Drug Screening Using Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) and Cell Lysate Preparation for mRNA Sequencing

まず、PBMCのクライオバイアルを摂氏37度のウォーターバスで2〜3分間、静かに反転させながら解凍します。次に、融解した細胞を50ミリリットルの円錐形チューブに移します。クライオバイアルを1ミリリットルの温かい完全増殖培地ですすぎ、溶液をコニカルチューブ内の細胞に滴下して最初の希釈ステップを実行します。

次に、細胞懸濁液を5分間遠心分離し、円錐形のチューブを流暢に傾けて上清を除去します。細胞を3ミリリットルの温かい完全増殖培地に再懸濁します。細胞カウントには、10マイクロリットルの細胞懸濁液をトリパンブルーと混合します。

10マイクロリットルの染色細胞溶液を使用して、自動セルカウンターまたはセルチャンバーのいずれかで細胞をカウントします。温かい完全増殖培地を使用して細胞を希釈し、1ミリリットルあたり10〜6番目の細胞の1倍の最終濃度を達成します。次に、100マイクロリットルの細胞懸濁液を96ウェル細胞培養プレートの各ウェルに播種します。

2倍に希釈した薬物を100マイクロリットル各ウェルに加えます。細胞を回収するには、細胞培養プレートを10分間遠心分離します。真空ポンプを使用して上清を除去し、ポンプの先端をウェルの下隅に配置して細胞を保持します。

次に、各ウェルに200マイクロリットルの氷冷PBSを追加します。プレートを5分間遠心分離した後、上清を取り除きます。次に、各ウェルに15マイクロリットルの溶解緩衝液を添加します。

粘着シールフィルムを使用して、プレートを密封して汚染を防ぎます。プレートをボルテックスし、1分間遠心分離します。最後に、6マイクロリットルの溶解細胞溶液をPCRプレートに回収します。