Jesper Nylandsted'e bize rekombinant annexin proteinleri ve annexinleri kodlayan plazmitler sağladığı için teşekkür etmek istiyoruz. Bu çalışma, Danimarka Bağımsız Araştırma, Doğa Bilimleri Konseyi (DFF-4181-00196), Novo Nordisk Vakfı Disiplinlerarası Sinerji Programı 2018 (NNF18OC0034936), Danimarka Kanser Derneği Bilimsel Komitesi (R90-A5847-14-S2), Lundbeck Vakfı (R218-2016-534) ve Lundbeck Vakfı Mükemmeliyet Merkezi (Nanotıpta Biyomembranlar) tarafından finansal olarak desteklenmiştir.

1. Hücre zarı delinme hazırlığı
<ol><li>Hücre tohumlama (1. Gün)<ol><li>İnsan embriyonik böbrek (HEK293T) hücrelerini, %70 birleşmeye ulaşana kadar% 5 CO2 nemlendirici inkübatöründe 37 ° C'de kültür ortamında kültürleyin.</li>
		<li>500 μL tripsin kullanarak hücreleri yüzeyden ayırın, 200.000 HEK293T hücresi sayın ve toplam hacmi 3 mL kültür ortamı olan bir kültür kabına tohumlayın. Hücreleri 37 °C'de %5CO2 nemlendirici inkübatörde 24 saat inkübe edin. NOT: Yemeğin ortasında hücre kümelenmesini önlemek için, hücreleri eşit şekilde yayın ve bulaşma verimliliğini azaltabileceğinden tabağı döndürmekten kaçının.</li>
	</ol></li>
	<li>Hücre transfeksiyonu (2. Gün) NOT: Transfekte edilen hücreler, transfeksiyondan sonra 48 saate kadar kullanılabilir.<ol><li>İlgilenilen plazmidi ve transfeksiyon reaktifini kullanmadan önce 5 saniye pipetleyin.</li>
		<li>Steril 2 mL'lik bir tüpte, aşağıdakileri belirli sırayla karıştırın: 500 μL indirgenmiş serum ortamı, 5 μL transfeksiyon reaktifi (plazmidden 4 kat daha fazla) ve 1.25 μL plazmit (1 μg / μL). NOT: Membran yırtılması üzerine kalsiyum akışını araştırmak için aynı prosedürü izleyin, ancak membrana bağlı kalsiyum sensörü probu GCaMP6-CAAX (1 μg/μL) kullanın.</li>
		<li>Transfeksiyon karışımını nazikçe ama iyice pipetleyin ve hücrelere damla damla eklemeden önce oda sıcaklığında (RT) 30 dakika inkübe edin.</li>
		<li>Transfeksiyon karışımını eklemeden önce, ortamı kültür kabından çıkarın, hücreleri 2 mL fosfat tamponlu salin ile nazikçe yıkayın ve tabağa 2000 μL azaltılmış serum ortamı ekleyin.</li>
		<li>Hücreleri, ortamı 3 mL kültür ortamına değiştirmeden önce% 5 CO2 nemlendirici inkübatöründe 37 ° C'de 2 saat 45 dakika boyunca transfeksiyon karışımı ile birlikte inkübe edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Altın nanopartikül (AuNP) çözeltisinin hazırlanması (2. Gün)<ol><li>200 nm AuNP stok çözeltisini 10 saniye boyunca 10. seviyede vorteksleyin (aparatın daha fazla spesifikasyonu için Malzeme Tablosuna bakın), 5 dakika (maksimum genlik) sonikat ve 10 saniye boyunca tekrar girdap yapın.</li>
		<li>150 μL AuNP'yi 850 μL damıtılmış su ile toplam 1 mL hacme karıştırın. NOT: Seyreltilmiş AuNP çözeltisi buzdolabında saklanabilir ve 1 aya kadar tekrar kullanılabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Deney yemeğinin hazırlanması (2. Gün)<ol><li>Mikrokuyu kabını 150 μL% 0.01 -% 0.1 hücre bağlantı çözeltisi ile kaplayın ve RT'de 15 dakika inkübe edin.</li>
		<li>Cam yüzeyi 500 μL damıtılmış su ile iki kez yıkayın ve ~10 dakika kurumaya bırakın.</li>
		<li>Kuru yüzeye damla damla 80 μL AuNP çözeltisi ekleyin. NOT: AuNP agregalarını en aza indirmek için kaplanmış cam yüzeye eklemeden önce seyreltilmiş AuNP çözeltisini vorteks (10 s), sonikat (5 dakika) ve vorteks (10 s).</li>
		<li>1.5 mL kültür ortamı vermeden önce ~ 10 dakika bekleyin. Çanağı gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Deney odasının hazırlanması (3. Gün) NOT: Deney odası 3. veya 4. günde hazırlanabilir; Ancak, aşağıdaki hazırlıkların deneyle aynı gün yapıldığından emin olun.<ol><li>Ortamı kültür kabındaki hücrelerden çıkarın ve hücreleri 2 mL fosfat tamponlu salin ile yıkayın. NOT: Bu adım, sonraki adımlara müdahale edebilecek herhangi bir kalıntı ortamı ve kalıntıları gidermek için gereklidir.</li>
		<li>Kuyucuğa 500 μL enzim bazlı hücre ayırma çözeltisi ekleyin ve hücreler kültür kabından ayrılana kadar 1-3 dakika inkübe edin.</li>
		<li>1,5 mL taze kültür ortamı ekleyin ve hücre kümeleri olasılığını en aza indirmek için homojen bir hücre çözeltisi elde etmek için hücre çözeltisini pipetleyin.</li>
		<li>Ortamı deneysel mikro kuyudaki AuNP'lerden dikkatlice çıkarın.</li>
		<li>Hücre çözeltisini (2 mL) mikrokuyuya ekleyin ve deneyi gerçekleştirmeden önce en az 5 saat inkübe etmesine izin verin. NOT: Optimum deney koşulları için, hücrelerin odanın ortasında kümelenmesine neden olabileceğinden, odayı döndürmekten kaçının.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Hücre zarı delinme deneyi
<ol><li>Deneyin optik ayarları<ol><li>Deneyleri, 1064 nm yakalama lazeri57 ile birleştirilmiş bir konfokal tarama mikroskobu kullanarak gerçekleştirin.</li>
		<li>Optik yakalamayı, 63 sayısal açıklığa (NA) sahip 1.2x suya daldırma objektifi kullanarak odak düzleminde gerçekleştirin.</li>
		<li>Odağın bir Airy diskinin boyutu olduğunu ve ışınlama lazerinin odak ışını genişliğinin yarıçap olarak ~540 nm olduğunu varsayalım.</li>
		<li>Alan başına lazer gücünü (W/cm2) hesaplayarak lazer gücünü (P) karşılık gelen lazer yoğunluğuna (I) dönüştürün.</li>
		<li>Fotoçoğaltıcı tüpler kullanılarak algılanan çoklu floresan sinyallerini ve saçılma sinyalleri aracılığıyla metalik NP'lerin aynı anda algılanmasını görselleştirmek için bir akusto optik ışın ayırıcı (AOBS) kullanın. NOT: Tüm konfokal sistemler, metalik NP'lerin yansıma görüntülemesine izin veren AOBS ile donatılmamıştır. Burada, diğer tespit biçimleri uygulanmalı veya hücrenin altındaki alanda NIR lazerin sıralı bir taraması denenebilir.</li>
		<li>Deney oturumları sırasında, mikroskop üzerine hücreler, moleküler floresan problar ve altın nanopartiküller içeren cam tabanlı açık bir oda monte edin.</li>
		<li>Piezoelektrik bir aşamaya monte edilmiş numuneyi çevirerek kapanı hücrelere göre hareket ettirin ve nanometre hassasiyetinde yanal hareketlersağlayın 16. NOT: Optik kapan sabit tutulur.</li>
	</ol></li>
	<li>Hücre zarı delinmesi için deneysel ayarlar<ol><li>Bir floresan proteini ile birleştirilmiş annexin plazmitleri ile transfekte edilmiş HEK293T hücreleri, cam yüzey üzerinde hareketsiz hale getirilen izole edilmiş AuNP'lerin üzerine yerleştirin (Şekil 1A).</li>
		<li>GFP floresan sinyalini görselleştirmek için bir Argon 488 nm lazer ve taramalı konfokal mikroskopta AuNP yansımasını gözlemlemek için bir HeNe 633 nm lazer kullanın.</li>
		<li>Tek bir AuNP'yi ~1 saniye boyunca ışınlamak için 1064 nm NIR lazerle çalışan optik cımbızı kullanın ve plazma zarını bozan sıcaklıkta önemli bir yerel artışa neden olun.</li>
		<li>Odaklanmış parçacığa 200-295 mW arasında ışınlama uygulayın, bu da önemli bir sıcaklık artışına neden olur. NOT: Belirli kuruluma bağlı olarak, odak noktasındaki lazer gücü belirtilen miliwatt'ın yaklaşık %20'sine ulaştığı için optiklerde önemli bir güç kaybı vardır. Özgül yoğunluk (W/cm2 cinsinden ölçülür) sistemin tam hizalamasına, özellikle odak boyutuna bağlıdır. Ek olarak, camın ısı iletimi hücre ve suyunkinden daha yüksektir ve sonuç olarak plazma zarına salınan ısı miktarı biraz azalır48,58.</li>
		<li>NIR lazer odak noktasının lokalizasyonunu uygun şekilde kalibre ederek etkili ve lokalize PM hasarı ve müteakip protein onarım yanıtı elde edin. Bu, aynı görüntüleme ortamında asılı duran tek bir AuNP'nin yakalanması ve seçilen AuNP'nin ışınlamadan önce odakta olmasını sağlayarak elde edilir. NOT: Nanopartikül, saçılma sinyali en keskin göründüğünde, yani konfokal mikroskopide gözlemlenirken net kenarlar sergilediğinde ve parçacığın etrafında bir hale olmadığında odakta olduğu kabul edilir (Şekil 2C (ii)).</li>
	</ol></li>
	<li>Hücre ve AuNP yoğunluk koşulları<ol><li>Plazma zarlarının üst üste binmesini önlemek için hücre kümeleri yerine tek hücreleri seçin. NOT: Hücreler, düzleştirilmiş bir morfoloji sergileyerek yüzeye yapıştırılmalıdır (Ek Şekil 1), bu da hücre çevresinin delinmesine izin verirken nükleer zarın zarar görmesini önler (Ek Şekil 2).</li>
		<li>Hücreleri protokole göre veya AuNP hücresel alımını önlemek için yerleşene ve düzleşene kadar inkübe edin. Aşırı inkübasyon süresinden kaçının ve PEGile AuNP'leri kullanarak AuNP endositozu olasılığını azaltın.</li>
		<li>Hareketsizleştirilmiş AuNP'lerin, agregaları önlemek için birbirinden yeterince aralıklı tek parçacıklar halinde bulunduğundan emin olun. Agregalar, termal gradyanda önemli bir artışa yol açabilir ve bu da hücrenin önemli bir bölümünü bozabilecek yüksek sıcaklıklara neden olabilir.</li>
		<li>Hücre sağlığını korumak için numuneyi her 1-2 saatte bir değiştirin. NOT: Uzun süreli maruz kalma, hücre sağlığında bozulmaya yol açabilir ve membran onarımı açısından yaralanmaya doğru yanıt verme yeteneklerini tehlikeye atabilir. Hücre sağlığındaki bu düşüş, hücreler daha küresel ve daha sert göründüğü ve sonunda hücre ölümüyle sonuçlandığı için tipik olarak hücre şeklindeki bir değişiklikle gözlenir.</li>
	</ol></li>
</ol>Ek Bilgiler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65776/Supplemental%20Information_updated.zip" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
3. Dev unilamellar vezikül (GUV) preparatı
<ol><li>Lipid karışımının hazırlanması<ol><li>1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfokolin (DOPC) ve 1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfo-L-serin (DOPS) lipitlerini 4:1'lik bir molar oranda birleştirerek GUV lipid bileşimini yapın (bkz. Tablo 1). Lipid stoğunu deneysel ihtiyaçlara göre 1,5 mL'lik cam şişelere ayırın ve -20 °C'de saklayın. NOT: Uzun süreli lipit koruması ve doymamış lipitlerin oksidasyonunu önlemek için, aliquoted şişelerdeki havayı argon ile değiştirin.</li>
		<li>Lipitleri karıştırmadan önce, kloroformla çözünmüş lipitler için kirletici madde içermediklerinden emin olmak için 50 μL ve 500 μL'lik bir cam veya metal şırıngayı beş kez kloroform ile iyice temizleyin. DİKKAT: Toksisitesi nedeniyle kloroformu çeker ocakta kullanın.<ol><li>Hesaplanan kloroform hacmini temiz bir amber cam şişeye aktarın, ardından her bir lipitin belirtilen miktarını aktarın (bakınız Tablo 1). NOT: Lipid stokları arasında çapraz kontaminasyonu önlemek için şırıngaların kloroform ile temizlendiğinden emin olun.</li>
			<li>Son olarak, membran boyasını ekleyin ve lipitleri pipetleyerek iyice karıştırın. Hazırlanan lipit karışımını daha sonra kullanmak üzere -20 °C'de saklayın; Karışım, önemli bir lipit hasarı olmadan 2-3 hafta boyunca canlı kalır. NOT: Karıştırma metalik veya cam bir şırınga ile yapılmalıdır. Lipitleri dondurucudan çıktıklarında daima buz üzerinde tutun.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Polivinil alkol (PVA) jelinin hazırlanması<ol><li>Weinberger ve ark.23tarafından açıklanan jel destekli hidrasyon yöntemini kullanarak GUV'leri küçük değişikliklerle hazırlayın.<ol><li>5 g PVA'yı 100 mL 50 mM sükroz, 25 mM NaCl ve 25 mM Tris (pH 7.4) içeren bir tamponda çözerek PVA jelini hazırlayın.</li>
			<li>PVA çözeltisini 85 °C'ye ısıtın ve şeffaf hale gelene kadar karıştırın. RT'ye soğumasını bekleyin ve daha sonra kullanmak üzere buzdolabında saklayın. NOT: PVA tamponda düzgün şekilde çözülmez ve bu nedenle 85 °C'ye kadar ısıtma gereklidir.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Cam slaytların hazırlanması<ol><li>Cam slaytları etanol ile temizleyin ve kurumaya bırakın. Ardından, cam yüzeyde kalan kontaminasyonu gidermek için slaytlara bir hava plazma temizleyici uygulayın.</li>
		<li>PVA kaplı cam slaytların hazırlanması<ol><li>Akışkanlığını artırmak için PVA jelini (%5) 30 dakika boyunca 60 °C'ye kadar ısıtın. Cam slaytın üzerine 90 μL ılık PVA uygulayın, eşit şekilde yayın ve 50 °C'de 50 dakika boyunca bir ısıtma kabininde kurumaya bırakın.</li>
			<li>PVA cam lam hazır olduğunda, bir cam veya metal şırınga kullanarak hazırlanan lipit karışımından 30 μL ekleyin ve iğnenin kenarını kullanarak ince bir film halinde yayın.</li>
			<li>Kloroform içeriğini hafif nitrojen basıncı altında buharlaştırarak lipit karışımını kurutun. Ayrıca, cam slaytları 1.5-2 saat vakum altında kurutun.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Bir odada büyüyen GUV'ler<ol><li>Hazırlanan cam slaytı kullanarak, tasarım olarak daha önce yayınlanmış bir rapora59 benzer şekilde kurum içi odayı monte edin.</li>
		<li>Ayrı bir 2 mL'lik tüpte, ilgilenilen rekombinant proteini (bu durumda, ANXA5 veya ANXA4), 80 mM sükroz, 70 mM NaCl ve 25 mM Tris-HCl'den (pH 7.4) oluşan bir büyüme tamponu (GB) ile 500 nM'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin.</li>
		<li>Hazneye 400 μL seyreltilmiş rekombinant protein çözeltisi ekleyin. GUV'lerin biriken lipit kaplamadan büyümesine izin vermek için odayı RT'de 1 saat inkübe edin. Negatif kontrol olarak protein hariç aynı tamponu kullanın. NOT: Tampon buharlaşmasını önlemek için hazneyi poliolefin filme sarın.</li>
		<li>Hazne içeriğinin 400 μL'sini 2 mL'lik bir tüpe aktararak GUV'leri toplayın.</li>
		<li>Toplanan çözeltiye 55 mM glikoz, 70 mM NaCl ve 50 mM Tris-HCl (pH 7.4) içeren 1 mL gözlem tamponu (OB) ekleyerek kapsüllenmemiş proteinleri GUV'lerin dışına çıkarın. Ardından, çözeltiyi 13 ° C'de 10 dakika boyunca 600 x g'da santrifüjleyin.</li>
		<li>Santrifüjlemeden sonra, 1 mL süpernatantı eşit hacimde gözlem tamponu ile değiştirin. GUV'leri nazik pipetleme yoluyla dağıtın ve GUV deneylerinde kullanılana kadar buzdolabında saklayın.</li>
	</ol></li>
</ol>4. GUV delinme deneyi
<ol><li>Oda hazırlığı<ol><li>Deney için 35 mm'lik cam tabanlı bir tabak kullanın. GUV'lerin yüzeye yapışmasını ve patlamasını önlemek için, yüzeyi 15-30 dakika boyunca β-kazein (5 mg / mL) ile kaplayın.<ol><li>β-kazein çözeltisi için, 0.1 g proteini 20 mM Tris (PH 7.5) ve 100 mM NaCl'lik 20 mL'lik bir tamponda çözün. Protein çözeltisini süzün, küçük şişelere ayırın ve daha sonra kullanmak üzere dondurun.</li>
		</ol></li>
		<li>Yüzeydeki fazla serbest β-kazeinleri çıkarmak için hazneyi gözlem tamponu ile iki kez yıkayın ve RT'de kurumaya bırakın.</li>
		<li>Ayrı bir 2 mL'lik tüpte, toplanan GUV'leri OB ile karıştırın. İstenen nihai konsantrasyon için karışımaCaCl2 ekleyin (bu durumda 200 μM).</li>
		<li>Karışıma 150:100 oranında 150 nm altın nanokabuklar (AuNS'ler) ekleyin. Nihai karışım 250 μL GUV, 225 μL OB, 20 μL CaCl2 (5 mM) ve 5 μL belirtilen AuNS'lerden oluşur.</li>
	</ol></li>
	<li>Deney düzeneği<ol><li>Karışımı hazneye aktarın ve mikroskop tablasına monte edin. Haznenin boyutuna bağlı olarak, karışımın tamamını veya karışımın bir kısmını ekleyin. NOT: Kalsiyum iyonları zardan geçebildiğinden ve eklerin zarın iç broşürüne bağlanmasına aracılık edebildiğinden zamanlama çok önemlidir.</li>
		<li>Hücre delme deneyleri için kullanılan aynı optik kurulumu kullanın.</li>
		<li>~ 125 mW'lık bir lazer gücü uygulayarak tek bir AuNS'yi bir GUV'nin yakınında veya yüzeyinde yakalamak için optik cımbızı kullanın.</li>
		<li>Ardından, lazer gücünü ~ 300 mW'a yükseltin. Bu, hedef bölgedeki zarı bozan ve delinen oldukça lokalize bir sıcaklık artışı üretir. NOT: AuNS'ler, katı AuNP'lere kıyasla daha küçük bir boyutu korurken daha yüksek bir geçici sıcaklık artışı üretme yetenekleri nedeniyle GUV deneyleri için tercih edilir.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Table 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65776/65776table1v2.jpg"> Tablo 1: GUV bileşimini belirleme tablosu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65776/Table%201.zip" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
5. Hücre ponksiyon deneylerinde ANXA yanıtının ölçümleri ve veri analizi
<ol><li>Görüntüleri analiz etmek ve Mie'nindenklemleri 60,61'e dayalı olarak AuNP sıcaklık profilini (Şekil 1D, E) hesaplamak ve çizmek için MATLAB'ı kullanın.</li>
	<li>Ek olarak, FIJI ImageJ dağılımını62,63 kullanarak tüm konfokal görüntüleri işleyin.</li>
	<li>ANXA halka yarıçapının hesaplanması<ol><li>Membran yaralanma analizinden önce ham verilerden delinmiş alanı içeren ilgili bölgeyi kırpın.</li>
		<li>ANXA halkasının merkezini ve dış çevresini manuel olarak işaretleyerek her görüntüyü işlemek için şirket içi MATLAB iş akışını kullanın.<ol><li>İlgilenilen bölge için işleme sınırlarını belirlemek için bu işaretleri kullanın. NOT: Alan daha sonra ayarlanan sınırlar dahilinde radyal olarak işlenir ve merkeze belirli bir mesafedeki floresan yoğunluğu, aynı merkez mesafesine sahip tam daire üzerindeki ortalamadır. Bu numara her yarıçap adımı için saklanır.</li>
			<li>Şekil 3A'da gösterildiği gibi, sırasıyla Rext ve R int'e karşılık gelen yarı maksimumda (FWHM) maksimumu (Rp) ve tam genişliği belirlemek için tüm tarama aralığı boyunca ortalama yoğunlukları tek boyutlu bir Gausseğrisine sığdırmak için iş akışını kullanın.</li>
		</ol></li>
		<li>Son olarak, ANXA halkasının yarıçapını, MATLAB iş akışı tarafından oluşturulan çizim tarafından verilen halkanın merkezinden Rext'e olan mesafeye göre belirleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Üç boyutlu ANXA halka yarıçapı hesaplaması<ol><li>Adım 5.1'deki ile aynı MATLAB analiz iş akışını kullanarak ANXA halka yarıçapındaki değişikliği z yönünde izleyin. İş akışını, Şekil 3C, E'de gösterildiği gibi, membran sargısı boyunca birkaç konfokal z kesitine uygulayın.</li>
		<li>Şekil 3F'de gösterildiği gibi, z kesitleri üzerindeki yarıçaplardaki değişime bağlı olarak her yara için eğimi hesaplayın.</li>
	</ol></li>
	<li>ANXA halka yarıçapının zaman evrimi<ol><li>Benzer şekilde, adım 5.1'deki MATLAB analiz iş akışını kullanarak termoplazmonik membran delinmesinden sonra ANXA halkasının ANXA halkasının gelişimini izleyin. Şekil 3D, G, H'de gösterildiği gibi, zaman içindeki değişiklikleri izlemek için ardışık zaman noktalarını analiz edin.</li>
	</ol></li>
</ol>

Plazma Membran Onarımının İncelenmesi için Lazer Kaynaklı Termoplazmonik Delinme

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Çalışma, termoplazmonik yaklaşımı, canlı hücrelerdeki protein tepkilerini keşfetmek ve zar bozulmasını takiben zarları modellemek için umut verici bir teknik olarak vurgulamaktadır. Bu yöntem sadece protein alımı hakkında değil, aynı zamanda protein-zar dinamiğinde yer alan proteinlerin biyofiziksel işlevi hakkında da kapsamlı bilgi sağlar. Sonuç olarak, yüzey onarımından sorumlu moleküler bileşenlerin tanımlanmasını kolaylaştırır ve plazma membran onarımının karmaşık ancak hayati mekanizmasının anlaşılmasını ilerletir. Membran bozulmasını indüklemek için mekanik, kimyasal ve optik teknikler gibi çeşitli yöntemler mevcut olsa da, bu yöntemler, hücrelere spesifik olmamak, hücre zarında birden fazla yaralanma oluşturmak veya membranda önemli hasara neden olmak ve yüksek güçlü darbeli lazerler kullanırken lazer yolu boyunca dahili hücresel materyali kesmek gibi sınırlamalardan muzdariptir. Konfokal mikroskopi ve optik cımbızın entegrasyonu en kapsamlı bilgileri sunarken, alternatif görüntüleme yöntemleri de kullanılabilir. Örneğin, plazmonik nanopartikülün görüntülenmesi yansıma mikroskobu kullanılarak elde edildiğinden, Leica konfokal mikroskoplarda yerleşik bir görüntüleme modu, karanlık alan mikroskobu 65,66, iSCAT 67,68 gibi diğer saçılma yöntemleri veya nanoparçacığın floresan etiketlemesi gibi ek görüntüleme teknikleri, AuNP görselleştirmesi için kullanılabilir, ancak bu, yöntemin uygulanabilirliğini sınırlayabilir.
Sunulan yöntem ayrıca model membranlarda nanoskopik delikler indükleyebilir ve farklı ekler arasındaki sinerji etkilerinin araştırılmasını sağlar. Bu, farklı şekilde etiketlenmiş rekombinant eklerin, örneğin sırasıyla RFP ve GFP'nin kapsüllenmesi ve ardından termoplazmonik ponksiyonun kapsüllenmesiyle elde edilir. Bu model sistemi, Şekil 2D'de gösterildiği gibi, annexinlerin serbest kenarların yakınındaki membranlarla nasıl etkileşime girdiğine dair fikir verir. Bununla birlikte, hücrelerden farklı olarak, GUV'lere açılan delikler genişlemeye devam eder, ardından vezikülün dengesizleşmesi devam eder. Konfokal mikroskopi kullanarak delik evrimini görüntülemek, delik çapının hızlı genişlemesi nedeniyle zor olabilir, ancak zaman içinde birkaç z-yığını yakalanarak gerçekleştirilebilir. Alternatif bir yöntem, daha hızlı görüntüleme için dönen bir disk konfokal kullanmak olabilir. Ayrıca, termoplazmonik yaklaşım, 20 °C ile 30 °C arasındaki numune sıcaklıklarında genellikle iki ila üç olmak üzere tek hücrelere veya GUV deneylerine uygulandığında tipik olarak saatte sınırlı sayıda optimal sonuç verir. Protein-membran dinamiğinin en doğru gözlemini elde etmek için, hücrelerin HEPES içeren bir tamponda tutulması ve numunenin her saat değiştirilmesi önerilir. Alternatif olarak, deneyler bir hücre inkübasyon odasında, yani %5CO2 ile 37 ° C'lik sabit bir sıcaklıkta gerçekleştirilerek deney penceresi uzatılabilir. Ayrıca, bu yaklaşımın stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (STORM) gibi diğer görüntüleme teknikleriyle birleştirilmesi, membran onarımında yer alan anahtar proteinlerin biyofiziksel işlevinin ve etkileşiminin tek molekül düzeyinde daha derin bir şekilde anlaşılmasını sağlayabilir. Bu, yara geometrisi ve annexin proteinlerinin yeri de dahil olmak üzere yaralanma bölgesi hakkında ayrıntılı bilgi sağlayabilir ve ayrıca membran yüzeyinin onarımında yer alan diğer kilit oyuncuları tanımlayabilir.
Membran yaralanmasını indüklemede maksimum etkinlik ve hassasiyet elde etmek için, her deneyden önce lazer odağının konumunu doğrulamak ve lazer odağının eksenel konumunun konfokal odakla çakıştığından emin olmak zorunludur. Bu hizalama, AuNP görüntüleme sırasında yoğunluğu optimize eder, bu da maksimum yerel sıcaklık artışına ve bunun sonucunda daha düşük lazer gücünde membran yaralanmasına yol açar. Bu işlem manuel olarak yürütülür ve bu nedenle odak, parçacığın konumuyla çakışan bir konuma manuel olarak çevrildiğinden, membran yırtılma verimliliğindeki değişkenliğe karşı hassastır. Bazı ticari sistemlerde olduğu gibi, yansıma modu olmayan mikroskoplarda, lazer odağının ve partikülün birlikte lokalizasyonu zor olabilir. Bu gibi durumlarda, alternatif görüntüleme modları (örneğin, parlak alan) kullanılabilir ve beklenen parçacık konumu etrafında yavaş bir raster taraması gerçekleştirilebilir. Düşük lazer gücünün yalnızca membran geçirgenliğine neden olabileceğine dikkat edilirken, yüksek lazer gücünün, cam yüzey bir soğutma etkisine sahip olsa bile, NP çevresinde suyun kaynama noktasını aşan sıcaklıklar üretebileceği unutulmamalıdır. NP'leri çevreleyen nanokabarcıkların oluşumunun 200 °C ile 300 °C25,48 arasında meydana geldiği tahmin edilmektedir, burada patlayıcı ısı ya lazer odağından parçacık yer değiştirmesine ya da parçacık parçalanmasına neden olabilir. Ek olarak, ısıtma sırasında nano veya mikro kabarcıkların oluşması bu yöntem için bir zorluk teşkil eder. Hava arayüzleri membranları ıslattığından ve istenmeyen bir durum olan protein destabilizasyonuna neden olabileceğinden, membran onarımını araştırırken ısıtmayı sınırlamak zorunludur. Özellikle, altın nanokabuklar yüksek sıcaklıklara tolerans göstermez ve yüksek çözünürlüklü mikroskopi58 ile gösterildiği gibi bu koşullar altında bozulur.
Bu makale, hem hücrelere hem de model membranlara uygulanabilen, membranlarda yüksek oranda lokalize delikler gerçekleştirmek için termoplazmonik kullanmak için ayrıntılı bir protokol sağlar. Isınma derecesini daha da azaltmak için, NIR ışığıyla rezonansa giren daha küçük nanopartiküller kullanılabilir, bu da endozomlarda, endoplazmik retikulumda ve nükleer zarfta hücre içi deliklere olanak tanır. Çubuklar ve nanomatruşkalar48 dahil olmak üzere bu tür nanopartiküller, hücre yüzeyinde kolayca alınan ve çekirdeğe doğru kaçakçılığı yapılan endositozlu altın nanopartikülleri hedefleyerek nükleer zarf onarımını araştırmak için kullanılabilir69. Genel olarak, bu teknik, PMR'de yer alan temel moleküler bileşenlerin tanımlanmasını ve incelenmesini, hücrelerin canlılığını korurken biyofiziksel işlevlerini ve rollerini aydınlatmayı sağlar.

Hem fiziksel bir bariyer hem de bir sinyal platformu görevi gören hücre zarı, hücrenin hayatta kalması için hayati önem taşır1. Tüm hücre döngüsü boyunca, plazma zarı (PM) mekanik 2,3,4,5 ve kimyasal6 stres kaynaklı yaralanmalar gibi hasara maruz kalır. Membran bütünlüğünü korumak ve hücrenin hayatta kalmasını sağlamak için hücre, sağlam plazma membran onarımı (PMR) mekanizmaları geliştirmiştir. Bu mekanizmalar, hücre iskeletinin yeniden düzenlenmesi, membran füzyonu ve membran değiştirme stratejileri7,8,9,10,11 gibi çeşitli stratejilere bağlıdır ve bunların tümü spesifik proteinlerin işe alınmasına dayanır. Özellikle, annexin protein ailesinin üyeleri, PMR 1,9,12,13,14,15,16 süreçleriyle ilişkili anahtar proteinler olarak tanımlanmıştır. PM hasarını takiben, hücre, hücrenin hayatta kalması için acil bir tehdit oluşturan bir kalsiyum iyonu akışı (Ca2 +) yaşar17. Ca2+ akışına yanıt olarak, ağırlıklı olarak sitozolde bulunan annexin proteinleri, PMR stratejilerinin bir parçası olarak hasarlı plazma zarının iç broşürünebağlanır 18. Annexin A2 (ANXA2), disferlin eksikliği olan kas distrofisinde PMR ile ilişkilendirilen annexin ailesinin ilk üyelerinden biriydi ve hücre içi vezikülleri yaralanma bölgesi 5,19,20,21 yakınındaki PM'ye kaynaştırarak onarıma aracılık etmesi önerildi. Daha sonra, ek22'ye çeşitli işlevler atfedildi ve PMR'deki rolleri son 20 yılda artan bir ilgi gördü. Bununla birlikte, PMR'deki eklerin kesin rolü tam olarak anlaşılmamıştır 15,18,21,22.
Bu makale, konfokal mikroskopi, optik cımbız ve altın nanopartiküllerin (AuNP'ler) bir kombinasyonunu kullanarak protein-membran etkileşimini ve membran dinamiklerini kontrollü ve oldukça lokalize bir şekilde araştırmak için bir yöntem önermektedir. Bu yöntem, membran hasarına veCa2+ akışına yanıt olarak protein, lipid ve küçük molekül etkileşimlerinin kantitatif çalışmasını sağlar. Membran onarımı sürecinde yer alan bileşenlerin karmaşıklığına ve çokluğuna rağmen, membran dinamiği ve annexin proteinlerinin membran bozulmasına tepkisi hakkında daha derin bir mekanik anlayış kazanmak için plazma membranını taklit eden basitleştirilmiş membran sistemleri kullanılmıştır16. Dev unilamellar lipid vezikülleri (GUV'ler), belirli bir lipid bileşimine sahip model membran sistemi olarak seçildi. GUV'ler, Weinberger ve ark.23 tarafından tarif edildiği gibi, jel destekli hidrasyon yöntemi, özellikle polivinil alkol jel hidrasyonu kullanılarak üretildi ve bu, annexinlerin GUV'lere verimli bir şekilde kapsüllenmesine izin verdi.
Metalik nanopartiküller (NP'ler) üzerinde yakın kızılötesi (NIR) lazer ışınlamasının kullanılması, NP'nin önemli ölçüde ısınmasına neden olur ve bu da onu biyomedikal uygulamalarda kullanılan yerel bir ısı kaynağı oluşturmak için etkili bir yöntem haline getirir24. Yöntem başlangıçta hem 2D hem de 3D biyomimetik tahlillerde tek bir AuNP'yi çevreleyen sıcaklığı doğrudan ölçmek için kullanıldı. Bu tahlillerde25,26, plazmonik nanopartiküller, desteklenen bir lipid çift tabakası üzerinde ışınlandı veya yerel ısıtma üzerine yerel bir termal faz geçişine uğrayan GUV'lerin yakınında optik olarak hapsedildi, bu da partikül etrafındaki tam sıcaklık profilinin ölçülmesini ve kontrolünü sağladı. Bu referans sıcaklık profili, biyolojik numuneler araştırılırken veya manipüle edilirken kullanılmıştır. Yöntemdeki daha ileri ilerlemeler, membranlarda(27) nanoskopik gözeneklerin indüksiyonunu kolaylaştırarak vezikül ve hücre füzyonunaizin vermiştir 28,29. Diğer çalışmalar, yeni hibrit veziküller oluşturarak GUV'lerde29 ve transmembran proteinlerde30 periferik membran proteinlerinin davranışını araştırırken, hücresel yanıtları veya gen ekspresyonunu kontrol etmek ve incelemek için hücreye özgü ilaç dağıtımı da araştırılmıştır 28,29,31,32,33. Son zamanlarda, yöntem membran hasarına protein yanıtlarını araştırmak için kullanılmıştır 32,34,35.
Hücresel yanıtları ve membran onarımını araştırmak için plazma membranını bozmak için çeşitli yöntemler mevcuttur. Bunlar, tümü hücre zarını mekanik olarak bozabilen mikroiğne deliklerini, mikroboncuk sallamayı ve hücre kazımayı içerir 14,36,37. Kimyasal olarak indüklenen hasar, lipid çift tabakasını kararsızlaştıran ve plazma zarı boyunca membran gözenekleri oluşturan deterjanlar5,38 veya bakteriyel toksinler39,40 eklenerek elde edilebilir. Ayrıca, plazmonik nanopartiküller 42,43,44,45 ile kombinasyon halinde annexin proteinleri 5,14,21,41 gibi PMR bileşenlerini incelemek için sürekli dalga ve darbeli lazerler tarafından optik olarak indüklenen yaralanmalar kullanılmıştır.. Yüksek güçlü darbeli lazerlerin verimliliğine rağmen, ışın yolu boyunca hücrenin iç kısmında önemli yaralanmalara ve hasara neden olabilirler. Ayrıca, darbeli lazer ışınlaması üzerine biyolojik maddede meydana gelen ayrıntılı değişiklikler ve iyi tanımlanmış bir gözenek oluşturup oluşturmadığı daha fazla araştırılmayı beklemektedir. Bu makalede, iç yapılara önemli bir zarar vermeden PM'de nanoskopik delikleri kontrollü bir şekilde34,35 indüklemek için termoplazmonik kullanan alternatif bir yöntem sunulmaktadır. Bu, plazmonik NP'lerin yüksek oranda odaklanmış bir NIR lazere maruz bırakılmasıyla gerçekleştirilir, bu da 200 °C'yi aşan sıcaklıklara kolayca ulaşabilen ve küçük nanoskopik patlamalara yol açabilen son derece lokalize bir sıcaklık artışına neden olur 25,46,47. Bu işlem, lazer yoğunluğunun yanı sıra NPs48'in boyutu, şekli ve bileşimi ayarlanarak kontrol edilebilir. Araştırmacılar, bu tekniği kullanarak, proteinlerin canlı hücrelerde PM onarımındaki rolünü keşfedebilirler, bu da hücre canlılığından ödün vermeden ektrin proteinlerinin membran onarımına katılımı ile ilgili cevaplanmamış bazı soruların ele alınmasına yardımcı olabilir.
Plazmonik nanopartiküllerin optik tuzağı, önceki çalışmalarla iyi bir şekilde belirlenmiştir 25,49,50,51,52; bununla birlikte, nanopartiküllerin 53,54,55 termoplazmonik özelliklerine ilişkin ek bilgiler ek materyallerde elde edilebilir (Ek Dosya 1). Termoplazmonik yöntem, hücresel yanıt ve onarım mekanizmalarını incelemek amacıyla PM'de nanoskopik delikler oluşturmak için kullanılabilir. Daha doğrusu, delinme, Şekil 1A ve B'de gösterildiği gibi, membrana yakın olan AuNP'lerin optik ısıtması yoluyla elde edilebilir. Bu lokalize delinme, bir kalsiyum sensörü tarafından doğrulanan ve böylece PMR makinesini harekete geçiren Ca2+ akışına izin verir. Canlı hücre deneyleri için, ANXA2'nin PMR'deki rolünü konfokal mikroskopi ile izlemek için 200 nm çapındaki AuNP'ler hücrenin altındaki yüzeyde hareketsiz hale getirildi. 1064 nm dalga boyuna sahip NIR lazeri (Şekil 1A,B), AuNP'yi ışınlar, plazmonik özelliklerinden yararlanır (Şekil 1C), biyolojik saydamlık penceresinde önemli ölçüde yerel ısınmaya (Şekil 1D) neden olurkenhücrenin kendisine minimum zarar verir. AuNP'yi çevreleyen yüksek sıcaklık bölgesi, Şekil 1E'de gösterildiği gibi, NP'nin yarıçapına karşılık gelen bir mesafede hızla %30-40 oranında azalır ve her üç boyutta da son derece sınırlı bir yaralanmaya izin verir.
Ek Dosya 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65776/Supplementary%20File%201_updated.zip" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65776/65776fig01.jpg"> Şekil 1: Deneysel yöntemin şematik taslağı. (A) ANXA ile transfekte edilmiş hücreler, yüzeydeki hareketsizleştirilmiş altın nanopartiküllerin (AuNP'ler) üzerine yerleştirilir veya (B) kapsüllenmiş ANXA'ya sahip dev unilameller veziküller (GUV'ler), AuNP'ler içeren bir ortamda süspanse edilir. (C) Tek bir AuNP, gelen elektromanyetik alan ile iletim elektronları arasındaki etkileşimin NP içindeki elektronların toplu salınımına yol açtığı NIR optik tuzağı tarafından ışınlanır. (D) Bu işlem, sıcaklıkta oldukça sınırlı ancak önemli bir artışa neden olur. NP yüzeyindeki sıcaklığı tahmin etmek için Mie teorisi kullanılır ve 200 nm çapında ve lazer yoğunluğu I = 6.36 x 108 W/cm2 olan bir AuNP için bir (E) sıcaklık profili hesaplanır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65776/65776fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Hücre zarı üzerindeki termal etkiyi en aza indirmek için, AuNP'ler yalnızca ~1 saniye boyunca ışınlanır. Bu, tipik olarak ortaya çıkması için daha fazla zaman gerektiren proteinlere verilen zararı azaltan geçici ve yerel bir ısınma patlamasına neden olur. Membran delinmesi üzerine, eklavin proteinleri saniyenin çok küçük bir bölümünde toplanır ve birkaç saniye içinde, yaralanma bölgesi çevresinde eklavin halkası benzeri bir iskele oluşur (Şekil 2). Bu yaklaşım aynı zamanda, onarım süreçlerinin tam şemasına ışık tutmak amacıyla ANXA5'in hem canlı hücrelere hem de model membranlara16 katılımını araştırmak için de uygulanmıştır. Birincil odak noktası, çeşitli annexin proteinlerinin ilişkili alımı üzerinde olsa da, onarım mekanizmasının biyofiziksel yönleri henüz aydınlatılamamıştır.
Önerilen yöntemi tam olarak uygulamak için üç temel bileşen gereklidir: konfokal mikroskopi, optik cımbız ve metal nanopartiküller. Optik cımbız, AuNP'leri yakalamak için kullanılır ve bunların yapımı, Neuman ve ark.49 tarafından özetlenen prosedür izlenerek gerçekleştirilebilir. Bununla birlikte, bir optik cımbız oluşturmanın çok zor olduğu kanıtlanırsa, hücrelerin altında hareketsiz hale getirilen AuNP'leri ışınlamak için sıkıca odaklanmış bir NIR lazeri kullanılabilir. Bu protokol için küresel AuNP'ler seçilirken, NIR bölgesi48 içinde oldukça lokalize bir sıcaklık gradyanı elde etmek için ayarlanabilir absorpsiyon spektrumlarına sahip çeşitli plazmonik parçacıklar da kullanılabilir.
Floresan görüntüleme, floresan etiketli proteinlerin rolünü gözlemlemek için gereklidir ve bu nedenle, toplam iç yansıma mikroskobu (TIRF)56 , konfokal görüntülemeye bir alternatif olarak düşünülebilir. Bununla birlikte, bu teknik sadece yüzey görüntülemeye izin verir ve model membran vezikül deneyleriyle uyumlu olmaz. Sonuç olarak, hem optik cımbız hem de konfokal mikroskop, nanopartikülün kesin lokalizasyonu ve hücre hasarını çevreleyen lokal alanın ayrıntılı olarak araştırılması için gereklidir. Nanoparçacığı kırınım sınırlı bir lazer odağı ile etkili bir şekilde ışınlamak için nanoparçacığı görselleştirmek gerekir. Bu, Leica konfokal mikroskopların standart bir görüntüleme özelliği olan yansıma mikroskobu ile en iyi şekilde elde edilebilir. Bununla birlikte, yansıma veya saçılma görüntüleme mevcut değilse, daha az verimli floresan AuNP etiketlemesi gibi alternatif yöntemler düşünülebilir.
Özetle, bu çalışmada sunulan yüksek oranda kontrol edilebilir ve lokalize termoplazmonik yöntem, canlı hücrelerde hücresel yanıtlarda ve PM onarım mekanizmalarında yer alan moleküler bileşenleri araştırmak için mükemmel bir platform olarak hizmet etme potansiyeline sahiptir. PM hasarı üzerine protein yanıtını incelemeye ek olarak, bu yaklaşım vezikülleri lokal olarak delmek için de kullanılabilir, böylece hem protein-protein hem de protein-membran dinamiklerinde protein yanıtının araştırılmasını sağlar. Ayrıca bu yöntem, zarlar bozulduğunda proteinler, lipitler ve küçük moleküller arasındaki etkileşimlerin kantitatif bir analizine izin verir. Toplu olarak, bu ilerlemeler, karmaşık ve karmaşık plazma membran onarım makineleriyle ilgili çözülmemiş bazı sorulara ışık tutma potansiyeline sahiptir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1064 nm trapping laser</td>
			<td>Spectra Physics</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Spectra Physics J201-BL-106C, Nd: YVO4 NIR laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>160 nm Gold Nanoshells</td>
			<td>NanoComposix</td>
			<td>NCXGSIR150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 nm Gold Nanoparticles</td>
			<td>BBI Solutions</td>
			<td>EM.GC200/7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass surface MatTex microwell</td>
			<td>MATTEK</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber-glass vials</td>
			<td>Supelco Sigma Aldrich</td>
			<td>243438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin A2 plasmids</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin A4 recombinant-protein&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N-terminal GFP tagged ANXA4 received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin A5 recombinant-protein&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N-terminal GFP tagged ANXA5 received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta-casein</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>C6905-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Suprlco (sigma Aldrich)</td>
			<td>10035-04-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5702</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture dish (Nunclon Delta Surface)</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>150460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DID cell-labelling Solution</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15230-089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375C</td>
			<td>Dissolved in chloroform&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPS</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840035C</td>
			<td>Dissolved in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eage&#39;s Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11995065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI ImageJ distribution</td>
			<td>ImageJ2</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GCaMP6s-CAAX</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>Received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11573397</td>
			<td>10% of the culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>PROLABO</td>
			<td>24 374.297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringes</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>N/A</td>
			<td>50 and 500 microliters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harrick Plasma Cleaner PDG-002</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cells</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>Received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Acousto-Optical Beam Splitter (AOBS)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica PL APO 63x water immersion objective, NA = 1.2</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP5 confocal scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15338030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab</td>
			<td>The Mathworks, Inc., Natick, Massachusetts, United States</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM Reduced-Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11058021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>1% of the culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezoelectric stage (PI 731.20)</td>
			<td>&#160;Physik Instrumente (Germany)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920-100ML</td>
			<td>0.01-0.1% for coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>363065-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>round glass slide 25 mm &#216;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-1584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator Brandson 2800</td>
			<td>Brandson</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 tissue culture flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353108</td>
			<td>Blue Vented cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>15567-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1285901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11590626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;VWR Mixer mini vortex 230V EU</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&#160;12620-84</td>
			<td>&#160;ECN: 444-2790, SN: 150713022</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a thermoplasmonic approach for investigating plasma membrane repair in living cells and model membranes

Hücre zarı, hücrenin hayatta kalması için çok önemlidir ve hücre tüm yaşam döngüsü boyunca yaralanmalar yaşadığından bütünlüğünün sağlanması çok önemlidir. Zarın zarar görmesini önlemek için, hücreler verimli plazma zarı onarım mekanizmaları geliştirmiştir. Bu onarım mekanizmaları, canlı hücrelerde ve membran model sistemlerinde yüzey onarımında yer alan annexinler gibi anahtar proteinlerin rolünü belirlemek ve araştırmak için konfokal mikroskopi ve nano ölçekli termoplazmoniklerin birleştirilmesiyle incelenebilir.
Delme yöntemi, nanopartikül ışınlaması üzerine yüksek oranda lokalize ısıtmayı indüklemek için bir lazer kullanır. Yakın kızılötesi ışığın kullanılması, biyolojik numunedeki fototoksisiteyi en aza indirirken, absorpsiyonun çoğunluğu yakın kızılötesi rezonans plazmonik nanopartikülde gerçekleşir. Bu termoplazmonik yöntem, vezikül ve hücre füzyon çalışmaları yoluyla hücre içi mekanizmaların ve hücresel yanıtların anlaşılmasını geliştirmek için potansiyel fototermal ve biyofiziksel araştırmalar için kullanılmıştır. Yaklaşımın, mekanik, kimyasal veya optik olarak indüklenen yaralanmalar gibi membran bozulması için mevcut yöntemlerin tamamlayıcısı olduğu ve son derece lokalize yaralanmalara neden olarak yüksek düzeyde kontrol sağladığı gösterilmiştir. Yaralanmanın kapsamı, küresel nanopartikülün çevresi ile sınırlıdır ve farklı dalga boyları kullanan darbeli lazerlerin aksine, ışın yolu boyunca zararlı bir hasar meydana gelmez. Nanokabarcıkların oluşumu gibi belirli sınırlamalara rağmen, termoplazmonik yöntem, hücre canlılığından ödün vermeden neredeyse doğal bir ortamda plazma membran onarımındaki hücresel yanıtları araştırmak için benzersiz bir araç sunar.
Konfokal mikroskopi ile entegre edildiğinde, delme yöntemi, model membran sistemlerindeki membran dinamiğinin mekanik bir anlayışının yanı sıra, protein alımı ve biyofiziksel işlevleri de dahil olmak üzere membran hasarına protein tepkileri hakkında nicel bilgiler sağlayabilir. Genel olarak, bu yöntemin indirgenmiş model sistemlere uygulanması, canlı hücrelerdeki karmaşık plazma zarı onarım mekanizmaları hakkındaki anlayışımızı geliştirebilir.

The cell membrane, serving both as a physical barrier and a signaling platform, is vital for cell survival1. Throughout its entire cell cycle, the plasma membrane (PM) is subjected to damage, such as mechanical2,3,4,5 and chemical6 stress-induced injuries. To maintain membrane integrity and ensure cell survival, the cell has developed robust plasma membrane repair (PMR) mechanisms. These mechanisms depend on various strategies, such as cytoskeleton reorganization, membrane fusion, and membrane replacement strategies7,8,9,10,11, all of which rely on the recruitment of specific proteins. Notably, members of the annexin protein family have been identified as key proteins associated with the processes of PMR1,9,12,13,14,15,16. Following PM injury, the cell experiences an influx of calcium ions (Ca2+), which poses an immediate threat to the cell&#39;s survival17. In response to Ca2+ influx, annexin proteins, which are predominantly located in the cytosol, bind to the inner leaflet of the damaged plasma membrane as a part of the PMR strategies18. Annexin A2 (ANXA2) was one of the first members of the annexin family to be associated with PMR in dysferlin-deficient muscular dystrophy and was suggested to mediate repair by fusing intracellular vesicles to the PM near the injury site5,19,20,21. Subsequently, several functions have been attributed to annexins22, and their role in PMR has garnered increased attention over the past 20 years. However, the exact role of annexins in PMR remains not fully understood15,18,21,22.
This article proposes a method for investigating protein-membrane interaction and membrane dynamics in a controlled and highly localized manner, utilizing a combination of confocal microscopy, optical tweezers, and gold nanoparticles (AuNPs). This method enables the quantitative study of protein, lipid, and small molecule interactions in response to membrane damage and Ca2+ influx. Despite the complexity and multiplicity of components involved in the process of membrane repair, simplified membrane systems that mimic the plasma membrane have been employed to gain a deeper mechanistic understanding of membrane dynamics and the response of annexin proteins to membrane disruption16. Giant unilamellar lipid vesicles (GUVs) were chosen as the model membrane system with a specified lipid composition. The GUVs were generated using the gel-assisted hydration method, specifically polyvinyl alcohol gel hydration, as described by Weinberger et al.23, which allowed for efficient encapsulation of annexins into GUVs.
The utilization of near-infrared (NIR) laser irradiation on metallic nanoparticles (NPs) induces significant heating of the NP, making it an effective method to establish a local heat source exploited in biomedical applications24. The method was initially used to directly measure the temperature surrounding a single AuNP in both 2D and 3D biomimetic assays. In these assays25,26, the plasmonic nanoparticles were irradiated on a supported lipid bilayer or optically trapped near GUVs undergoing a local thermal phase transition upon local heating, enabling quantification and control of the exact temperature profile around the particle. This reference temperature profile has been utilized when investigating or manipulating biological specimens. Further advancements in the method have facilitated the induction of nanoscopic pores in membranes27, allowing for vesicle and cell fusion28,29. Other studies have investigated the behavior of peripheral membrane proteins in GUVs29 and transmembrane proteins30 by creating novel hybrid vesicles, while cell-specific drug delivery has also been explored to control and study cellular responses or gene expression28,29,31,32,33. Recently, the method has been used to investigate protein responses to membrane damage32,34,35.
Several methods exist for disrupting the plasma membrane to explore cellular responses and membrane repair. These include microneedle punctures, microbead shaking, and cell scraping, all of which can disrupt the cell membrane mechanically14,36,37. Chemically induced damage can be achieved by adding detergents5,38&#160;or bacterial toxins39,40 that destabilize the lipid bilayer and generate membrane pores across the plasma membrane. Furthermore, optically induced injuries by continuous wave and pulsed lasers have been used to study PMR components, such as annexin proteins5,14,21,41, in combination with plasmonic nanoparticles42,43,44,45. Despite the efficiency of high-power pulsed lasers, they can cause significant injuries and damage to the cell&#39;s interior along the beam path. Moreover, the detailed changes that occur in the biological matter upon pulsed laser irradiation and whether it creates a well-defined pore remain to be further investigated. An alternative method is presented in this article, employing thermoplasmonics to induce nanoscopic holes in the PM in a controlled manner34,35 without causing significant harm to the internal structures. This is accomplished by exposing plasmonic NPs to a highly focused NIR laser, resulting in an extremely localized temperature increase that can easily reach temperatures exceeding 200 &#176;C, which can lead to small nanoscopic explosions25,46,47. This process can be controlled by adjusting the laser intensity as well as the size, shape, and composition of the NPs48. By employing this technique, researchers can explore the role of proteins in PM repair in living cells, which could help address some of the unanswered questions regarding the involvement of annexin proteins in membrane repair without compromising cell viability.
The optical trapping of plasmonic nanoparticles has been well established by previous studies25,49,50,51,52; however, additional insights regarding the thermoplasmonic properties of the nanoparticles53,54,55&#160;can be obtained in the supplementary materials (Supplementary File 1). The thermoplasmonic method can be used to create nanoscopic holes in the PM for the purpose of studying the cellular response and repair mechanisms. More precisely, the puncture can be achieved through the optical heating of AuNPs in close proximity to the membrane, as shown in Figures 1A and B. This localized puncture allows for Ca2+ influx, which was verified by a calcium sensor, thus activating the PMR machinery. For live cell experiments, AuNPs with a diameter of 200 nm were immobilized on the surface beneath the cell to monitor the role of ANXA2 in PMR via confocal microscopy. The NIR laser (Figure 1A,B), with a wavelength of 1064 nm, irradiates the AuNP, exploiting its plasmonic properties (Figure 1C), resulting in substantial local heating (Figure 1D) in the biological transparency window49 while causing minimal damage to the cell itself. The high-temperature region surrounding the AuNP rapidly decreases by 30-40% at a distance corresponding to the radius of the NP, as depicted in Figure 1E, allowing for an extremely confined injury in all three dimensions.
Supplementary File 1.&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65776/Supplementary File 1_updated.zip" target="_blank">Please click here to download this File.</a>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65776/65776fig01.jpg" /> 
Figure 1: Schematic outline of the experimental method. (A) ANXA-transfected cells are situated on top of immobilized gold nanoparticles (AuNPs) on the surface, or (B) giant unilamellar vesicles (GUVs)&#160;with encapsulated ANXA are suspended in a medium containing AuNPs. (C) A single AuNP is irradiated by the NIR optical trap, where the interaction between the incoming electromagnetic field and the conduction electrons leads to the collective oscillation of electrons within the NP. (D) This process results in a highly confined yet significant increase in temperature. To estimate the temperature at the NP surface, Mie theory is employed, and a (E) temperature profile is calculated for an AuNP with a diameter of 200 nm and laser intensity I = 6.36 x 108 W/cm2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65776/65776fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
To minimize the thermal effect on the cell membrane, the AuNPs are only irradiated for ~1 second. This causes a transient and local burst of heating, which reduces the damage to proteins that typically require more time to unfold. Upon membrane puncture, annexin proteins are recruited in a fraction of a second, and within a few seconds, an annexin ring-like scaffold is formed around the site of injury (Figure 2). This approach has also been applied to explore the involvement of ANXA5 in both living cells and model membranes16 in an effort to shed light on the complete scheme of the repair processes. While the primary focus has been on the correlating recruitment of various annexin proteins, the biophysical aspects of the repair mechanism have yet to be elucidated.
To fully implement the proposed method, three key components are required: confocal microscopy, optical tweezers, and metal nanoparticles. Optical tweezers are used to trap AuNPs, and their construction can be achieved by following the procedure outlined by Neuman et al.49. However, if building an optical tweezer proves to be too challenging, a tightly focused NIR laser can be used to irradiate AuNPs immobilized beneath the cells. While spherical AuNPs were chosen for this protocol, a variety of plasmonic particles with tunable absorption spectra could also be utilized to achieve a highly localized temperature gradient within the NIR region48.
Fluorescence imaging is necessary for observing the role of the fluorescently labeled proteins, and therefore, total internal reflection microscopy (TIRF)56 could be considered as an alternative to confocal imaging. However, this technique only allows for surface imaging and would not be compatible with the model membrane vesicle experiments. Consequently, both the optical tweezers and confocal microscope are essential for the precise localization of the nanoparticle and detailed investigation of the local area surrounding the cell injury. To effectively irradiate the nanoparticle with a diffraction-limited laser focus, it is necessary to visualize the nanoparticle. This can be optimally achieved by reflection microscopy, which is a standard imaging feature of Leica confocal microscopes. However, if reflection or scattering imaging is not available, alternative methods, such as the less efficient fluorescent AuNP labeling, may be considered.
In summary, the highly controllable and localized thermoplasmonic method presented in this study has the potential to serve as an excellent platform for investigating the molecular components involved in cellular responses and PM repair mechanisms in living cells. In addition to studying the protein response upon PM damage, this approach can also be utilized for locally puncturing vesicles, thereby enabling an investigation of the protein response in both protein-protein and protein-membrane dynamics. Moreover, this method allows for a quantitative analysis of the interactions between proteins, lipids, and small molecules when membranes are disrupted. Collectively, these advances have the potential to shed light on some of the unresolved questions regarding the intricate and complex plasma membrane repair machinery.

Yazar Spotlight: Yenilikçi Termoplazmonik Delme ile Plazma Membran Onarım Mekanizmalarını Keşfetmek 

Canlı Hücrelerde ve Model Membranlarda Plazma Membran Onarımını Araştırmak İçin Termoplazmonik Bir Yaklaşım

Our research is focused on investigation of plasma membrane repair mechanisms, in both living cells, but also in biomimetic systems, called the giant unilamellar vesicles. We are particularly interested in understanding the role of proteins like annexins and facilitating surface repair. These intricate processes are explored using our innovative thermoplasmonic puncture technique.Currently, cell repair is being investigated using pulse lasers, combined with molecular biology, to identify proteins that are recruited to the site of injury. The drawback of this approach is that it's hard to control the extent of damage caused by using pulse lasers. Currently, our experiments come with a few challenges.We're working on fine tuning the alignment of our laser focus with a nanoparticle, which is crucial for precision, and although it can be a bit tricky, we're also actively working on minimizing the formation of nanobubbles during the heating process. Our research demonstrated that annexin proteins swiftly respond to calcium influx, playing a key role in membrane repair, and reveal diverse behaviors of individual annexins. To better understand the mechanisms involved, we turned by biomimetic systems, allowing us to precisely measure how annexins influence membrane bending near a membrane hole.Our protocol meets the need for precise localized membrane injuries in healthy cells. It provides valuable insight into live cell membrane repair mechanisms. Furthermore, it enabled the study of the biophysical role of membrane proteins recruited to the annular region near upper head in biomimetic membranes.

Bu çalışmada, plazma membranının bozulmasına annexin protein yanıtını araştırmak için termoplazmonik yöntem kullanılmıştır; Bununla birlikte, membran hasarı üzerine alınabilecek herhangi bir protein, ilgili proteinin floresan olarak etiketlendiği göz önüne alındığında, bu test kullanılarak araştırılabilir. Protein alımı ve işlevi, hem insan embriyonik böbrek (HEK293T) hücrelerinde hem de dev unilameller veziküllerde (GUV'ler) konfokal görüntüleme ile izlenir. Detaylandırmak gerekirse, Şekil 2 , tek bir AuNP'yi ışınlamak için 1064 nm'de odaklanmış bir NIR lazer ışınının kullanıldığı deneysel koşulları göstermektedir (Şekil 2A), bu da membran yaralanmasına ve hücreye Ca2+ akışına neden olarak PMR makinesini aktive eder. Daha sonra, eklavinler hızla yaralanma bölgesine alınır ve burada yara çevresindeki negatif yüklü fosfolipidlere bağlanırlar ve saniyeler içinde halka benzeri bir yapı oluştururlar (Şekil 2B, i-iv). GUV'leri kullanan model membran deneyleri, Şekil 2C'de gösterildiği gibi, membran deliklerinin ANXA'nın yokluğunda hızla yeniden kapatıldığını gösterdi. Bununla birlikte, ANXA varlığında, membran ponksiyonunu takiben yaralanma bölgesinde hızlı bir ANXA birikimi gözlenmiştir (Şekil 2D). Özellikle, ANXA açıkta kalan kenarları yuvarlamaya devam etti ve sonuçta GUV'nin patlamasına yol açtı. Bu yuvarlanma mekanizmasının, ANXA'nın eğriliği indükleme ve lipit zarları bükme yeteneğinden kaynaklandığına inanılmaktadır20.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65776/65776fig02.jpg"> Şekil 2: Annexinler (ANXA'lar) termoplazmonik kaynaklı membran bozulmasına tepki. Başlangıçta, (A) plazma zarı, yüksek düzeyde Ca2 + iyonları içeren hücre dışı ortam ile kapsüllenmiş ANXA'lar içeren hücre içi ortam arasında bir bariyer görevi görür. Yakın kızılötesi (NIR) lazerle ışınlama üzerine, AuNP önemli miktarda ısı üreterek zarın yırtılmasına veCa2+ iyonlarının akmasına neden olur. Sonuç olarak, ANXA'ların negatif yüklü fosfolipidlere bağlandıkları yaralanma bölgesine alınmasını içeren plazma membran onarımı (PMR) mekanizması aktive edilir. (B-D) ANXA2 içeren bir hücrenin ve ANXA4 içeren bir GUV'nin konfokal mikroskopi görüntüleri bu süreci göstermektedir. (i) Işınlamadan önce, görüntüler, beyaz oklarla gösterilen ışınlama bölgeleri ile bozulmamış bir hücreyi veya GUV'yi gösterir. (ii) Nanopartikül ışınlaması üzerine, (B) ANXA'lar hızla yaralanma bölgesine alınır ve zar sargısının etrafında halka benzeri bir yapı oluşturur (B [ii-iv]). Panel (C), delinme üzerine, gözlemlenebilir membran yeniden şekillenmesi olmadan hızla yeniden kapanan, ANXA içermeyen membran lekeli bir GUV'yi göstermektedir. Öte yandan, panel (D), membran boyunca Ca2+ sızıntısı nedeniyle (i) ışınlamadan önce membrana zaten bağlı olan rekombinant ANXA4 içeren bir GUV göstermektedir. (ii) Delinme üzerine, ANXA4 serbest kenarlara bağlanır ve membran kenardan uzaklaşırken GUV'nin çökmesine neden olur. Ölçek çubukları şekil (B) için 10 μm, B (i) için 2 μm, (C) için 10 μm ve (D) için 15 μm ölçer. Bu rakam Moreno-Pescador et. al16 Royal Society of Chemistry'nin izniyle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65776/65776fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tam ANXA halka benzeri yapıların analizi (Şekil 2B ve Ek Şekil 1), yara boyutu ve morfolojisi hakkında yararlı bilgiler sağlar. ANXA halka yapısının yarıçapı, Bölüm 5'te açıklandığı gibi zaman ve mekan içinde belirlenebilir. Moreno ve ark.16, ANXA5 halka yapılarının analizinin Şekil 3'te gösterildiği canlı hücrelerde 135'ten fazla plazma membranı yaralanmasını analiz etti. Yarıçap, halkanın merkezinden eğrinin dış yarıçapına olan mesafenin, daraltılmış yoğunluk profilinin tam genişlik-yarı-maksimumuna dayalı olarak ölçülmesiyle belirlendi (Şekil 3A). Bulgular, zaman içinde sabit kalan ANXA5 halka boyutlarının (Şekil 3B) (Şekil 3D, G, H) ve uzayda (Şekil 3C, E, F) heterojen bir dağılımını göstermiştir. Bu sonuçlar, hasarlı membranın5 varsayımsal huni benzeri içe doğru tomurcuklanmasına canlı hücrelerde alternatif bir ANXA5 aracılı PMR stratejisinin göstergesi olarak, yaralanma bölgelerinin etrafında bir ANXA5 birikimi olduğunu göstermektedir.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65776/65776fig03.jpg"> Şekil 3: Canlı hücrelerde bir yaralanma bölgesini çevreleyen ANXA5 halka yapılarının analizi. (A) Şematik gösterim, ANXA yoğunluk çizgisi profilinin tam genişlik-yarı maksimumuna dayanan analitik yaklaşımı göstermektedir. (B) Histogram, ölçülen 135 ANXA5 halka yarıçapını gösterir. (C) Z-yığınının her bir z bölümü için bir ANXA5-GFP halkası boyunca floresan yoğunluk çizgisi profilleri. (D) Konfokal görüntüler, ANXA5-GFP'nin yaralanmadan hemen sonra yara çevresinde biriktiği ve ardından yara stabilizasyonunun yapıldığı bir yaranın zaman evrimini göstermektedir. 1-6 etiketli zaman dilimleri, kare başına 0.66 s aralıklarla yakalandı. Ölçek çubuğu 2 μm'dir. (E) Yaraların yarıçapları, panel A'da sunulan yönteme göre yara derinliğinin bir fonksiyonu olarak belirlendi. (F) Yaranın eğimi, panel E'den çıkarılan verilere dayalı olarak z-yüksekliğinin bir fonksiyonu olarak ANXA5 halka yarıçapı olarak analiz edildi. (G) Floresan yoğunluk çizgisi profilleri, panel D'den ANXA5-GFP halkası boyunca ölçüldü, burada 1-6 arasındaki her zaman aralığı 1-6 dilimi olarak gösterilir. Son olarak, (H) ANXA5-GFP halka yarıçaplarının zaman evrimi, G panelindeki verilerden hesaplanan zamanın bir fonksiyonu olarak sunulur. Bu rakam Moreno-Pescador et. al16 Royal Society of Chemistry'nin izniyle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65776/65776fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Sadece PM'nin bozulmasıyla oluşan halka benzeri yapılarla karşılaştırıldığında (Ek Şekil 1), çekirdeğe yakın yaralanmalar (Ek Şekil 2A) yaranın evrimini ve geometrisini etkileyebilir. Bazen, ANXA halkalarının yalnızca bir kısmı belirgindi, bu da şirket içi MATLAB analiz iş akışı kullanılarak da analiz edilebilir (bkz. Bölüm 5), ancak ek veriler kaybolabilir. Tipik olarak, yapışık olmayan hücrelerde gözlenen ANXA halkası oluşumları (Ek Şekil 2C) hem çekirdeğe hem de hücrenin çevresine yakın bulunur. Sonuç olarak, sunulan veri analizi için yetersiz olan daha uzun bir halka yapısı gözlemlenebilir. Ek olarak, yapışık olmayan hücrelerin PM hasarını takiben hücre ölümüne daha duyarlı olduğu görülmüştür. Ayrıca, AuNP agregalarının ışınlanmasından kaynaklanan yaralanmalar göz önüne alındığında, bu yaralanmaların daha şiddetli ve daha az kontrol edilebilir olabileceğine dikkat etmek önemlidir. Bunun nedeni, hücrenin büyük bir kısmına zarar verebilecek plazmonik ısıtmadaki önemli artıştır. Sonuç olarak, bu tür yaralanmalar ANXA5 halka analizine dahil edilmemiştir.
Ayrıca, ön bulgular, termoplazmonik kullanılarak plazma zarının bozulmasının, hücre içiCa2+ seviyelerinin yükselmesine neden olduğunu göstermektedir. Bu, tek AuNP'lerin düşük yoğunluklu ışınlamasında bile gözlendi, bu da Şekil 4'te gösterildiği gibi PM geçirgenliği35'i düşündürdü. Ca2+ akışı, Ca 2+ akışı üzerine konformasyonel bir değişikliğe uğrayan membrana bağlı bir kalsiyum probu olan GCaMP6s-CAAX'ı eksprese eden hücrelerde gözlendi ve bu nedenle yoğunluğunda bir artış gözlemlenebilir64. Kalsiyum yoğunluğu, zaman içinde hücrenin tüm ayak izi için ölçüldü. Arka plan gürültüsünü ortadan kaldırmak için, membran bozulması ve membran sonrası onarımdan önce arka plan Ca2+ seviyesi çıkarıldı. Maksimum yoğunluk, hücre içindeki ortalama Ca2 + yoğunluğunun normalleştirilmesiyle belirlendi, bu da Şekil 4B'de gösterildiği gibi hızlı bir başlangıç Ca2 + yoğunluk artışı ve ardından daha yavaş bir düşüş sergileyen bir yoğunluk eğrisi ile sonuçlandı.
Hücre, ~ 6.6 s'de maksimum kalsiyum yoğunluğuna ulaştı, bu da kalsiyum yoğunluğu zirvesinin (t = tc) yaranın kapanması için gereken süreye karşılık geldiğini öne süren Klenow ve ark.64'ün bulgularıyla tutarlıdır. Bununla birlikte, membran onarımı ve yara iyileşmesinin altında yatan mekanizmayı belirlemek için daha fazla araştırmaya ihtiyaç duyulurken, ön bulgular bu Ca2+ sürecinin pozitif kontrol olarak kullanılan yaralanmamış hücrede değil, sadece yaralı hücrede gözlendiğini göstermiştir. Bu, hücrenin termoplazmonik membran bozulması üzerine Ca2 + akışı yaşadığını doğrular, burada hücre içi kalsiyum seviyesi artık Ca2 + akışı ile rekabet halinde olmadığı için başarılı PMR'den sonra fazla hücre içi kalsiyum aktif olarak dışarı pompalanır ve sonunda hücre homeostazı64 elde edilir.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65776/65776fig04.jpg"> Şekil 4: Kalsiyum akışı, bir HEK293T hücresinin plazma zarının termoplazmonik tarafından parçalanmasıyla meydana gelir. Bir dizi konfokal görüntü, membrana bağlı kalsiyum probu GCaMP6s-CAAX'ı eksprese eden iki hücreyi (ilgilenilen hücre ve pozitif kontrol olarak kullanılan yaralanmamış bir hücre) gösterir. Ölçek çubuğu 10 μm'dir. (A) Işınlamadan önce, saat 00:00'da, iki hücrenin ayak izi gri noktalı çizgi ile görselleştirilir ve ışınlama bölgesi sarı daire ile gösterilir. Lazer ışınlaması üzerine, yara kapanma zamanına karşılık geldiği varsayılan bir zaman noktası olan turuncu kesikli çizgi ile gösterilen ~ 6.6 s'de maksimum yoğunluğa ulaşan hızlı bir Ca2+ akışı gözlenir64. (B) Yaralı hücredeki (mavi çizgi) GCaMP6s-CAAX probundan elde edilen kalsiyum yoğunluğu profili, komşu yaralanmamış bir hücredeki (gri noktalı çizgi) Ca2 + yoğunluğu ile karşılaştırıldı ve sadece PM bozulması üzerine net bir Ca2 + akışı gösterdi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65776/65776fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Exploring Plasma Membrane Repair Mechanisms with Innovative Thermoplasmonic Puncturing at JoVE.com

Termoplazmonik delme yöntemi, hücrelerde ve dev unilameller veziküllerde plazma membran onarımı sırasında protein tepkilerini incelemek için konfokal mikroskopi, optik cımbız ve altın nanopartikülleri entegre eder. Teknik, hızlı ve lokalize membran delinmesini mümkün kılarak, anahtar proteinlerin ve bunların karmaşık plazma membran onarım mekanizmasındaki fonksiyonel rollerinin tanımlanmasına izin verir.

The cell membrane is crucial for cell survival, and ensuring its integrity is essential as the cell experiences injuries throughout its entire life cycle. ...

Araştırmamız, hem canlı hücrelerde hem de dev unilamellar veziküller olarak adlandırılan biyomimetik sistemlerde plazma membran onarım mekanizmalarının araştırılmasına odaklanmıştır. Özellikle annexinler gibi proteinlerin rolünü anlamak ve yüzey onarımını kolaylaştırmakla ilgileniyoruz. Bu karmaşık süreçler, yenilikçi termoplazmonik delme tekniğimiz kullanılarak incelenir.Şu anda, hücre onarımı, yaralanma bölgesine alınan proteinleri tanımlamak için moleküler biyoloji ile birlikte nabız lazerleri kullanılarak araştırılmaktadır. Bu yaklaşımın dezavantajı, darbeli lazerlerin kullanılmasının neden olduğu hasarın boyutunu kontrol etmenin zor olmasıdır. Şu anda, deneylerimiz birkaç zorlukla birlikte geliyor.Lazer odağımızın, hassasiyet için çok önemli olan bir nanopartikül ile hizalanmasında ince ayar yapmaya çalışıyoruz ve biraz zor olsa da, ısıtma işlemi sırasında nano kabarcık oluşumunu en aza indirmek için aktif olarak çalışıyoruz. Araştırmamız, annexin proteinlerinin kalsiyum akışına hızlı bir şekilde yanıt verdiğini, membran onarımında önemli bir rol oynadığını ve bireysel annexinlerin çeşitli davranışlarını ortaya çıkardığını göstermiştir. İlgili mekanizmaları daha iyi anlamak için, ekinlerin bir membran deliğinin yakınındaki membran bükülmesini nasıl etkilediğini tam olarak ölçmemize izin veren biyomimetik sistemlere başvurduk.Protokolümüz, sağlıklı hücrelerde hassas lokalize membran yaralanmaları ihtiyacını karşılamaktadır. Canlı hücre zarı onarım mekanizmaları hakkında değerli bilgiler sağlar. Ayrıca, biyomimetik membranlarda üst başın yakınındaki halka şeklindeki bölgeye alınan membran proteinlerinin biyofiziksel rolünün araştırılmasını sağlamıştır.

a-thermoplasmonic-approach-for-investigating-plasma-membrane-repair

Research

JoVE Journal

Biology

A Thermoplasmonic Approach for Investigating Plasma Membrane Repair in Living Cells and Model Membranes

862 Görüntüleme.  University of Copenhagen. Araştırmamız, hem canlı hücrelerde hem de dev unilamellar veziküller olarak adlandırılan biyomimetik sistemlerde plazma membran onarım mekanizmalarının araştırılmasına odaklanmıştır. Özellikle annexinler gibi proteinlerin rolünü anlamak ve yüzey onarımını kolaylaştırmakla ilgileniyoruz. Bu karmaşık süreçler, yenilikçi termoplazmonik delme tekniğimiz kullanılarak incelenir.Şu anda, hücre onarımı, yaralanma bölgesine alınan proteinleri tanımlamak ...