以下のビデオの全体的な目標は、ネガティブセレクションスクリーニングを実施するためにプールされたshRNAエピジェネティックライブラリーの使用を実証することである。このスクリーニングにより、シーケンシングを通じて特定のエピジェネティックな標的を同定することができます。この手順は、AMLにおける後天性シタラビン耐性を媒介する原因となるエピジェネティック因子を同定するのに役立ち得るステップは以下の通りである。
shRNAsの持続的かつ長期発現を得るための最も強力なプロモーターの選択。現在のプロトコールは、シタラビン耐性MV4-11細胞株におけるエピジェネティック因子shRNAライブラリーを用いたRNAiスクリーニングに焦点を当てている。この目的に使用されるプロモーターは、ヒトEF−1アルファ、ヒトCMV、およびSFFVであり、緑色蛍光タンパク質を発現するプロモーターである。
トリパンブルー排除法を用いて細胞数をとる。細胞を1mLあたり8マイクログラムのポリブレンを含む10%RPMI培地に懸濁する。6ウェルプレートのウェルあたり1.5mlの培地に100万個の細胞を3連で播種する。
濃縮レンチウイルスの異なるボリュームを追加します。例えば、レンチウイルスは、例えば、10、20、および40マイクロリットルを、各ウェルに対するレンチウイルスの力価に依存する。プレートを静かに回転させて内容物を混ぜます。
920g、摂氏37度で90分間遠心分離による製菌を行う。直ちにプレートを二酸化炭素インキュベーター内でインキュベートする。48時間の終わりにGFPを観察し、72時間の終わりに同じものを定量化します。
次に、フローチャートに示されている手順に従って、培養物全体で一貫したGFP発現を示すプロモーターを選択します。プールされたレンチウイルスヒトエピジェネティック因子shRNAライブラリーの調製。各プレートに8mlの10%DMFM培地を用いた3つの10センチメートル細胞培養皿において良好な増殖速度を有する低い継代数で293T細胞を培養した。
細胞が60%のコンフルエントに達したら、新鮮な培地と完全に交換する。無血清培地、レンチウイルスパッケージングプラスミドPAX2、エンベローププラスミドpMD2を含む概説どおりにトランスフェクションミックスを準備します。G、ライブラリープラスミドをプールし、最後にトランスフェクション試薬とした。
混合物をタップしてよく混合し、室温で15分間インキュベートする。トランスフェクション混合物を293T細胞に加え、プレートを旋回させて穏やかに混合する。プレートを二酸化炭素インキュベーター内でインキュベートする。
24時間後に培地を交換してください。48時間後、蛍光顕微鏡でGFP発現をチェックし、293T細胞への高いトランスフェクション効率を確保しました。48、60、72時間後にウイルス上清を回収し、4度で保存し、ウイルスを回収した後の各時点で新鮮な培地8mlを加えます。
プールされたウイルスを 0.4 ミクロンのフィルターでフィルター処理します。ウイルスの高力価を得るためには、プールされたウイルスを超遠心分離により濃縮する。濾過したウイルス上清を70本のTiチューブに移し、18,000gで2時間遠心分離した。
予冷ローターを使用し、4度で遠心分離機を使用してください。遠心分離機からチューブを慎重に取り出し、上清を完全に取り除きます。マイクロピペットを用いてFBSおよび抗生物質を含まない400マイクロリットルのDMEMにペレットを穏やかに再懸濁し、氷上で1時間インキュベートする。
ウイルスをアリコートし、マイナス80度で凍結する。図に示すように、ウイルスの濃度を計算します。レンチウイルスの形質導入効率の推定
293T細胞を異なる体積の濃縮ウイルス(2、4、および8)で形質導入し、レンチウイルスの調製が成功したことを確認した。ウイルスを100倍に濃縮した値を標的細胞株で滴定実験を行った。1mlあたり8マイクログラムのポリブレンを含む1.5mlの10%RPMI培地中の100万個の標的細胞株を6ウェルプレートの1ウェルにシードする。
4 つの異なるボリューム 1、1.5、2、2.5 マイクロリットルの 100X ウイルスを追加します。プレートを920gで37°Cで90分間遠心分離して製芽を行う。72時間後、GFP陽性細胞の割合をフローサイトメトリーにより測定する。
ウイルスの量を決定し、30%の形質導入効率を得る。この低い形質導入効率は、細胞当たり単一のshRNA組み込みを確実にするためである。薬剤耐性細胞株におけるプールされたエピジェネティックshRNAライブラリーの形質導入。
ウイルス組積物の数に基づいて、以下のように実験のために採取する細胞の数を計算する。16 ML の 10%RPMI 培地に 1,100 万個の細胞を再懸濁します。ポリブレンを1mlあたり8マイクログラム加えてよく混ぜ合わせ、必要な量のウイルスを加えて、前に計算したように30%の形質導入効率を得る。
すべての細胞を6ウェルプレート上に、ウェルあたり1.5mlあたり100万個の細胞の密度で播種する。プレートを摂氏37度で920gで90分間遠心分離する。プレートを二酸化炭素インキュベーター内で一晩インキュベートする。
24時間後、培地を交換し、形質導入細胞をT-75フラスコに移した。48時間後、蛍光顕微鏡下でGFPをチェックし、形質導入が成功したことを確認します。72時間後、フローサイトメトリーによりGFPを定量する。
GFP陽性細胞の富化。形質導入細胞を1mlあたり50万の密度で5~7日間培養して増殖させ、高純度・低収率に設定したフローソーティング設定でフローソーティングを行う。選別した細胞を10%RPMI培地で培養する。
72時間後、GFP陽性細胞の割合の選別後推定を行い、95%以上の選別効率を確保した。薬物耐性を媒介するエピジェネティック因子を同定するためのドロップアウトスクリーニング。shRNAライブラリー形質導入細胞を10%RPMIで最大5日間培養する。
1000万個の細胞を二重に遠心分離する。上清を捨て、ペレットをマイナス80度で保管する。これらのサンプルは、エピジェネティックなshRNAライブラリーのベースラインリファレンスとして役立つでしょう。
残りの形質導入細胞を複製として培養し、R1およびR2を、それぞれライブラリーの500X表現を提供する細胞数で維持する。重複の1つを薬物、10マイクロモルのシタラビンで治療し、もう1つを薬物治療なしで治療する。フラスコの培地を薬物の有無にかかわらず、72時間ごとに交換する。
9日間の累積薬物曝露について培地交換を3回繰り返す。薬物治療の9日目以降、トリパンブルー排除法により細胞の生存率を確認する。残りの生細胞をスピンダウンし、滅菌PBSで洗浄し、室温で5分間280gで遠心分離する。
上清を捨て、DNA抽出のためにペレットをマイナス80で保存する。PCRによる集積shRNAの増幅。形質導入されたベースライン細胞からDNAを抽出し、処理細胞および未処理細胞、続いて蛍光光度計を用いて濃度を確認し、図示のように必要なDNA量を計算し、サンプルを第1ラウンドのPCRに供した。
PCR反応混合物をサーマルサイクラー条件とともに表2に示します。チューブあたり850ナノグラムのDNAを含む複数の反応をセットアップし、合計43の反応を行います。PCR産物をプールし、精製する。
製品を50マイクロリットルの緩衝液で溶かして定量し、最後にマイナス20で保存します。第2ラウンドPCRの場合、リバースインデックスプライマーを使用し、試薬を表4に表します。ネガティブコントロールとともに、各サンプルの総反応容量50マイクロリットルで500ナノグラムの一次PCR産物を用いて4つの反応をセットアップする。
2%TBEアガロースゲルを用いて電気泳動のために製品全体をロードし、1KB分子ラダーでバンドサイズを確認します。ゲル文書化システム上のPCR産物を視覚化します。特定のバンドを切除し、ゲル精製キットを用いて精製する。
キットを用いた精製の計算を表3に提供する。各溶離液のおおよその濃度をマイクロリットルあたり約80〜90ナノグラムの溶出緩衝液の最終容量30マイクロリットルで溶出する。次世代シーケンシングとデータ分析。
ゲル精製産物は、枯渇したshRNAニーズに対する読み取りカウントを得るために、次世代シーケンシングに供されます。アダプター・シーケンスをトリミングし、フィルターで取り込んだ読み取り値を参照シーケンスにアラインメントし、SAMtools を使用してファイルをロードしてアラインメント・サマリーを取得します。トリミングされた fastQ ファイルを CRISPRCloud2 にロードし、指示に従って分析を実行します。
CRISPRCloud2 に用意されているリンクをクリックします。画面タイプを「サバイバル画面」画面および「ドロップアウト画面」として選択します。グループ数を設定し、各グループの名前を入力します。
参照ライブラリを FASTA ファイル形式でアップロードします。アップロードされたデータは処理され、結果は指定されたURLで利用できます。代表的なデータ。
この図は、シタラビン濃度の増加で処理されたMV4−11親および耐性細胞、0.1マイクロモル〜1,000マイクロモル、およびMTTアッセイによる生存率評価を示す。この図は、ヒトEF−1アルファ、ヒトCMV、およびSFFVプロモーターについて72時間の終わりにフローサイトメトリーによって定量されたGFPの代表的なフロープロットを示す。ヒトCMVは不均一なピークを示し、ヒトEF-1アルファおよびSFFVは単一の均質なピークを示す。
この図は、MV4−11における3つの異なるプロモーター効率についての棒グラフを示す。SFFV駆動GFPは、長期培養においてGFPのサイレンシングを示した。hEF−1α駆動GFP細胞は、これらの細胞の選別後に持続的な発現を示した。
左パネルは、蛍光顕微鏡下での48時間の終わりに293TでトランスフェクトされたプールされたshRNAライブラリーのトランスフェクション効率を示す。右側のパネルは、さまざまなウイルス体積(2、4、および8マイクロリットル)を有する293T細胞におけるプールウイルスの形質導入効率を示す。この図は、30%の形質導入効率を達成するために1、1.5、2、2.5マイクロリットルのような様々な体積のウイルスを有するMV4-11耐性細胞株における形質導入効率を表す。
この図は、高純度かつ低収率の選別設定で30%の形質導入効率を有するGFP陽性細胞の選別を示す。図は、9日間の長期シタラビン曝露に対するGFP陽性選別細胞に対する薬物処理の概略図を示し、続いて生存率をチェックし、DNAについて細胞を採取する。この図は、PCRの第1および第2ラウンドで用いたプライマーの結合領域を示す。
この図は、第1ラウンドPCRの終了時のPCR産物のバンドサイズ、397塩基対、および第2ラウンドPCR産物399塩基対を、ゲル溶出、精製し、NGSについて与えたものである。この図は、AMLにおけるシタラビン耐性を媒介する可能性のあるエピジェネティック因子を標的とする濃縮または枯渇shRNAの表現を示す。結論。このプロトコルは、必須遺伝子と非必須遺伝子の両方を体系的に調査するための標的ノックダウンスクリーニングの重要性を強調し、このアプローチを機能的プラットフォームとして使用し、薬剤耐性の原因となる標的の同定を可能にすることを実証する。
