この作品は、ノースカロライナ大学シャーロット校、教員の卓越性のためのワコビア基礎基金、NIGMS（R15GM101571）からの助成金によって提供された資金によって部分的にサポートされています。

1。 LSEの準備<ol><li>雌のカエル（ アフリカツメガエル ） は採卵のために二度注射する。最初の注入（プライミング）は、カエルあたり100 U PMSG（妊馬血清性性腺刺激ホルモン）です。カエルは、少なくとも2日間卵を敷設し、下塗りしたカエルを誘導する前に下塗りしなければならない最大2週間のために使用可能である。素数カエルに、3 mlのシリンジと27Gの針を用いて背部リンパ嚢の皮下にPMSG注射する。 </li><li>産卵を誘発するために、27Gの針を用いて背側リンパ嚢の皮下にプライミングカエル当たり500 UのhCG（ヒト絨毛性ゴナドトロピン）を注入。 1Xマルクの改変リンゲル液（MMR）の2リットルを含む別々のバケツに注入されたカエルをインキュベートする。カエルのコレクションの前に卵を産むために14から20時間を許可します。 </li><li>バケツからカエルを取り出して、約100ミリリットルを退場するまでのMMRソリューションをオフに注ぐ。 250mlビーカーに卵を転送することによって、バケットから卵を入手してください。 </li><li> 2％システインの100ミリリットル（調整を加えることによってDejellyの卵10 MのKOHでpHを7.8〜）。倒立ガラスパスツールピペット（直径0.7センチメートル）は約30秒ごとと静かに回して卵を。インキュベーション中にデカントし、二回新鮮なシステインと交換してください。卵はビーカーの底でより凝縮層を形成するときdejellyingプロセスは、約5〜15分で完了します。 </li><li>システイン溶液を捨て、0.25x、MMRで卵を3回洗浄する。ガラスピペットによる溶液中の卵を渦巻。 &quot;Bad&quot;の卵は簡単な目視検査によって決定され、外観は白の &quot;真綿&quot;がされています。 &quot;悪い&quot;卵が渦巻く後にビーカ​​ーの中心に蓄積されます。パスツールピペットにより &quot;悪い&quot;卵を削除します。 </li><li>卵の溶解緩衝液（ELB）で3回卵を洗います。パスツールピペットにより、任意の付加的な &quot;悪い&quot;卵を削除します。 14ミリリットルのファルコンチューブに卵を入れて。 </li><li>卵をコンパクトにし、スウィングローターでCL2 IEC臨床卓上型遠心機を用いて188×gで（1,100 rpm）で55秒間ファルコンチューブを回転させます。から過剰なバッファを削除卵層の上部。アプロチニン/ロイペプチン株式及び圧密卵のmlあたりサイトカラシンBの株式の0.5μlの0.5μlを添加する。 </li><li> ℃のHB6スウィングローターのソーバルRC6プラス超高速遠心機を用いて4℃で15分間16500 x g（10,000 rpm）以上で卵を遠心分離します。遠心分離後、卵がチューブ内の3層に分画されています：それぞれ脂質、エキス、卵黄/上から下への顔料、。穿刺21Gの針で真ん中抽出層の下部のファルコンチューブの側面。穿刺針はプラスチックを妨げることがあるので慎重に針を外します。抽出液を集めるために穿刺部位に1mlシリンジに取り付けられた新鮮な21Gの針を挿入します。ゆっくり脂質と卵黄/顔料層と気泡や汚染を避けるために、シリンジに抽出液を吸引除去する。 </li><li>冷やした1.5​​ mlのマイクロチューブに抽出物を置きます。卵抽出物の各ミリリットルの場合は、内に次のような化学原液を追加dicated最終濃度（括弧内）：（1）10μlのシクロヘキシミド（100μg/ ml）を、（2）を1μlアプロチニン/ロイペプチン（10μg/ mlの各々）、（3）1μlのサイトカラシンB（5μg/ mlの）、（4）1μlのジチオスレイトール（1mM）を、（5）0.33μlのノコダゾール（3μg/ ml）を。卵は優しく少なくとも10倍を抽出反転。これは新鮮な作られ、4時間以内に使用しなければならないLSEです。 LSEの品質は4時間または凍結融解後に侵害された。 </li></ol> 2。 DNA損傷アプローチと精子クロマチンの治療<ol><li>以前13に記載の方法に従って、通常の精子クロマチンを準備します。 </li><li> MMSの処理精子クロマチンを調製<ol><li> 0.5ミリリットルバッファXに正常な精子クロマチンを再懸濁し</li><li> 100 mMの最終濃度にクロマチンを再懸濁し500μlにMMSの〜5.5μL（株式の9.1 M）を追加します。 </li><li>回転しながら30分間、室温で遠心管中の精子クロマチンをインキュベートする。 </li><li>メートルを紡ぐスウィングローターとチューブ·アダプター付きIEC CL2臨床遠心分離機を用いて室温で10分間、686×gで（2,100 rpm）でicrocentrifugeチューブ。 </li><li>上清を捨て、バッファXプラスBSA（3％）、DTT（0.1 mM）およびアプロチニン/ロイペプチン（10μg/ mlの各）0.5 mlにペレットを再懸濁します。 </li><li>手順（4）を繰り返し、（5）倍精子クロマチンを洗浄する。 </li><li>血球計数器で精子クロマチンの濃度を決定し、10万精子/μlに希釈します。さらに使用するために-80℃の冷凍庫に5μlのアリコートを保存します。 </li></ol></li><li>紫外線処理した精子クロマチンを調製<ol><li>パラフィルムの片の表面に正常な精子クロマチンの所望の量（ 例えば、10μl）を追加します。 </li><li>紫外線架橋剤にパラフィルムを置きます。あなたの実験に応じて、所望のエネルギーパラメータを設定し、UV光を介して精子クロマチンを傷つけ始める。例えば、それは、1,000 J / mの2に到達するのに約21秒かかります。 </li><li>紫外線IRRA後にdiation、紫外線処理した精子クロマチンはすぐに卵抽出物に加えられるべきです。 </li></ol></li></ol> 3。 DNA損傷模倣構造の作製（AT70） <ol><li>それぞれ2μg/μLの濃度に水で70（T70と称する）ポリ（dT）を70（DA） - ポリ（A70と称する）と2つの合成オリゴヌクレオチドを​​溶かす。 </li><li> 1 1.5 mlのマイクロチューブに100μlのA70とT70の100μlを添加する。 heatblockで95°Cで5分のための混合合成オリゴ溶液を沸騰。 </li><li>乾燥浴ブロックを取り出す（その中に混合AT入ったチューブ付き）、それは実験台の上に室温まで冷却させます。この温度調整は約45から60分かかります。 </li><li>冷却された混合物は2μg/μlの最終濃度はAT70です。さらに使用するために-20℃の冷凍庫でAT70アリコートのストアを10μl。 </li></ol> 4。損傷した精子クロマチンやDNA損傷とLSEにおけるDNA損傷チェックポイントをトリガ模倣構造<ol><li>損傷した精子クロマチンとLSEにおけるDNA損傷チェックポイントを誘導<ol><li> 1.5 mlのマイクロチューブにLSEの50μlを添加し、エネルギー混合液1μlおよび損傷精子クロマチン（最終濃度4000〜精子/μl反応系）を2μlとそれを補完するものです。 </li><li> 90分間室温で反応管をインキュベートし、10分ごとにチューブをフリック。 </li><li> 30分間インキュベートした後、核色素溶液1μlを補った顕微鏡スライド上に、反応混合物を1μlを分注する。反応混合物の上にカバースリップを置き、蛍光顕微鏡を介して、核形成を確認してください。典型的には、円形の核は、DNA複製が開始したことを示す、インキュベーションの30分後に形成されます。 </li><li>サンプルバッファー90μlのに反応混合物10μlを取る。試料は抗Chk1のP-S344または抗Chk1の抗体を用いたイムノブロットによって分析されています。 </li></ol></li><li>とLSEにおけるDNA損傷チェックポイントを誘導AT70 <ol><li>エネルギー混合物の1μlとTautomycin株式の1.6μlで補わ1.5 mlのマイクロチューブにLSEの50μlを添加する。 </li><li>各反応に既製AT70（2μg/μLの場合）または水（陰性対照として）1.25μlを添加する。 90分間室温で反応をインキュベートする。反応チューブを10分毎にフリックします。 </li><li>サンプルバッファー90μlのに反応混合物の10μlを追加します。試料は抗Chk1のP-S344または抗Chk1の抗体を用いた免疫を介して検査されます。 </li></ol></li></ol> 5。代表的な結果損傷した精子クロマチンまたはDNA損傷を模倣する構造はアフリカツメガエル卵抽出系におけるATR/Chk1-mediated DNA損傷チェックポイントをトリガすることができます。 図2Aは MMSがの指標である、Ser344（CHK1 P-S344）でChk1のリン酸化を誘導することを示していますATRキナーゼの活性化。 図2Bに示すDNA損傷模倣STRUとしてそのAT70、影も、Chk1のリン酸化をトリガします。合計Chk1のサンプルは両方の例でコントロールを読み込むとして使用されています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4449/4449fig1.jpg" /> 図1。 DNA損傷チェックポイントシグナル伝達の図。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4449/4449fig2.jpg" /> 図2。 Chk1のリン酸化は、 アフリカツメガエルの卵抽出物中のMMSかAT70の治療のいずれかによって引き起こされる。（）、MMS、損傷の精子クロマチン（MMS）、または通常の精子クロマチン（CON）を90分間卵抽出液中でインキュベートされる。 Chk1のSer344のリン酸化（CHK1 P-S344）と卵抽出物中の総Chk1のは、免疫ブロット法を介して検査されます。 （B）はAT70または水（CON）は、それぞれ、卵抽出液中に添加されています。サンプルはまた、（）のようにして免疫ブロッティングによって分析されています。

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	<li>Lohka, M. J., Masui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+in+vitro+of+sperm+pronuclei+and+mitotic+chromosomes+induced+by+amphibian+ooplasmic+components.">Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components.</a> Science. 220 (4598), 719-721 (1983).</li><li>Cimprich, K. A., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATR:+an+essential+regulator+of+genome+integrity.">ATR: an essential regulator of genome integrity.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (8), 616-627 (2008).</li><li>Lupardus, P. J., Van, C., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+the+ATR-mediated+checkpoint+using+Xenopus+egg+extracts.">Analyzing the ATR-mediated checkpoint using Xenopus egg extracts.</a> Methods. 41 (2), 222-231 (2007).</li><li>Lupardus, P. J., Byun, T., Yee, M. C., Hekmat-Nejad, M., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+requirement+for+replication+in+activation+of+the+ATR-dependent+DNA+damage+checkpoint.">A requirement for replication in activation of the ATR-dependent DNA damage checkpoint.</a> Genes Dev. 16 (18), 2327-2332 (2002).</li><li>Stokes, M. P., Van Hatten, R., Lindsay, H. D., Michael, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replication+is+required+for+the+checkpoint+response+to+damaged+DNA+in+Xenopus+egg+extracts.">DNA replication is required for the checkpoint response to damaged DNA in Xenopus egg extracts.</a> J. Cell Biol. 158 (5), 863-872 (2002).</li><li>Kato, K., Strauss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+an+intermediate+in+DNA+synthesis+by+HEp.2+cells+treated+with+methyl+methanesulfonate.">Accumulation of an intermediate in DNA synthesis by HEp.2 cells treated with methyl methanesulfonate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71 (5), 1969-1973 (1974).</li><li>Paulovich, A. G., Hartwell, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+checkpoint+regulates+the+rate+of+progression+through+S+phase+in+S.+cerevisiae+in+response+to+DNA+damage.">A checkpoint regulates the rate of progression through S phase in S. cerevisiae in response to DNA damage.</a> Cell. 82 (5), 841-847 (1995).</li><li>Guo, Z., Kumagai, A., Wang, S. X., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+Atr+in+phosphorylation+of+Chk1+and+cell+cycle+regulation+in+response+to+DNA+replication+blocks+and+UV-damaged+DNA+in+Xenopus+egg+extracts.">Requirement for Atr in phosphorylation of Chk1 and cell cycle regulation in response to DNA replication blocks and UV-damaged DNA in Xenopus egg extracts.</a> Genes Dev. 14 (21), 2745-2756 (2000).</li><li>Jazayeri, A., Balestrini, A., Garner, E., Haber, J. E., Costanzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mre11-Rad50-Nbs1-dependent+processing+of+DNA+breaks+generates+oligonucleotides+that+stimulate+ATM+activity.">Mre11-Rad50-Nbs1-dependent processing of DNA breaks generates oligonucleotides that stimulate ATM activity.</a> EMBO. J. 27 (14), 1953-1962 (2008).</li><li>Kumagai, A., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claspin,+a+novel+protein+required+for+the+activation+of+Chk1+during+a+DNA+replication+checkpoint+response+in+Xenopus+egg+extracts.">Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts.</a> Mol. Cell. 6 (4), 839-849 (2000).</li><li>Yan, S., Lindsay, H. D., Michael, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+requirement+for+Xmus101+in+ATR-mediated+phosphorylation+of+Claspin+bound+Chk1+during+checkpoint+signaling.">Direct requirement for Xmus101 in ATR-mediated phosphorylation of Claspin bound Chk1 during checkpoint signaling.</a> J. Cell Biol. 173 (2), 181-186 (2006).</li><li>Shiotani, B., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-stranded+DNA+orchestrates+an+ATM-to-ATR+switch+at+DNA+breaks.">Single-stranded DNA orchestrates an ATM-to-ATR switch at DNA breaks.</a> Mol. Cell. 33 (5), 547-558 (2009).</li><li>Tutter, A. V., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+DNA+replication+in+a+soluble+cell-free+system+derived+from+Xenopus+eggs.">Chromosomal DNA replication in a soluble cell-free system derived from Xenopus eggs.</a> Methods Mol. Biol. 322, 121-137 (2006).</li><li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Fractionation+of+Xenopus+laevis+Egg+Extracts.">Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts.</a> J. Vis. Exp. (18), e891 (2008).</li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

アフリカツメガエルの卵抽出液を用いたDNA損傷チェックポイントを研究する際にはいくつかの利点があります。卵抽出物の使用は、細胞周期の間期で同期無細胞抽出液を大量に提供しています。卵抽出物を容易かつ安価に行うことができます。これは、DNAやクロマチンを損傷すると卵抽出液から目的タンパク質をimmunodepleting後のDNA損傷チェックポイントの欠陥を明らかにすることは比...

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> 試薬 </td></tr><tr><td>アンチChk1のP-S344抗体</td><td>細胞シグナリング</td><td> 2348L </td><td></td></tr><tr><td>抗Chk1の抗体</td><td>サンタクルス</td><td> SC7898 </td><td></td></tr><tr><td>アプロチニン</td><td> MPバイオメディカル</td><td> 0219115880 </td><td></td></tr><tr><td>シクロヘキシミド</td><td>シグマ</td><td> C7698-5G </td><td></td></tr><tr><td>サイトカラシンB </td><td> EMD </td><td> 250233 </td><td></td></tr><tr><td>ジチオスレイトール（DTT） </td><td> VWR </td><td> JTF780-2 </td><td></td></tr><tr><td> hCGの</td><td>シグマ</td><td> CG10-10VL </td><td></td></tr><tr><td> L-システイン</td><td>シグマ</td><td> C7352-1KG </td><td></td></tr><tr><td>ロイペプチン</td><td> VWR </td><td>97063-922 </td><td></td></tr><tr><td>メタンスルホン酸メチル（MMS） </td><td>シグマ</td><td> 129925-5G </td><td></td></tr><tr><td>ノコダゾール</td><td>シグマ</td><td> M1404-2MG </td><td></td></tr><tr><td> PMSG </td><td>カルビオケム</td><td> 367222 </td><td></td></tr><tr><td>サンプルバッファー</td><td>シグマ</td><td> S3401 </td><td></td></tr><tr><td> Tautomycin </td><td>和光ケミカルUSA </td><td> 209から12041 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 機器 </td></tr><tr><td>産卵用のバケツ</td><td>ラバーメイドコマーシャル製品</td><td> 6308 </td><td></td></tr><tr><td>スウィングローターとCL2のIEC遠心分離機</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 004260F </td><td></td></tr><tr><td> HB6スイングバケットローター</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 11860 </td><td></td></tr><tr><td>ソーバルRC6プラス超高速遠心機</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 46910 </td><td></td></tr><tr><td> UVクロスリンカー</td><td> UVP </td><td> 95-0174-01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ソリューション </td></tr><tr><td> 1X MMR </td><td></td><td></td><td> 100mMのNaCl、2 mMの塩化カリウム、0.5mMのMgSO 4を 、2.5 mMのCaCl 2、5mMのHEPESは、10M NaOHで7.8にpHを調整</td></tr><tr><td>アプロチニン/ロイペプチン株式</td><td></td><td></td><td>水に10 mg / mlの各。 -80℃で、20μlのアリコートを保存</td></tr><tr><td>バッファX </td><td></td><td></td><td> 0.2 Mスクロース、80mMのKClを、15mMのNaCl、5mMのMgCl 2、1mMのEDTA、10mMのHEPESは、HClでpHを7.5に調整</td></tr><tr><td>シクロヘキシミド株式</td><td></td><td></td><td> 1水中で0 mg / mlである。 -20℃で保存して1mlのアリコート</td></tr><tr><td>サイトカラシンB株式</td><td></td><td></td><td> DMSO中5 mg / mlである。 -20℃で、20μlのアリコートを保存</td></tr><tr><td>ジチオスレイトール（DTT）の株式</td><td></td><td></td><td>水の中の1 M。 -20℃で保存して1mlのアリコート</td></tr><tr><td> ELB </td><td></td><td></td><td> 0.25Mスクロース、1mMのDTT、50μg/ mlのシクロヘキシミド、2.5mMのMgCl 2、50mMのKCl、10mMのHEPES、pH7.7 </td></tr><tr><td>ノコダゾール株式</td><td></td><td></td><td> DMSO中10 mg / mlである。 -80℃で5μlのアリコートを保存</td></tr><tr><td>エネルギー混合</td><td></td><td></td><td> 375 mMのクレアチンリン酸、50mMのATP、および25 mMのMgCl 2。アリコートを-80℃で保存されます</td></tr><tr><td>核色素溶液</td><td></td><td></td><td> 0.4μg/ mlのヘキスト33258、25％グリセロール（v / v）を、1×PBS中</td></tr><tr><td> Tautomycin株式</td><td></td><td></td><td> DMSO中の100μM。 -80℃で10μlアリコートを保存</td></tr></tbody></table>

study of the dna damage checkpoint using xenopus egg extracts

毎日のように、細胞は内因性と環境の様々な侮辱にさらされる。これらの侮辱に対抗するために、細胞はDNA損傷に対するDNA損傷と直接的な細胞応答を検知する監視機構としてシグナリングDNA損傷チェックポイントを進化させてきた。 DNA損傷チェックポイントシグナル（ 図1）に関わるセンサ、トランスデューサとエフェクターと呼ばれるタンパク質のいくつかのグループがあります。この複雑なシグナル伝達経路では、ATR（ATMとRAD3関連）がDNA損傷と複製ストレスに応答することができる主要なキナーゼの一つである。活性化されたATRは、そのようなのChk1（チェックポイントキナーゼ1）のような、その下流の基質をリン酸化することができます。その結果、リン酸化され、活性化されChk1は、細胞周期の停止、転写活性化、DNA損傷修復、アポトーシスや老化（ 図1）を含むDNA損傷チェックポイントには多くの下 ​​流効果につながる。 DNAが損傷されると、unrepでDNA損傷チェックポイントの結果を有効にするには失敗放映された被害と、その後、ゲノム不安定性。 DNA損傷チェックポイントの研究では、細胞は、ゲノムの完全性を維持する方法を解明し、癌などの方法ヒト疾患のより良い理解を提供し、開発していきます。 アフリカツメガエル卵抽出液は、DNA損傷チェックポイントの研究に強力な無細胞抽出液をモデル系として浮上している。低速抽出（LSE）は、当初、増井グループ1によって記述されていた。 DNAは細胞周期ごとに必ず一度、半保存方法で複製されている核形成のLSEの結果にdemembranated精子クロマチンの追加。 ATR/Chk1-mediatedチェックポイントシグナル伝達経路はDNA損傷や複製ストレス2によってトリガされます。 DNA損傷のアプローチとDNA損傷を模倣構造3：2つの方法は、現在、DNA損傷チェックポイントを誘導するために使用されています。 DNA損傷は、紫外線（UV）照射、γ線照射、メチルメタンによって誘導することができるesulfonate（MMS）、マイトマイシンC（MMC）、4 -ニトロキノリン-1 -オキシド（4-NQO）、またはアフィジコリン3、4。 MMSはDNA複製を阻害し、ATR/Chk1-mediated DNA損傷チェックポイントの活性化4-7アルキル化剤である。 UV照射もATR/Chk1-dependent DNA損傷チェックポイント8をトリガします 。 DNA損傷模倣構造AT70は、2つのオリゴヌクレオチド、ポリ - （DA）70とポリ（dT）を70のアニールされた複合体である。 AT70システムはビルダンフィーの研究室で開発したと9月12日 、広くATR/Chk1チェックポイントシグナル伝達を誘導するために使用されています。 ここでは、（2）DNA損傷模倣構造を準備するために2つの異なるDNA損傷のアプローチ（MMSとUV）、（3）でアフリカツメガエルの精子クロマチンを治療するために、無細胞卵抽出（LSE）を準備するためのプロトコルは、（1）について説明AT70、（4）損傷した精子クロマチンまたはDNA損傷を模倣する構造を持つLSEでATR/Chk1-mediated DNA損傷チェックポイントをトリガします。

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Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

アフリカツメガエルの卵抽出物は、DNA損傷チェックポイントを調査するために有用なモデル系である。このプロトコルは、 アフリカツメガエルの卵抽出物とDNA損傷チェックポイント誘導試薬の調製のためのものです。これらの技術は、DNA損傷チェックポイントシグナル伝達の研究ではDNA損傷の様々なアプローチに適応可能である。

用いたDNA損傷チェックポイントの研究<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;卵抽出

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

16.6K ビュー.  University of North Carolina at Charlotte. アフリカツメガエルの卵抽出物は、DNA損傷チェックポイントを調査するために有用なモデル系である。このプロトコルは、 アフリカツメガエルの卵抽出物とDNA損傷チェックポイント誘導試薬の調製のためのものです。これらの技術は、DNA損傷チェックポイントシグナル伝達の研究ではDNA損傷の様々なアプローチに適応可能である。

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Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

トカゲの運動の速度と方向の視覚感度のテスト

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

生物学

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In particular, understanding the constraints on visual signal design for communication has been of great interest. Traditional methods for investigating animal interactions have used basic observational techniques, staged encounters, or physical manipulation of morphology. Less intrusive methods have tried to simulate conspecifics using crude playback tools, such as mirrors, still images, or models. As technology has become more advanced, video playback has emerged as another tool in which to examine visual communication (Rosenthal, 2000). However, to move one step further, the application of computer-animation now allows researchers to specifically isolate critical components necessary to elicit social responses from conspecifics, and manipulate these features to control interactions. Here, I provide detail on how to create an animation using the Jacky dragon as a model, but this process may be adaptable for other species. In building the animation, I elected to use Lightwave  3D to alter object morphology, add texture, install bones, and provide comparable weight shading that prevents exaggerated movement. The animation is then matched to select motor patterns to replicate critical movement features. Finally, the sequence must rendered into an individual clip for presentation. Although there are other adaptable techniques, this particular method had been demonstrated to be effective in eliciting both conspicuous and social responses in staged interactions.

Computer-generated stimuli using the Jacky dragon as a model.

コンピュータによって生成された動物モデルの刺激

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

アフリカツメガエル卵抽出物の調製と分画

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

分別アフリカツメガエルの卵抽出を用いたin vitro核アセンブリで

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to generate maternal-effect mutant animals. Additionally, many of the techniques to overexpress or inhibit gene function in organisms such as Xenopus and zebrafish fail to sufficiently target critical maternal signaling pathways, such as Wnt signaling. In Xenopus, manipulating gene function in cultured oocytes and subsequently fertilizing them can ameliorate these problems to some extent. Oocytes are manually defolliculated from donor ovary tissue, injected or treated in culture as desired, and then stimulated with progesterone to induce maturation. Next, the oocytes are introduced into the body cavity of an ovulating host female frog, whereupon they will be translocated through the host's oviduct and acquire modifications and jelly coats necessary for fertilization. The resulting embryos can then be raised to the desired stage and analyzed for the effects of any experimental perturbations. This host-transfer method has been highly effective in uncovering basic mechanisms of early development and allows a wide range of experimental possibilities not available in any other vertebrate model organism.

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Procedure for fertilizing Xenopus oocytes by the host transfer method.

の受精アフリカツメガエル卵母細胞ホストの転送方式を使用して

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate mutations and chromosomal aberrations1. To prevent this trauma from catalyzing genomic instability, it is crucial for cells to detect DSBs, activate the DNA damage response (DDR), and repair the DNA. When stimulated, the DDR works to preserve genomic integrity by triggering cell cycle arrest to allow for repair to take place or force the cell to undergo apoptosis. The predominant mechanisms of DSB repair occur through nonhomologous end-joining (NHEJ) and homologous recombination repair (HRR) (reviewed in2). There are many proteins whose activities must be precisely orchestrated for the DDR to function properly. Herein, we describe a method for 2- and 3-dimensional (D) visualization of one of these proteins, 53BP1.
The p53-binding protein 1 (53BP1) localizes to areas of DSBs by binding to modified histones3,4, forming foci within 5-15 minutes5. The histone modifications and recruitment of 53BP1 and other DDR proteins to DSB sites are believed to facilitate the structural rearrangement of chromatin around areas of damage and contribute to DNA repair6. Beyond direct participation in repair, additional roles have been described for 53BP1 in the DDR, such as regulating an intra-S checkpoint, a G2/M checkpoint, and activating downstream DDR proteins7-9. Recently, it was discovered that 53BP1 does not form foci in response to DNA damage induced during mitosis, instead waiting for cells to enter G1 before localizing to the vicinity of DSBs6. DDR proteins such as 53BP1 have been found to associate with mitotic structures (such as kinetochores) during the progression through mitosis10.
In this protocol we describe the use of 2- and 3-D live cell imaging to visualize the formation of 53BP1 foci in response to the DNA damaging agent camptothecin (CPT), as well as 53BP1's behavior during mitosis. Camptothecin is a topoisomerase I inhibitor that primarily causes DSBs during DNA replication. To accomplish this, we used a previously described 53BP1-mCherry fluorescent fusion protein construct consisting of a 53BP1 protein domain able to bind DSBs11. In addition, we used a histone H2B-GFP fluorescent fusion protein construct able to monitor chromatin dynamics throughout the cell cycle but in particular during mitosis12. Live cell imaging in multiple dimensions is an excellent tool to deepen our understanding of the function of DDR proteins in eukaryotic cells.

This protocol describes a method for visualizing a DNA double-strand break signaling protein activated in response to DNA damage as well as its localization during mitosis.

DNA損傷応答タンパク質の2次元および3次元生細胞イメージング

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Many organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated that the majority of the transcriptome is localized to a nonrandom position in cells and embryos. One approach to identify localized mRNAs is to biochemically purify a cellular structure of interest and to identify all associated transcripts. Using recently developed high-throughput sequencing technologies it is now straightforward to identify all RNAs associated with a subcellular structure. To facilitate transcript identification it is necessary to work with an organism with a fully sequenced genome. One attractive system for the biochemical purification of subcellular structures are egg extracts produced from the frog Xenopus laevis. However, X. laevis currently does not have a fully sequenced genome, which hampers transcript identification. In this article we describe a method to produce egg extracts from a related frog, X. tropicalis, that has a fully sequenced genome. We provide details for microtubule polymerization, purification and transcript isolation. While this article describes a specific method for identification of microtubule-associated transcripts, we believe that it will be easily applied to other subcellular structures and will provide a powerful method for identification of localized RNAs.

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

We describe the collection of unfertilized Xenopus tropicalis eggs and production of a meiosis II-arrested egg extract. This egg extract can be used to purify microtubules and microtubule-associated RNAs.

の生産<em&gt;アフリカツメガエルトロピカ</em微小管関連RNAを識別するために、&gt;卵抽出

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

β-カテニンの分解にの再構成<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;卵抽出

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

マウス骨格筋におけるDNA損傷の検出と分析<em&gt;その場で</em&gt; TUNEL法を用いた

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

レトロウイルス統合サイトの増幅、次世代シーケンシング、およびゲノムDNAのマッピング

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

用いたDNA損傷チェックポイントの研究

要約

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