tagged ANXA5 received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta-casein</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>C6905-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Suprlco (sigma Aldrich)</td>
			<td>10035-04-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5702</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture dish (Nunclon Delta Surface)</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>150460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DID cell-labelling Solution</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15230-089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375C</td>
			<td>Dissolved in chloroform&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPS</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840035C</td>
			<td>Dissolved in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eage&#39;s Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11995065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI ImageJ distribution</td>
			<td>ImageJ2</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GCaMP6s-CAAX</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>Received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11573397</td>
			<td>10% of the culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>PROLABO</td>
			<td>24 374.297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringes</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>N/A</td>
			<td>50 and 500 microliters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harrick Plasma Cleaner PDG-002</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>Received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Acousto-Optical Beam Splitter (AOBS)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica PL APO 63x water immersion objective, NA = 1.2</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP5 confocal scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15338030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab</td>
			<td>The Mathworks, Inc., Natick, Massachusetts, United States</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM Reduced-Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11058021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>1% of the culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezoelectric stage (PI 731.20)</td>
			<td>&#160;Physik Instrumente (Germany)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920-100ML</td>
			<td>0.01-0.1% for coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>363065-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>round glass slide 25 mm &#216;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-1584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator Brandson 2800</td>
			<td>Brandson</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 tissue culture flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353108</td>
			<td>Blue Vented cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>15567-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1285901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11590626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;VWR Mixer mini vortex 230V EU</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&#160;12620-84</td>
			<td>&#160;ECN: 444-2790, SN: 150713022</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a thermoplasmonic approach for investigating plasma membrane repair in living cells and model membranes

La membrana cellulare è fondamentale per la sopravvivenza cellulare e garantirne l'integrità è essenziale poiché la cellula subisce lesioni durante il suo intero ciclo di vita. Per prevenire danni alla membrana, le cellule hanno sviluppato efficienti meccanismi di riparazione della membrana plasmatica. Questi meccanismi di riparazione possono essere studiati combinando la microscopia confocale e la termoplasmonica su scala nanometrica per identificare e studiare il ruolo di proteine chiave, come le annessine, coinvolte nella riparazione superficiale nelle cellule viventi e nei sistemi modello di membrana.
Il metodo di puntura impiega un laser per indurre un riscaldamento altamente localizzato in seguito all'irradiazione di nanoparticelle. L'uso della luce nel vicino infrarosso riduce al minimo la fototossicità nel campione biologico, mentre la maggior parte dell'assorbimento avviene nella nanoparticella plasmonica risonante nel vicino infrarosso. Questo metodo termoplasmonico è stato sfruttato per potenziali ricerche fototermiche e biofisiche per migliorare la comprensione dei meccanismi intracellulari e delle risposte cellulari attraverso studi di fusione di vescicole e cellule. L'approccio ha dimostrato di essere complementare ai metodi esistenti per la rottura della membrana, come le lesioni indotte meccanicamente, chimicamente o otticamente, e fornisce un elevato livello di controllo infliggendo lesioni estremamente localizzate. L'entità della lesione è limitata alla vicinanza della nanoparticella sferica e non si verificano danni dannosi lungo il percorso del fascio rispetto ai laser pulsati che utilizzano lunghezze d'onda diverse. Nonostante alcune limitazioni, come la formazione di nanobolle, il metodo termoplasmonico offre uno strumento unico per studiare le risposte cellulari nella riparazione della membrana plasmatica in un ambiente quasi nativo senza compromettere la vitalità cellulare.
Se integrato con la microscopia confocale, il metodo di puntura può fornire una comprensione meccanicistica della dinamica della membrana nei sistemi di membrana modello, nonché informazioni quantitative sulle risposte delle proteine al danno di membrana, compreso il reclutamento delle proteine e la loro funzione biofisica. Nel complesso, l'applicazione di questo metodo a sistemi modello ridotti può migliorare la nostra comprensione dell'intricato meccanismo di riparazione della membrana plasmatica nelle cellule viventi.

The cell membrane, serving both as a physical barrier and a signaling platform, is vital for cell survival1. Throughout its entire cell cycle, the plasma membrane (PM) is subjected to damage, such as mechanical2,3,4,5 and chemical6 stress-induced injuries. To maintain membrane integrity and ensure cell survival, the cell has developed robust plasma membrane repair (PMR) mechanisms. These mechanisms depend on various strategies, such as cytoskeleton reorganization, membrane fusion, and membrane replacement strategies7,8,9,10,11, all of which rely on the recruitment of specific proteins. Notably, members of the annexin protein family have been identified as key proteins associated with the processes of PMR1,9,12,13,14,15,16. Following PM injury, the cell experiences an influx of calcium ions (Ca2+), which poses an immediate threat to the cell&#39;s survival17. In response to Ca2+ influx, annexin proteins, which are predominantly located in the cytosol, bind to the inner leaflet of the damaged plasma membrane as a part of the PMR strategies18. Annexin A2 (ANXA2) was one of the first members of the annexin family to be associated with PMR in dysferlin-deficient muscular dystrophy and was suggested to mediate repair by fusing intracellular vesicles to the PM near the injury site5,19,20,21. Subsequently, several functions have been attributed to annexins22, and their role in PMR has garnered increased attention over the past 20 years. However, the exact role of annexins in PMR remains not fully understood15,18,21,22.
This article proposes a method for investigating protein-membrane interaction and membrane dynamics in a controlled and highly localized manner, utilizing a combination of confocal microscopy, optical tweezers, and gold nanoparticles (AuNPs). This method enables the quantitative study of protein, lipid, and small molecule interactions in response to membrane damage and Ca2+ influx. Despite the complexity and multiplicity of components involved in the process of membrane repair, simplified membrane systems that mimic the plasma membrane have been employed to gain a deeper mechanistic understanding of membrane dynamics and the response of annexin proteins to membrane disruption16. Giant unilamellar lipid vesicles (GUVs) were chosen as the model membrane system with a specified lipid composition. The GUVs were generated using the gel-assisted hydration method, specifically polyvinyl alcohol gel hydration, as described by Weinberger et al.23, which allowed for efficient encapsulation of annexins into GUVs.
The utilization of near-infrared (NIR) laser irradiation on metallic nanoparticles (NPs) induces significant heating of the NP, making it an effective method to establish a local heat source exploited in biomedical applications24. The method was initially used to directly measure the temperature surrounding a single AuNP in both 2D and 3D biomimetic assays. In these assays25,26, the plasmonic nanoparticles were irradiated on a supported lipid bilayer or optically trapped near GUVs undergoing a local thermal phase transition upon local heating, enabling quantification and control of the exact temperature profile around the particle. This reference temperature profile has been utilized when investigating or manipulating biological specimens. Further advancements in the method have facilitated the induction of nanoscopic pores in membranes27, allowing for vesicle and cell fusion28,29. Other studies have investigated the behavior of peripheral membrane proteins in GUVs29 and transmembrane proteins30 by creating novel hybrid vesicles, while cell-specific drug delivery has also been explored to control and study cellular responses or gene expression28,29,31,32,33. Recently, the method has been used to investigate protein responses to membrane damage32,34,35.
Several methods exist for disrupting the plasma membrane to explore cellular responses and membrane repair. These include microneedle punctures, microbead shaking, and cell scraping, all of which can disrupt the cell membrane mechanically14,36,37. Chemically induced damage can be achieved by adding detergents5,38&#160;or bacterial toxins39,40 that destabilize the lipid bilayer and generate membrane pores across the plasma membrane. Furthermore, optically induced injuries by continuous wave and pulsed lasers have been used to study PMR components, such as annexin proteins5,14,21,41, in combination with plasmonic nanoparticles42,43,44,45. Despite the efficiency of high-power pulsed lasers, they can cause significant injuries and damage to the cell&#39;s interior along the beam path. Moreover, the detailed changes that occur in the biological matter upon pulsed laser irradiation and whether it creates a well-defined pore remain to be further investigated. An alternative method is presented in this article, employing thermoplasmonics to induce nanoscopic holes in the PM in a controlled manner34,35 without causing significant harm to the internal structures. This is accomplished by exposing plasmonic NPs to a highly focused NIR laser, resulting in an extremely localized temperature increase that can easily reach temperatures exceeding 200 &#176;C, which can lead to small nanoscopic explosions25,46,47. This process can be controlled by adjusting the laser intensity as well as the size, shape, and composition of the NPs48. By employing this technique, researchers can explore the role of proteins in PM repair in living cells, which could help address some of the unanswered questions regarding the involvement of annexin proteins in membrane repair without compromising cell viability.
The optical trapping of plasmonic nanoparticles has been well established by previous studies25,49,50,51,52; however, additional insights regarding the thermoplasmonic properties of the nanoparticles53,54,55&#160;can be obtained in the supplementary materials (Supplementary File 1). The thermoplasmonic method can be used to create nanoscopic holes in the PM for the purpose of studying the cellular response and repair mechanisms. More precisely, the puncture can be achieved through the optical heating of AuNPs in close proximity to the membrane, as shown in Figures 1A and B. This localized puncture allows for Ca2+ influx, which was verified by a calcium sensor, thus activating the PMR machinery. For live cell experiments, AuNPs with a diameter of 200 nm were immobilized on the surface beneath the cell to monitor the role of ANXA2 in PMR via confocal microscopy. The NIR laser (Figure 1A,B), with a wavelength of 1064 nm, irradiates the AuNP, exploiting its plasmonic properties (Figure 1C), resulting in substantial local heating (Figure 1D) in the biological transparency window49 while causing minimal damage to the cell itself. The high-temperature region surrounding the AuNP rapidly decreases by 30-40% at a distance corresponding to the radius of the NP, as depicted in Figure 1E, allowing for an extremely confined injury in all three dimensions.
Supplementary File 1.&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65776/Supplementary File 1_updated.zip" target="_blank">Please click here to download this File.</a>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65776/65776fig01.jpg" /> 
Figure 1: Schematic outline of the experimental method. (A) ANXA-transfected cells are situated on top of immobilized gold nanoparticles (AuNPs) on the surface, or (B) giant unilamellar vesicles (GUVs)&#160;with encapsulated ANXA are suspended in a medium containing AuNPs. (C) A single AuNP is irradiated by the NIR optical trap, where the interaction between the incoming electromagnetic field and the conduction electrons leads to the collective oscillation of electrons within the NP. (D) This process results in a highly confined yet significant increase in temperature. To estimate the temperature at the NP surface, Mie theory is employed, and a (E) temperature profile is calculated for an AuNP with a diameter of 200 nm and laser intensity I = 6.36 x 108 W/cm2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65776/65776fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
To minimize the thermal effect on the cell membrane, the AuNPs are only irradiated for ~1 second. This causes a transient and local burst of heating, which reduces the damage to proteins that typically require more time to unfold. Upon membrane puncture, annexin proteins are recruited in a fraction of a second, and within a few seconds, an annexin ring-like scaffold is formed around the site of injury (Figure 2). This approach has also been applied to explore the involvement of ANXA5 in both living cells and model membranes16 in an effort to shed light on the complete scheme of the repair processes. While the primary focus has been on the correlating recruitment of various annexin proteins, the biophysical aspects of the repair mechanism have yet to be elucidated.
To fully implement the proposed method, three key components are required: confocal microscopy, optical tweezers, and metal nanoparticles. Optical tweezers are used to trap AuNPs, and their construction can be achieved by following the procedure outlined by Neuman et al.49. However, if building an optical tweezer proves to be too challenging, a tightly focused NIR laser can be used to irradiate AuNPs immobilized beneath the cells. While spherical AuNPs were chosen for this protocol, a variety of plasmonic particles with tunable absorption spectra could also be utilized to achieve a highly localized temperature gradient within the NIR region48.
Fluorescence imaging is necessary for observing the role of the fluorescently labeled proteins, and therefore, total internal reflection microscopy (TIRF)56 could be considered as an alternative to confocal imaging. However, this technique only allows for surface imaging and would not be compatible with the model membrane vesicle experiments. Consequently, both the optical tweezers and confocal microscope are essential for the precise localization of the nanoparticle and detailed investigation of the local area surrounding the cell injury. To effectively irradiate the nanoparticle with a diffraction-limited laser focus, it is necessary to visualize the nanoparticle. This can be optimally achieved by reflection microscopy, which is a standard imaging feature of Leica confocal microscopes. However, if reflection or scattering imaging is not available, alternative methods, such as the less efficient fluorescent AuNP labeling, may be considered.
In summary, the highly controllable and localized thermoplasmonic method presented in this study has the potential to serve as an excellent platform for investigating the molecular components involved in cellular responses and PM repair mechanisms in living cells. In addition to studying the protein response upon PM damage, this approach can also be utilized for locally puncturing vesicles, thereby enabling an investigation of the protein response in both protein-protein and protein-membrane dynamics. Moreover, this method allows for a quantitative analysis of the interactions between proteins, lipids, and small molecules when membranes are disrupted. Collectively, these advances have the potential to shed light on some of the unresolved questions regarding the intricate and complex plasma membrane repair machinery.

Autore in primo piano: Esplorazione dei meccanismi di riparazione della membrana plasmatica con l'innovativa puntura termoplasmonica 

Un approccio termoplasmonico per lo studio della riparazione della membrana plasmatica in cellule viventi e membrane modello

Nel presente studio, il metodo termoplasmonico viene utilizzato per studiare la risposta della proteina annessina alla rottura della membrana plasmatica; Tuttavia, qualsiasi proteina che può essere reclutata in seguito a una lesione della membrana può essere studiata utilizzando questo saggio, dato che la rispettiva proteina è marcata in modo fluorescente. Il reclutamento e la funzione delle proteine sono monitorati mediante imaging confocale sia nelle cellule renali embrionali umane (HEK293T) che nelle vescicole unilamellari giganti (GUV). Per approfondire, la Figura 2 illustra le condizioni sperimentali in cui un raggio laser NIR focalizzato a 1064 nm viene utilizzato per irradiare una singola AuNP (Figura 2A), provocando una lesione della membrana e un afflusso di Ca2+ nella cellula, attivando il meccanismo PMR. Successivamente, le annessine vengono rapidamente reclutate nel sito della lesione, dove si legano ai fosfolipidi caricati negativamente sul perimetro della ferita, formando una struttura ad anello in pochi secondi (Figura 2B, i-iv). Gli esperimenti di membrana modello, utilizzando GUV, hanno dimostrato che le punture di membrana sono state rapidamente risigillate in assenza di ANXA, come illustrato nella Figura 2C. Tuttavia, in presenza di ANXA, è stato osservato un rapido accumulo di ANXA nel sito della lesione dopo la puntura della membrana (Figura 2D). In particolare, ANXA ha continuato a far rotolare i bordi esposti, portando alla fine allo scoppio del GUV. Si ritiene che questo meccanismo di rotolamento derivi dalla capacità dell'ANXA di indurre curvatura e piegare le membrane lipidiche20.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65776/65776fig02.jpg"> Figura 2: Risposta delle annessine (ANXA) alla rottura della membrana indotta dalla termoplasmonica. Inizialmente, (A) la membrana plasmatica funge da barriera tra l'ambiente extracellulare contenente alti livelli di ioni Ca2+ e l'ambiente intracellulare con ANXA incapsulati. Dopo l'irradiazione con un laser nel vicino infrarosso (NIR), l'AuNP genera un calore sostanziale, causando la rottura della membrana e provocando un afflusso di ioni Ca2+. Di conseguenza, viene attivato il meccanismo di riparazione della membrana plasmatica (PMR), che comporta il reclutamento di ANXA nel sito della lesione, dove si legano ai fosfolipidi caricati negativamente. (B-D) Le immagini al microscopio confocale di una cellula contenente ANXA2 e di un GUV contenente ANXA4 dimostrano questo processo. (i) Prima dell'irradiazione, le immagini mostrano una cella intatta, o GUV, con i siti di irradiazione indicati dalle frecce bianche. (ii) Dopo l'irradiazione con nanoparticelle, (B) gli ANXA vengono rapidamente reclutati nel sito della lesione, formando una struttura ad anello attorno alla membrana ferita (B [ii-iv]). Il pannello (C) mostra un GUV colorato con membrana senza ANXA, che, dopo la puntura, si richiude rapidamente senza rimodellamento osservabile della membrana. D'altra parte, il pannello (D) mostra un GUV contenente ANXA4 ricombinante, che è già legato alla membrana prima dell'irradiazione (i) a causa della fuoriuscita di Ca2+ attraverso la membrana. (ii) Al momento della puntura, ANXA4 si lega ai bordi liberi, causando il collasso del GUV mentre la membrana si allontana dal bordo. Le barre della scala misurano 10 μm per la figura (B), 2 μm per B (i), 10 μm per (C) e 15 μm per (D). Questa figura è riprodotta da Moreno-Pescador et. al16 con il permesso della Royal Society of Chemistry. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65776/65776fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
L'analisi delle strutture anelliformi complete di ANXA (Figura 2B e Figura 1 supplementare) fornisce informazioni utili sulle dimensioni e sulla morfologia della ferita. Il raggio della struttura ad anello ANXA può essere determinato nel tempo e nello spazio, come descritto nella Sezione 5. Moreno et al.16 hanno analizzato oltre 135 lesioni della membrana plasmatica in cellule viventi, dove l'analisi delle strutture ad anello ANXA5 è illustrata nella Figura 3. Il raggio è stato determinato misurando la distanza dal centro dell'anello al raggio esterno della curva in base alla metà della larghezza massima del profilo di intensità collassato (Figura 3A). I risultati hanno illustrato una distribuzione eterogenea delle dimensioni dell'anello ANXA5 (Figura 3B), che è rimasta costante nel tempo (Figura 3D, G, H) e nello spazio (Figura 3C, E, F). Questi risultati suggeriscono un accumulo di ANXA5 intorno ai siti di lesione, indicativo di una strategia PMR alternativa mediata da ANXA5 nelle cellule viventi all'ipotizzata gemmazione a imbuto verso l'interno della membrana danneggiata5.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65776/65776fig03.jpg"> Figura 3: Analisi delle strutture ad anello ANXA5 che circondano un sito di lesione in cellule viventi. (A) La rappresentazione schematica illustra l'approccio analitico, che si basa sulla metà della larghezza massima del profilo della linea di intensità ANXA. (B) L'istogramma illustra 135 raggi di anello ANXA5 misurati. (C) Profili della linea di intensità della fluorescenza attraverso un anello ANXA5-GFP per ciascuna sezione z dello z-stack. (D) Le immagini confocali illustrano l'evoluzione temporale di una ferita, in cui ANXA5-GFP si accumula sul perimetro della ferita subito dopo la lesione, seguita dalla stabilizzazione della ferita. Gli intervalli di tempo etichettati da 1 a 6 sono stati acquisiti a intervalli di 0,66 s per fotogramma. La barra della scala è di 2 μm. (E) I raggi delle ferite sono stati determinati in funzione della profondità della ferita in base al metodo presentato nel pannello A. (F) La pendenza della ferita è stata analizzata come raggi dell'anello ANXA5 in funzione dell'altezza z in base ai dati estratti dal pannello E. (G) I profili della linea di intensità della fluorescenza sono stati misurati attraverso l'anello ANXA5-GFP del pannello D, dove ogni intervallo di tempo 1-6 è indicato come sezione 1-6. Infine, (H) l'evoluzione temporale dei raggi dell'anello ANXA5-GFP è presentata in funzione del tempo calcolato dai dati nel pannello G. Questa figura è riprodotta da Moreno-Pescador et. al16 con il permesso della Royal Society of Chemistry. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65776/65776fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Rispetto alle strutture ad anello formate dalla sola distruzione del PM (Figura 1 supplementare), le lesioni in prossimità del nucleo (Figura 2A supplementare) possono influenzare l'evoluzione e la geometria della ferita. Occasionalmente, solo una frazione degli anelli ANXA era evidente (Figura supplementare 2B,C), che può anche essere analizzata utilizzando il flusso di lavoro di analisi MATLAB interno (vedere la Sezione 5), anche se ulteriori dati potrebbero andare persi. Tipicamente, le formazioni di anelli ANXA osservate nelle cellule non aderenti (Figura 2C supplementare) sono localizzate vicino sia al nucleo che alla periferia della cellula. Di conseguenza, si può osservare una struttura ad anello più allungata, che non è ottimale per l'analisi dei dati presentati. Inoltre, le cellule non aderenti sembravano essere più suscettibili alla morte cellulare in seguito a lesioni da PM. Inoltre, quando si considerano le lesioni derivanti dall'irradiazione di aggregati AuNP, è importante notare che queste lesioni possono essere più gravi e meno controllabili. Ciò è dovuto al significativo aumento del riscaldamento plasmonico, che può danneggiare una grande frazione della cellula. Di conseguenza, tali lesioni non sono state incorporate nell'analisi dell'anello ANXA5.
Inoltre, i risultati preliminari indicano che la rottura della membrana plasmatica mediante termoplasmonica provoca elevati livelli intracellulari di Ca2+ . Ciò è stato osservato anche all'irradiazione a bassa intensità di singole AuNP, suggerendo la permeabilizzazione del PM35, come illustrato nella Figura 4. L'afflusso di Ca2+ è stato osservato nelle cellule che esprimono una sonda di calcio legata alla membrana, GCaMP6s-CAAX, che subisce un cambiamento conformazionale all'afflusso di Ca2+ e, quindi, si può osservare un aumento della sua intensità64. L'intensità del calcio è stata quantificata per l'intera impronta della cellula nel tempo. Per eliminare il rumore di fondo, il livello di Ca2+ di fondo è stato sottratto prima della rottura della membrana e della riparazione post-membrana. L'intensità massima è stata determinata normalizzando l'intensità media di Ca2+ all'interno della cellula, risultando in una curva di intensità che mostra un rapido aumento iniziale dell'intensità di Ca2+ seguito da una diminuzione più lenta, come illustrato nella Figura 4B.
La cellula ha raggiunto un'intensità massima di calcio a ~ 6,6 s, il che è coerente con i risultati di Klenow et al.64, che hanno suggerito che il tempo del picco di intensità del calcio (t = tc) corrisponde al tempo necessario per la chiusura della ferita. Tuttavia, mentre sono necessarie ulteriori indagini per stabilire il meccanismo alla base della riparazione della membrana e della guarigione delle ferite, i risultati preliminari hanno mostrato che questo processo di Ca2+ è stato osservato esclusivamente nella cellula danneggiata e non nella cellula non lesa utilizzata come controllo positivo. Ciò conferma che la cellula ha sperimentato l'afflusso di Ca2+ in seguito alla rottura della membrana termoplasmonica, in cui il calcio intracellulare in eccesso viene attivamente pompato fuori dopo il successo della PMR poiché il livello di calcio intracellulare non è più in competizione con l'afflusso di Ca2+ , raggiungendo infine l'omeostasi cellulare64.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65776/65776fig04.jpg"> Figura 4: L'afflusso di calcio si verifica quando la membrana plasmatica di una cellula HEK293T viene rotta dalla termoplasmonica. Una serie di immagini confocali mostra due cellule (la cellula di interesse e una cellula non lesa utilizzata come controllo positivo) che esprimono la sonda di calcio legata alla membrana, GCaMP6s-CAAX. La barra della scala misura 10 μm. (A) Prima dell'irradiazione, alle 00:00 s, l'impronta delle due celle è visualizzata dalla linea tratteggiata grigia e il sito di irradiazione è indicato dal cerchio giallo. Dopo l'irradiazione laser, si osserva un rapido afflusso di Ca2+ , che raggiunge l'intensità massima a ~ 6,6 s, indicata dalla linea tratteggiata arancione, un punto temporale che si presume corrisponda al momento di chiusura della ferita64. (B) Il profilo di intensità del calcio ottenuto dalla sonda GCaMP6s-CAAX nella cellula lesa (linea blu) è stato confrontato con l'intensità di Ca2+ in una cellula vicina non danneggiata (linea tratteggiata grigia), mostrando un chiaro afflusso di Ca2+ esclusivamente in caso di interruzione del PM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65776/65776fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Il metodo di puntura termoplasmonica integra microscopia confocale, pinzette ottiche e nanoparticelle d'oro per studiare le risposte proteiche durante la riparazione della membrana plasmatica nelle cellule e nelle vescicole unilamellari giganti. La tecnica consente una puntura di membrana rapida e localizzata, consentendo l'identificazione di proteine chiave e dei loro ruoli funzionali nell'intricato meccanismo di riparazione della membrana plasmatica.

The cell membrane is crucial for cell survival, and ensuring its integrity is essential as the cell experiences injuries throughout its entire life cycle. ...

La nostra ricerca è focalizzata sullo studio dei meccanismi di riparazione della membrana plasmatica, sia nelle cellule viventi, ma anche nei sistemi biomimetici, chiamati vescicole unilamellari giganti. Siamo particolarmente interessati a comprendere il ruolo delle proteine come le annessine e a facilitare la riparazione superficiale. Questi intricati processi vengono esplorati utilizzando la nostra innovativa tecnica di puntura termoplasmonica.Attualmente, la riparazione cellulare è in fase di studio utilizzando laser a impulsi, combinati con la biologia molecolare, per identificare le proteine che vengono reclutate nel sito della lesione. Lo svantaggio di questo approccio è che è difficile controllare l'entità dei danni causati dall'uso di laser a impulsi. Attualmente, i nostri esperimenti presentano alcune sfide.Stiamo lavorando per mettere a punto l'allineamento del nostro fuoco laser con una nanoparticella, che è fondamentale per la precisione, e anche se può essere un po' complicato, stiamo anche lavorando attivamente per ridurre al minimo la formazione di nanobolle durante il processo di riscaldamento. La nostra ricerca ha dimostrato che le proteine annessine rispondono rapidamente all'afflusso di calcio, svolgendo un ruolo chiave nella riparazione della membrana, e rivelano diversi comportamenti delle singole annessine. Per comprendere meglio i meccanismi coinvolti, ci siamo rivolti a sistemi biomimetici, che ci hanno permesso di misurare con precisione come le annessine influenzano la flessione della membrana vicino a un foro di membrana.Il nostro protocollo risponde all'esigenza di lesioni localizzate precise della membrana nelle cellule sane. Fornisce preziose informazioni sui meccanismi di riparazione della membrana cellulare viva. Inoltre, ha permesso lo studio del ruolo biofisico delle proteine di membrana reclutate nella regione anulare vicino alla testa superiore nelle membrane biomimetiche.

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Research

JoVE Journal

Biology

A Thermoplasmonic Approach for Investigating Plasma Membrane Repair in Living Cells and Model Membranes

894 Views.  University of Copenhagen. La nostra ricerca è focalizzata sullo studio dei meccanismi di riparazione della membrana plasmatica, sia nelle cellule viventi, ma anche nei sistemi biomimetici, chiamati vescicole unilamellari giganti. Siamo particolarmente interessati a comprendere il ruolo delle proteine come le annessine e a facilitare la riparazione superficiale. Questi intricati processi vengono esplorati utilizzando la nostra innovativa tecnica di puntura termoplasmonica.Attualmente, la riparazione cellulare ?...

Video: Autore in primo piano: Esplorazione dei meccanismi di riparazione della membrana plasmatica con l'innovativa puntura termoplasmonica 

The cell membrane is crucial for cell survival, and ensuring its integrity is essential as the cell experiences injuries throughout its entire life cycle. To prevent damage to the membrane, cells have developed efficient plasma membrane repair mechanisms. These&#160;repair mechanisms can be studied by combining confocal microscopy and nanoscale thermoplasmonics to identify and investigate the role of key proteins, such as annexins, involved in surface repair in living cells and membrane model systems.
The puncturing method employs a laser to induce highly localized heating upon nanoparticle irradiation. The use of near-infrared light minimizes phototoxicity in the biological sample, while the majority of the absorption takes place in the near-infrared resonant plasmonic nanoparticle. This thermoplasmonic method has been exploited for potential photothermal and biophysical research to enhance the understanding of intracellular mechanisms and cellular responses through vesicle and cell fusion studies. The approach has shown to be complementary to existing methods for membrane disruption, such as mechanically, chemically, or optically induced injuries, and provides a high level of control by inflicting extremely localized injuries. The extent of the injury is limited to the vicinity of the spherical nanoparticle, and no detrimental damage occurs along the beam path as opposed to pulsed lasers using different wavelengths. Despite certain limitations, such as the formation of nanobubbles, the thermoplasmonic method offers a unique tool for investigating cellular responses in plasma membrane repair in an almost native environment without compromising cell viability.
When integrated with confocal microscopy, the puncturing method can provide a mechanistic understanding of membrane dynamics in model membrane systems as well as quantitative information on protein responses to membrane damage, including protein recruitment and their biophysical function. Overall, the application of this method to reduced model systems can enhance our understanding of the intricate plasma membrane repair machinery in living cells.

The thermoplasmonic puncture method integrates confocal microscopy, optical tweezers, and gold nanoparticles to study protein responses during plasma membrane repair in cells and giant unilamellar vesicles. The technique enables rapid and localized membrane puncture, allowing the identification of key proteins and their functional roles in the intricate plasma membrane repair machinery.