ツァイス共焦点システムの使用について、国立眼科研究所(NEI)の組織学コアに感謝します。この作業は、NEI IRP基金(助成金番号ZIA EY000533-04)によって支援されました。

網膜変性症のモデリングと解析

<ol>
	<li>Kanow, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+adaptations+of+the+retina+and+retinal+pigment+epithelium+support+a+metabolic+ecosystem+in+the+vertebrate+eye.">Biochemical adaptations of the retina and retinal pigment epithelium support a metabolic ecosystem in the vertebrate eye.</a> eLife. 6, e28899 (2017).</li><li>Adijanto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+utilizes+fatty+acids+for+ketogenesis.">The retinal pigment epithelium utilizes fatty acids for ketogenesis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 20570-20582 (2014).</li><li>Farnoodian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+lipid-handling+defects+in+Stargardt+iPSC-derived+retinal+pigment+epithelium+cells.">Cell-autonomous lipid-handling defects in Stargardt iPSC-derived retinal pigment epithelium cells.</a> Stem Cell Reports. 17 (11), 2438-2450 (2022).</li><li>Curcio, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+drusen+in+age-related+macular+degeneration:+Biology+and+targeting+via+the+oil+spill+strategies.">Soft drusen in age-related macular degeneration: Biology and targeting via the oil spill strategies.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 59 (4), AMD160-AMD181 (2018).</li><li>Cankova, Z., Huang, J. D., Kruth, H. S., Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passage+of+low-density+lipoproteins+through+Bruch's+membrane+and+choroid.">Passage of low-density lipoproteins through Bruch's membrane and choroid.</a> Experimental Eye Research. 93 (6), 947-955 (2011).</li><li>Curcio, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Esterified+and+unesterified+cholesterol+in+drusen+and+basal+deposits+of+eyes+with+age-related+maculopathy.">Esterified and unesterified cholesterol in drusen and basal deposits of eyes with age-related maculopathy.</a> Experimental Eye Research. 81 (6), 731-741 (2005).</li><li>Miyagishima, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPK+modulation+ameliorates+dominant+disease+phenotypes+of+CTRP5+variant+in+retinal+degeneration.">AMPK modulation ameliorates dominant disease phenotypes of CTRP5 variant in retinal degeneration.</a> Communications Biology. 4 (1), 1360 (2021).</li><li>Sharma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+phenotype+restoring+drugs+suppress+macular+degeneration+phenotypes+in+an+iPSC+model.">Epithelial phenotype restoring drugs suppress macular degeneration phenotypes in an iPSC model.</a> Nature Communications. 12 (1), 7293 (2021).</li><li>Farnoodian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+lipid-handling+defects+in+Stargardt+iPSC-derived+retinal+pigment+epithelium+cells.">Cell-autonomous lipid-handling defects in Stargardt iPSC-derived retinal pigment epithelium cells.</a> Stem Cell Reports. 17 (11), 2438-2450 (2022).</li><li>Hallam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+induced+pluripotent+stem+cell+patient+specific+model+of+complement+factor+H+(Y402H)+polymorphism+displays+characteristic+features+of+age-related+macular+degeneration+and+indicates+a+beneficial+role+for+UV+light+exposure.">An induced pluripotent stem cell patient specific model of complement factor H (Y402H) polymorphism displays characteristic features of age-related macular degeneration and indicates a beneficial role for UV light exposure.</a> Stem Cells (Dayton, Ohio). 35 (11), 2305-2320 (2017).</li><li>Sharma, R., Bose, D., Montford, J., Ortolan, D., Bharti, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triphasic+developmentally+guided+protocol+to+generate+retinal+pigment+epithelium+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Triphasic developmentally guided protocol to generate retinal pigment epithelium from induced pluripotent stem cells.</a> STAR Protocols. 3 (3), 101582 (2022).</li><li>Issa, P. C., Barnard, A. R., Herrmann, P., Washington, I., MacLaren, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+the+Stargardt+phenotype+in+Abca4+knockout+mice+through+inhibition+of+vitamin+A+dimerization.">Rescue of the Stargardt phenotype in Abca4 knockout mice through inhibition of vitamin A dimerization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8415-8420 (2015).</li><li>GBD 2019 Blindness and Vision Impairment Collaborators. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blindness+and+Vision+Impairment+Collaborators.+Causes+of+blindness+and+vision+impairment+in+2020+and+trends+over+30+years,+and+prevalence+of+avoidable+blindness+in+relation+to+VISION+2020:+the+Right+to+Sight:+an+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study.">Blindness and Vision Impairment Collaborators. Causes of blindness and vision impairment in 2020 and trends over 30 years, and prevalence of avoidable blindness in relation to VISION 2020: the Right to Sight: an analysis for the Global Burden of Disease Study.</a> Lancet Global Health. 9 (2), e144-e160 (2021).</li></ol>

開示なし。

このプロトコルは、変性眼疾患の単一遺伝子および多遺伝子 のin vitro 疾患モデルにおいて脂質沈着を効率的に標識、画像化、および定量する方法を提供します。AIベースのソフトウェアであるLipidUNetは、APOE、ナイルレッド、およびBODIPYの3つの一般的な脂質マーカーに適用でき、定量を標準的かつ偏りのない高速自動分析方法を提供します。
LipidUNetの主な制限は、AIのトレーニングデータセットが96ウェルプレートで培養された細胞の40倍の倍率画像に制限されていたという事実です。トレーニング画像セットの結果として、LipidUNetは、現在の形式では、40倍の倍率画像の分析に限定されます。このソフトウェアは、96ウェルプレート以外の他の培養表面で培養された細胞の40倍の画像を分析するために使用できますが、ソフトウェアによる正確な閾値を検証するために、生成された出力マスクを調べるように注意する必要があります。分析できるサンプル/画像の範囲を拡大するには、より多くの画像セット(異なる倍率)が必要になります。
プロトコルにはいくつかの重要なステップがあります。脂質マーカーステップでは、ユーザーは選択した標識化合物(BODIPY、APOE、ナイルレッド)がサンプルを効果的に標識したことを確認する必要があります。成熟RPE細胞は色素沈着が強いことが多く、抗体免疫染色の蛍光シグナルを損なう可能性があります。蛍光シグナルが弱い場合やバックグラウンド染色が多すぎる場合、LipidUNetは脂肪滴を正確に識別できません。同様の理由から、プロトコルの自動イメージングステップに対して適切に選択された取得設定を使用する必要があります。取得した画像の品質が低い場合、LipidUNetは画像を適切にマスクするのに苦労するため、定量化は不正確になります(図6A-L)。最後に、LipidUNetにはソフトウェアが機能するための特定の要件があるため、画像の後処理は重要なステップです。
手動閾値を使用する脂質分析のワークフロー、またはフィジーのようなソフトウェアで自動閾値化を含む技術と比較すると、LipidUNetは、脂質粒子の同定における小さなエラー率に反映されるように、可変脂質沈着を伴う画像全体で非バイアスで信頼性の高いセグメンテーションを提供します(図7)。このソフトウェアでは、追加のトレーニング画像をユーザーが入力できるため、プロトコルで概説されているように、40倍の倍率の対物レンズを利用する画像セットや、異なる脂質マーカーを利用する画像セットの解析も可能です。将来的には、脂質沈着量の定量化が可能になるように、3D画像を解析するようにソフトウェアをトレーニングする予定です。脂質沈着を病態の主な原因とする変性眼疾患が蔓延しており、高齢者人口の拡大に伴い症例が増加すると予測されています13。このプロトコルで概説したように、正確な疾患モデルと効率的な分析ツールは、新しい治療介入の開発を可能にします。

網膜色素上皮(RPE)は、網膜光受容体に隣接する眼の後ろに位置する細胞の単層です。RPEは、光受容体に代謝的および構造的サポートを提供することにより、適切な視力を維持する上で重要な役割を果たします。健康なRPE細胞は、明確な六方晶形態によって特徴付けられる。それらはタイトジャンクションによって接続されており、RPEはその基底側に位置する絨毛毛細血管と頂端に位置する光受容体との間の障壁として作用することを可能にする。網膜生態系を維持するために、RPEは、RPE1におけるグルコース消費を最小限に抑える方法で、主要な代謝産物、例えばグルコースを光受容体にシャトルする。この制限により、RPEは、β酸化によってケトンに変換する脂肪酸を含む、代謝ニーズを維持するために他の代謝物に依存しています2。視細胞外帯(POS)消化からリサイクルされる可能性が高い脂肪酸をエネルギー源として利用するRPEの傾向を考えると、RPEの脂質処理経路の有害な変化は、単遺伝子性および多遺伝子性変性網膜疾患の両方につながるか、関与することがよくあります3。
RPE変性を引き起こす多遺伝子性変性眼疾患である加齢黄斑変性症(AMD)も、RPE単層における異常なオートファジーおよび脂質代謝に関連しています。機能不全のRPE単層がPOSを処理し、他の重要な機能を実行できないと、RPEとブルッフ膜の間に位置する基底線形沈着物(BLinD)と呼ばれる細胞外(サブRPE)沈着物が発生します-AMD病理の特徴です。BLinDの主成分にはリポタンパク質が含まれ、その中で最も豊富なのはアポリポタンパク質E(APOE)4です。BLinDの薄層の蓄積は、AMD 5,6の臨床症状として認識されている柔らかいドルーセンにつながる可能性があります。
いくつかのグループは、RPE機能障害を引き起こす幹細胞由来のin vitro疾患モデルがサブRPE脂質蓄積を特徴とすることを示しています7、8、9。Hallam et al. (2017)は、CFH遺伝子の多型によりAMDのリスクが高い患者から人工多能性幹細胞由来RPE(iRPE)を生成しました。iRPEはAPOEでマークされるようにドルーゼン蓄積を示し、高リスクRPEは低リスク患者から生成されたiRPEよりも大きな沈着物を蓄積しました10。
脂肪滴やドルーゼン沈着などのAMDの細胞の特徴を再現する in vitro モデルを作成するために、患者の血液サンプルから生成されたiRPEラインを、以前に公開された発達ガイドプロトコル11を使用して確立しました。iRPEは、AMDの考えられる原因の1つである代替補体シグナル伝達の増加を模倣するアナフィラトキシンを含む溶液である補体コンピテントヒト血清(CC-HS)に供されました8。得られた脂質沈着物の細胞内沈着を、一般的に使用される脂質およびリポタンパク質マーカー、APOE、ナイルレッド、およびBODIPYを用いて測定した。これらのマーカーを通じて、CC-HSを介した活性化補体シグナル伝達がiRPE細胞8における脂質蓄積を悪化させることが示された。
単遺伝子網膜変性疾患の疾患モデルを開発するために、RPEの ABCA4 遺伝子の変異によって引き起こされる疾患であるスターガルト病の患者からiRPE株を開発しました。 ABCA4 がノックアウトされると、高レベルのリン脂質と光依存性脂質過酸化生成物を含むことが知られている細胞内沈着物であるA2EリポフスチンがRPE12の内部に蓄積することが以前に示されています。 ABCA4 ノックアウトラインは患者ラインと一緒に開発され、両方ともPOS給餌を受けました。Stargardt iRPEは、POS食作用誘発病理を示し、BODIPY染色によって定量化された脂質蓄積の増加を示しました。 ABCA4 KO由来のRPEをCC-HS処理した。BODIPYシグナルの定量化は、同様にスターガルト病モデルにおける脂質取り扱いの欠陥を示した9。
これらの疾患の有病率と効果的な治療法の必要性を考えると、上記の関連する疾患モデルとともに、潜在的な治療法の有効性を定量化するための堅牢な方法を確立する必要があります。客観的、自動化、標準化された方法で脂質沈着を定量するために、機械学習ベースのソフトウェアであるLipidUNetが作成され、マスク分析ツールと組み合わせると、一般的なマーカーであるNile Red、BODIPY、およびAPOEを使用して脂質沈着を迅速かつ効果的に識別できます。この分析パイプラインを使用して得られた要約統計量は、分析してグラフィカルに表示することができ、治療条件の比較が容易になります。プロトコルの回路図を 図1に示します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig01.jpg"> 図1:プロトコルの概略図:RPE細胞を96ウェルプレート上で増殖させ、活性ヒト血清または精製ウシ外側セグメントでチャレンジして、in vitroでさまざまな種類の網膜変性をモデル化します。RPE細胞は、ナイルレッド、ボディピー、およびAPOEでリポタンパク質沈着物について固定および染色されます。共焦点顕微鏡を使用して、蛍光標識された脂質粒子のZスタックを取得し、その後、2D最大強度投影に加工します。機械学習アルゴリズムは、リポタンパク質粒子を認識して正しくセグメント化するようにトレーニングされました。粒子数とさまざまな形状メトリックを含むサマリーテーブルが生成され、その後のプロットと統計分析に使用できます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Steriflip filter system</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;,5-Triiodo-L-thyronine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin Bovine, Fraction V</td>
			<td>MP Biomedical</td>
			<td>160069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 rabbit anti-goat IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21431</td>
			<td>APOE secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APOE primary antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY 493/503</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D3922</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complement competent human serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S1-LITER</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS N2 Supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A13707-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>Slide mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Cover Slips #1 1/2 22 mm x 22 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72204-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Microscope Slide 25 mm x 75 mm- 1.2 mm Thick</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71870-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Alpha</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12571-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential Amino Acids</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nile Red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72485-100MG</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% Solution, EM Grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Strep</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline 10x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rod Outer Segments (OS)</td>
			<td>InVision Bioresources</td>
			<td>98740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S1888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1725274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20 Ultrapure</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitronectin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A14701SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lipidunet-machine learning-based method of characterization and quantification of lipid deposits using ipsc-derived retinal pigment epithelium

網膜色素上皮(RPE)は、目の後ろにある六角形の細胞の単層です。光受容体と脈絡膜毛細血管に栄養とサポートを提供し、光受容体外側セグメント(POS)の食作用を行い、外網膜の恒常性を維持するために二極的にサイトカインを分泌します。突然変異、加齢、環境要因によって引き起こされる機能不全のRPEは、他の網膜層の変性をもたらし、視力喪失を引き起こします。変性RPEの特徴的な表現型の特徴は、細胞内および細胞内の脂質リッチ沈着物です。これらの沈着物は、さまざまな網膜変性疾患に共通の表現型です。単遺伝子網膜変性の脂質沈着表現型を in vitroで再現するために、患者の線維芽細胞から人工多能性幹細胞由来RPE(iRPE)を作製した。Stargardtおよび遅発性網膜変性症(L-ORD)の患者から作製した細胞株にPOSを7日間与えて、RPE生理機能を再現し、これらの疾患でPOS食作用誘発病理を引き起こしました。代替補体活性化に関連する多遺伝子性疾患である加齢黄斑変性症(AMD)のモデルを生成するために、iRPEは代替補体アナフィラトキシンで挑戦されました。細胞内および細胞内脂質沈着物は、ナイルレッド、ホウ素ジピロメテン(BODIPY)、およびアポリポタンパク質E(APOE)を使用して特徴付けられました。脂質沈着物の密度を定量化するために、機械学習ベースのソフトウェアであるLipidUNetが開発されました。このソフトウェアは、培養表面上のiRPEの最大強度投影画像でトレーニングされました。将来的には、3次元(3D)画像を解析し、脂肪滴の体積を定量化するように訓練される予定です。LipidUNetソフトウェアは、疾患モデルにおける脂質蓄積を減少させる薬剤を発見するための貴重なリソースとなるでしょう。

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of cells located in the back of the eye adjacent to retinal photoreceptors. RPE plays a vital role in maintaining proper vision by providing metabolic and structural support to the photoreceptors. Healthy RPE cells are characterized by a distinct hexagonal morphology. They are connected by tight junctions, which allow the RPE to act as a barrier between the choriocapillaris located on its basal side and photoreceptors located apically. To maintain the retinal ecosystem, RPE shuttles key metabolites, e.g., glucose, to photoreceptors in a way that minimizes glucose consumption in the RPE1. Due to this limitation, RPE depends on other metabolites to maintain their metabolic needs, including fatty acids, which RPE converts to ketones through &#946;-oxidation2. Given the propensity of RPE to utilize fatty acids, which are likely recycled from photoreceptor outer segment (POS) digestion, as an energy source, detrimental changes to the lipid processing pathways in RPE often lead to, or are implicated in, both monogenic and polygenic degenerative retinal diseases3.
Age-related macular degeneration (AMD), a polygenic degenerative eye disease that causes RPE degeneration, has also been linked to aberrant autophagy and lipid metabolism in the RPE monolayer. The failure of a dysfunctional RPE monolayer to process POS and perform other critical functions leads to extracellular (sub-RPE) deposits called basal linear deposits (BLinD) located between the RPE and Bruch&#39;s membrane - a hallmark of AMD pathologies. Major components of BLinD include lipoproteins, the most abundant of which is apolipoprotein E (APOE)4. Accumulation of thin layers of BLinD can lead to soft drusen, which is recognized as a clinical symptom of AMD5,6.
Several groups have shown that stem cell-derived in vitro disease models that cause RPE dysfunction feature sub-RPE lipid accumulation7,8,9. Hallam et al. (2017) generated induced pluripotent stem cell-derived RPE (iRPE) from patients with a high risk for AMD due to a polymorphism of the CFH gene. The iRPE showed drusen accumulation, as marked by APOE, and the high-risk RPE accumulated larger deposits than iRPE generated from low-risk patients10.
To create an in vitro model that recapitulates cellular hallmarks of AMD, such as lipid droplets and drusen deposition, iRPE lines generated from patient blood samples were established using a previously published developmentally guided protocol11. The iRPE were subjected to complement-competent human serum (CC-HS), a solution containing anaphylatoxins that mimic one possible cause of AMD: increased alternate complement signaling8. The resulting cellular and sub-cellular deposition of lipid deposits was measured using commonly used lipid and lipoprotein markers, APOE, Nile Red, and&#160;BODIPY. Through these markers, it was shown that activated complement signaling via CC-HS exacerbated lipid accumulation in iRPE cells8.
To develop a disease model for a monogenic retinal degenerative disease, iRPE lines were developed from patients with Stargardt disease, a disease caused by mutations to the ABCA4 gene in RPE. It has previously been shown that when ABCA4 is knocked out, A2E lipofuscin, an intracellular deposit known to contain high levels of phospholipids and light-dependent lipid peroxidation products, accumulates inside the RPE12. ABCA4 knockout lines were developed alongside the patient lines, and both were subjected to POS feeding. The Stargardt iRPE demonstrated POS phagocytosis-induced pathology, exhibiting increased lipid accumulation quantified by BODIPY staining. RPE derived from ABCA4 KO iPSCs were subjected to CC-HS treatment; quantification of the BODIPY signal showed a defect in lipid handling in the Stargardt disease model as well9.
Given the prevalence of these diseases and the need for effective therapeutics, along with the relevant disease models described above, there is a need to establish robust methods for quantifying the efficacy of potential treatments. To quantify lipid deposits in a way that is objective, automated, and standardized, a machine-learning-based software, LipidUNet, was created so that, when paired with mask analysis tools, lipid deposition can quickly and effectively be identified using the common markers Nile Red, BODIPY, and APOE. The summary statistics obtained using this analysis pipeline can then be analyzed and displayed graphically, allowing for easy comparison of treatment conditions. The schematic of the protocol is shown in Figure 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig01.jpg" /> 
Figure 1: Schematic of the protocol: RPE cells are grown on a 96-well plate and challenged with active human serum or purified bovine outer segments to model different types of retinal degenerations in vitro. RPE cells are fixed and stained for lipoprotein deposits with Nile Red, BODIPY, and APOE. A confocal microscope is used to acquire Z-stacks of fluorescently-labeled lipid particles, which are subsequently processed into 2D maximum intensity projections. A machine-learning algorithm was trained to recognize and correctly segment lipoprotein particles. Summary tables containing particle count and various shape metrics are generated and can be used for subsequent plotting and statistical analysis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

著者スポットライト:加齢性黄斑変性の病因を解明し、潜在的な治療法を発見する 

LipidUNet-機械学習に基づくiPS細胞由来網膜色素上皮を用いた脂質沈着物のキャラクタリゼーション・定量法

In this study, we aim to understand the age-related macro degeneration pathogenesis and find the potential treatment for it. This semi-automated pipeline for lipid droplet analysis provides a robust system to study metabolism and aging diseases. Our lab focuses on finding drug targets for the treatment of AMD either using genetic or small molecule screens that aimed at reducing the accumulation of lipid deposits.

このプロトコルは、ナイルレッド、ボディピー、およびAPOEによって染色された脂質沈着物を特定するためのワークフローを提供します。開発されたソフトウェアは、脂質沈着物を自動的に識別して定量することができ、概説されたプロトコルが最適化されたときに最高のパフォーマンスを発揮します。細胞モデルの品質は適切な画像セグメンテーションの品質に大きく影響するため、分化に成功したRPE(図3A)と低分化したRPE(図3B)の例が含まれています。
プロトコルに記載されている3つのマーカーのうち2つ、ナイルレッドとボディピーは、蛍光画像ではっきりと明るい小さな円形のポイントとして識別されます(図5および図6)。プロトコルからの「ポジティブ」画像は、これらの異なる堆積物の適切な識別です(図5A-Dおよび図5E-H)。「ネガティブ」の結果は、弱い染色(図6A-Cおよび図6D-F)または高いバックグラウンド強度(図6G-I)のいずれかのために、バックグラウンド蛍光を堆積物と間違えることにより、画像の誤ったセグメンテーションを示します。
APOE鉱床にはさまざまなサイズと形状があり、ナイルレッドやボディピーの円形の堆積物ではなく、より楕円形または不規則に見えます。これらの堆積物はまた、点状が少なく、サンプルの透過性の変動により、信号強度が堆積物間で異なる可能性があります。正しい識別は、飽和度の低いものを含む各鉱床を識別しますが(図5I-L)、誤ったセグメンテーションはこれらの鉱床を拾いません(図6J-L)。したがって、急激なばらつきを避けるために、染色およびイメージング方法を最適化することが重要です。これを行う1つの方法は、免疫染色中にサンプルの透過処理ステップに注意を払うことです。蛍光シグナルを最適化するために、APOEの固定および免疫染色の前に細胞を溶解することができ、その結果、APOE沈着物の均一な飽和とより良いセグメンテーションが得られます。
96ウェルプレート以外の培養プラットフォームで成熟した細胞のセグメント化された画像も提供される。LipidUNetソフトウェアは、トランスウェルで培養された細胞の画像で実行され、脂質沈着物が閾値化される一方で、トランスウェル膜の細孔も閾値化されます(図6M-O)。形状とサイズが類似しているため、現在の形のLipidUNetソフトウェアは、脂質沈着物とトランスウェル孔の両方を無差別にマスクします。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig05.jpg"> 図5:代表的な結果。 (A、E、I)96ウェルメッキRPEは、ヘキスト核染色(青)およびナイルレッド(マゼンタ)、ボディピー(緑)、またはAPOE(オレンジ)のいずれかで染色され、Zスタックの最大強度投影です。(B,F,J)画像処理後のLipidUNetソフトウェアのグレースケール入力画像。(C,G,K)すべての堆積物が正しく識別されるLipidUNetによって生成されたマスク。(D,H,L)マスクされた各パーティクルのアウトラインには番号が付けられます。これらのラベルを使用すると、画像内の各粒子を生データを含むスプレッドのエントリに接続できます。(A-D)はナイルレッド染色を示しており、ソフトウェアは弱い信号にもかかわらずバックグラウンドに対する堆積物を正確に認識することができます。(E-H)は、BODIPY信号とバックグラウンドの間に強いコントラストを示し、これは理想的です。LipidUNetは、画像内のすべての堆積物を正しく識別します。(I-L)は強いAPOEシグナルを示し、この染色でよく見られるシグナル飽和の変動性を表します。それにもかかわらず、画像セグメンテーションは各APOEデポジットの境界を識別することができます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig06.jpg"> 図6:最適ではない結果。 (A、D、G、J、M)96ウェルメッキRPEは、ヘキスト核染色(青)およびナイルレッド(マゼンタ)、ボディピー(緑)、またはAPOE(オレンジ)のいずれかで染色され、Zスタックの最大強度投影です。(B,E,H,K,N)画像処理後のLipidUNetソフトウェアのグレースケール入力画像。(C,F,I,L,O)LipidUNetによって生成されたマスクが正しくありません。赤い円は、ソフトウェアが脂質沈着物を誤って識別した場所を示します。(A-C) ソフトウェアがバックグラウンド染色を堆積物として識別したため、Nile Redの処理が正しくありません。これは、画像にバックグラウンドは高いが脂質沈着物がほとんどない場合に、より頻繁に発生する可能性があります。BODIPY染色の2つの例が示されています:(D-F)弱いBODIPY染色による低品質の画像と(G-I)高いバックグラウンドの強いBODIPYシグナル。どちらの場合も、ソフトウェアは、核を囲む背景の円形リングから小さな円形の脂質沈着物を区別することができません。染色とイメージングはこれらのエラーを回避するために最適化する必要がありますが、最新バージョンのLipidUNetはこれらの画像に対して大幅に改善されています。(J-L)APOEセグメンテーションが正しくありません。堆積物は信号のサイズと飽和度がより可変であるため、ソフトウェアはいくつかの堆積物を認識するのが困難です。(M-O)RPEをトランスウェルに播種し、ナイルレッドで染色した。Zスタックのスライスは、ナイルレッド脂質沈着物とトランスウェル孔の両方とともにここに示されています。ソフトウェアは、トランスウェル孔を含む赤い円とナイルレッド鉱床を指す緑色の矢印で示されているように、2つを区別できません。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig07.jpg"> 図7:マスクツールの比較 。 (A、B、C)脂質沈着量が変動する96ウェルメッキRPEは、ナイルレッド(赤)で識別されます。画像は、最大検索、最大エントロピー、およびRenyiエントロピーの3つの異なる一般的なマスク方法を使用してマスクされ、LipidUNetで生成されたマスクと比較されます。元の画像には脂質沈着物の手動カウントが添付され、マスクには各セグメンテーション方法による予測カウントが表示されます。平均エラー率は、次の式を使用してセグメンテーションの各方法について計算されました:mean[(|予測カウント - 手動カウント|/手動カウント) x 100]。LipidUNetで生成されたマスクは、他のマスキング方法と比較して、沈着が変動する画像全体で脂質沈着をより正確に識別します(平均エラー率:23%LipidUnet、1164%Find Maxima、851%最大エントロピー、203%Renyiエントロピー)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig07large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>コンポーネント</td>
			<td>猫番号</td>
			<td>ストックコンク</td>
			<td>最終コンク</td>
			<td>ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>MEM アルファ</td>
			<td>12571-063</td>
			<td>該当なし</td>
			<td></td>
			<td>500</td>
		</tr><tr><td>N2サプリメント</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>該当なし</td>
			<td>1%</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>熱不活性化FBS</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>該当なし</td>
			<td>5%</td>
			<td>25</td>
		</tr><tr><td>NMEM NEAA</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>10ミリメートル</td>
			<td>0.01ミリメートル</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>100ミリメートル</td>
			<td>1ミリメートル</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>10000u/mL</td>
			<td>100U/mL</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>タウリン</td>
			<td>T4571</td>
			<td>50ミリグラム/ミリリットル</td>
			<td>250グラム/ミリリットル</td>
			<td>2.5</td>
		</tr><tr><td>ヒドロコルチゾン</td>
			<td>H6909</td>
			<td>18.1ミリグラム/L</td>
			<td>20ug / L</td>
			<td>0.553</td>
		</tr><tr><td>T3</td>
			<td>T5516</td>
			<td>20ug / L</td>
			<td>0.013ug/L</td>
			<td>0.33</td>
		</tr><tr><td colspan="4">総容量、mL</td>
			<td>548.383</td>
		</tr></tbody></table>表1:RPE-MM試薬組成。 RPE-MMの試薬と最適濃度のリスト。

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眼の網膜色素上皮層に影響を及ぼす変性眼疾患は、単一遺伝子および多遺伝子起源を有する。いくつかの疾患モデルとソフトウェアアプリケーションであるLipidUNetは、疾患のメカニズムと潜在的な治療介入を研究するために開発されました。

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of hexagonal cells located at the back of the eye. It provides nourishment and support to ...

本研究では、加齢に伴うマクロ変性の病態解明と治療法の発見を目指します。脂質滴分析用のこの半自動パイプラインは、代謝および老化疾患を研究するための堅牢なシステムを提供します。私たちの研究室では、脂質沈着物の蓄積を減らすことを目的とした遺伝子スクリーニングまたは低分子スクリーニングのいずれかを使用して、AMDの治療のための創薬標的を見つけることに焦点を当てています。

lipidunet-machine-learning-based-method-characterization

Research

JoVE Journal

Biology

LipidUNet-Machine Learning-Based Method of Characterization and Quantification of Lipid Deposits Using iPSC-Derived Retinal Pigment Epithelium

1.7K ビュー.  National Institutes of Health (NIH). 本研究では、加齢に伴うマクロ変性の病態解明と治療法の発見を目指します。脂質滴分析用のこの半自動パイプラインは、代謝および老化疾患を研究するための堅牢なシステムを提供します。私たちの研究室では、脂質沈着物の蓄積を減らすことを目的とした遺伝子スクリーニングまたは低分子スクリーニングのいずれかを使用して、AMDの治療のための創薬標的を見つ?...

ビデオ: 著者スポットライト:加齢性黄斑変性の病因を解明し、潜在的な治療法を発見する 

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of hexagonal cells located at the back of the eye. It provides nourishment and support to photoreceptors and choroidal capillaries, performs phagocytosis of photoreceptor outer segments (POS), and secretes cytokines in a polarized manner for maintaining the homeostasis of the outer retina. Dysfunctional RPE, caused by mutations, aging, and environmental factors, results in the degeneration of other retinal layers and causes vision loss. A hallmark phenotypic feature of degenerating RPE is intra and sub-cellular lipid-rich deposits. These deposits are a common phenotype across different retinal degenerative diseases. To reproduce the lipid deposit phenotype of monogenic retinal degenerations in vitro, induced pluripotent stem cell-derived RPE (iRPE) was generated from patients&#39; fibroblasts. Cell lines generated from patients with Stargardt and Late-onset retinal degeneration (L-ORD) disease were fed with POS for 7 days to replicate RPE physiological function, which caused POS phagocytosis-induced pathology in these diseases. To generate a model for age-related macular degeneration (AMD), a polygenic disease associated with alternate complement activation, iRPE was challenged with alternate complement anaphylatoxins. The intra and sub-cellular lipid deposits were characterized using Nile Red, boron-dipyrromethene (BODIPY), and apolipoprotein E (APOE). To quantify the density of lipid deposits, a machine learning-based software, LipidUNet, was developed. The software was trained on maximum-intensity projection images of iRPE on culture surfaces. In the future, it will be trained to analyze three-dimensional (3D) images and quantify the volume of lipid droplets. The LipidUNet software will be a valuable resource for discovering drugs that decrease lipid accumulation in disease models.

Degenerative eye diseases that affect the retinal pigment epithelium layer of the eye have monogenic and polygenic origins. Several disease models and a software application, LipidUNet, have been developed to study mechanisms of disease, as well as potential therapeutic interventions.

生物学

Staining of Sub-Retinal Pigment Epithelium (RPE) Deposits

To begin, dissolve Nile Red powder in acetone at three milligrams per milliliter concentration. Incubate the solution for 15 minutes at room temperature with periodic mixing. Filter the solution using a 0.22-micrometer filter once or twice depending on the amount of precipitate remaining in the solution.Then prepare the working solution by diluting the stock solution at a one-to-500 ratio in DPBS. Add 200 microliters of the working solution to the paraformaldehyde-fixed RPE cells and incubate for 30 minutes at room temperature on a shaker protecting from light. After incubation, wash the samples twice with DPBS, then add 200 microliters of DPBS, and store them at four degrees Celsius.For BODIPY staining, prepare a 3.8-millimolar stock concentration by dissolving BODIPY in anhydrous DMSO. Then prepare the working solution by diluting the stock solution at a one-to-300 ratio in DPBS. Add 200 microliters of the working solution of BODIPY to paraformaldehyde-fixed RPE cells and incubate overnight on a rocker at room temperature.The next day, wash the cells twice with DPBS and add 200 microliters of DPBS before storing them at four degrees Celsius. For APOE immunostaining, prepare a buffer solution by combining DPBS with 1%BSA, 0.5%Tween 20, and 0.5%Triton X-100. Block and permeabilize the paraformaldehyde-fixed RPE cells in 200 microliters of buffer solution for one hour.After incubation, add APPLE primary antibody diluted at one-to-100 in the buffer solution and incubate overnight at room temperature. The following day, wash the samples twice with DPBS. Then add 200 microliters of secondary antibody solution diluted at one-to-1000 for one hour at room temperature.After incubation, wash the cells twice with DPBS and add 200 microliters of DPBS before storing them at four degrees Celsius.

網膜下色素上皮(RPE)沈着物の染色

Image Processing of REP Deposits, Segmentation, and Quantification

Using a confocal microscope and a 40X objective, create a scan profile with the appropriate fluorescent channels for the lipid marker used. After setting up the acquisition mode and channels, optimize the focus strategy by clicking on Software Autofocus. Then set the range of the Z Stack to 20 microns.After this, optimize tiles and open the viewer to select the tile positions. Next, using a batch image processing method, create maximum projections of each Z Stack with the extended depth of focus method. Before exporting the images, set the compression to none and ensure original data is checked.The resulting image is a maximum projection gray scale TIFF of only the fluorescence channel, expressing the lipid marker. Identify the TIFF images representing either Nile Red, BODIPY, or APOE and move them into the Images folder within a directory named either Nile Red, BODIPY, or APOE, depending on the method being used. Open the lipid unit software.In the Predict tab, select the relevant directory by clicking on the ellipsis and navigating to the named directory. Confirm that lipid unit has identified the images correctly by checking the class entry. Click Predict to observe the task progress, then using the Mask Analysis tool, iterate through the generated masks and provide a quantitative count of the threshold lipid deposits from the mask images.Successful differentiation and maturation of RPE showed a confluent monolayer with pigmentation and polygonal morphology. In contrast, unsuccessful differentiation showed clusters of dying cells. In fluorescent images, Nile Red and BODIPY deposits appeared as small, bright circular points.A negative result shows incorrect image segmentation by mistaking background fluorescence as a deposit, either due to weak staining or high background intensity. APOE deposits varying in size, shape, and signal intensity and requiring optimization of staining and imaging methods to minimize variation are shown.