まず、10日齢のマウスの子犬から採取したみじん切りにした小脳組織を基底中ワシで培養します。DNAに損傷を与える化学物質を適切な最終濃度で培地に直接添加します。ばく露期間終了後、培地をDNA損傷化学物質とポリADPリボースグリコヒドロラーゼ阻害剤を含む新たに調製した混合培地と交換し、30分間インキュベートします。
30分後、スライスを0.1モルリン酸緩衝液で室温で洗浄し、すぐに予冷したアセトンとメタノールの混合物で固定します。プレートをマイナス20°Cで20分間インキュベートします。次に、固定液を取り出し、0.4モルリン酸緩衝液で洗浄します。
100マイクロリットルの0.1モルリン酸緩衝液を48ウェルプレートの各ウェルに加えます。次に、メスとまな板を使用してインサートのマージンを取り除き、ティッシュスライスの周りを切り取ります。スライスを48ウェルプレートのウェルに入れます。
緩衝液を吸引した後、100マイクロリットルの0.1モルリン酸緩衝液(1%Triton X100を含む)とインサートをインキュベートします。溶液を吸引し、各ウェル内のインサートをシェーカー上で、適切な量のブロッキング溶液と連続的にインキュベートし、続いて二次抗体に一次抗体をインキュベートします。二次抗体との2時間のインキュベーションが終了する20分前に、20マイクロリットルの最終DAPI溶液を各ウェルに加え、20分間振とう続けます。
取り付けには、ティッシュを上に向けて顕微鏡のスライドガラスにティッシュを置きます。封入剤を追加し、カバーガラスで覆います。スライドを平らな面に置き、摂氏4度の暗闇で一晩乾かします。
小脳の葉は文化の中で維持されました。プルキンエ細胞をカルビンジンD-28Kについて染色し、神経核をNeuNについて染色しました。プルキンエ細胞のアストロサイトをGFAPで染色しました。
処理されたプルキンエ細胞では、臭素酸カリウムおよびパラコートへの曝露後にPAR染色が増加し、DNA損傷が示されました。
