この研究は、RDWの国立科学財団のキャリア賞（MCB - 0746066、創発行動を規制する転写活性化因子の特性）によって可能となった私たちは、原稿上で有用な議論やコメントのためのLJシムカス、BSゴールドマン、G.孫、M.歌手、LGウェルチ、KAマーフィー、およびHGテイラーに感謝しています。

消耗品は必要なもの： <ul><li>クレットメートル</li><li>ピペットとヒント</li><li> 2.5ミリリットルマイクロ遠心チューブ</li><li>マイクロ遠心機</li><li> CTTYEメディア： <ul><li> 1.0％Casitone（ディフコ社）、0.5％酵母エキス（ディフコ社）、 </li><li> 10.0 mMトリス塩酸（pH8.0）、1.0mMのKH 2 PO 4、8.0 mMのMgSO 4を </li></ul></li><li> TPMメディア： <ul><li> 10.0 mMトリス塩酸（pH8.0）、1.0mMのKH 2 PO 4、8.0 mMのMgSO 4を </li></ul></li><li>アガロース</li><li> 55 ° Cに設定したウォーターバス</li><li>顕微鏡用スライドガラス</li><li>大きなガラス製カバースリップ</li><li> 2 × 2センチ、0.5 mm厚のシリコーンゴムガスケット（グレースバイオラボ社） </li><li>パラフィルム（またはテープにラベルを付ける） </li><li>鉗子</li><li>小さなバインダークリップ</li><li>マイクロサンプリングピペット（フィッシャー） </li><li> 100μlのガラスディスポチップ（フィッシャー） </li><li>キムワイプ</li></ul>パート1：セルの準備無菌環境を作成することから始めます。 <ul><li>クリーンワークスペース、ドン手袋、および光バーナー。 </li></ul><ol><li> CTTYEブロスを含むフラスコに接種し、精力的な渦巻きで32℃の暗所でインキュベートして細胞の一晩培養を開始します。 </li><li>かつての文化は、2.5 mlマイクロチューブに5 × 10 8細胞/ ml、ピペット1mlの細胞の密度に達した。 </li><li> 16000 XG（または最高速度）で2分間の遠心分離により細胞をペレット化する。 </li><li>デカントして上清を捨てる。 </li><li> 1ミリリットルTPM（塩バランス、栄養培地）で細胞ペレットを洗浄する。 <ul><li>再サスペンドと渦</li></ul></li><li> 16000 XG（または最高速度）で2分間回転させて再細胞をペレット化。 </li><li>デカントして上清を捨てる。 重要なステップ </li><li>完全にピペッティングし、ボルテックスの組み合わせを使用して100μlのTPMのメディアでペレットを再懸濁する。 重要：このステップでは、チューブに残っている細胞のない塊がないことを保証します。これには時間がかかることがあります。 </li><li>追跡アッセイプレートを準備しながら、室温で脇にセルを設定します。 </li></ol>パート2：寒天の準備<ol><li> TPM（アッセイ培地）とCTTYE（栄養ディスク）メディアの両方を50mlを準備します。 </li><li>各（アガロースは寒天より小さい回折である）で0.5 Gアガロースを追加。 </li><li>滅菌にオートクレーブ。 </li><li>追跡アッセイプレートの複合体を構築しながら滅菌した後、55℃インキュベーターでC（または水浴）でメディアを維持する。 </li></ol>パート3：ニュートリティブディスクの構築<ol><li>小さなウェルを形成、火炎滅菌したガラスの顕微鏡スライドの上に滅菌した0.5 mm厚のシリコーンゴムのガスケットを置きます。 </li><li>ピペットでよく、スライド上のガスケットによって作成され、栄養ディスクを含むに55℃CTTYEメディア/アガロースを300μl。 CTTYEメディア/アガロースは、マウンドアップすべき。 </li><li> CTTYEメディア/アガロースの上に火炎滅菌スライドを（なしガスケット付き）に置きます。 重要：このスライドは、形成される気泡を防ぐために、角度で下に設定する必要があります。 </li><li>スライドが配置されると、ミニバインダークリップと一緒に複雑なクランプ - 各側に1つを。 </li><li> 4℃をクリップコンプレックスを置き、CTTYEメディア/アガロースを設定することができます。これは通常、約5分かかります。 </li></ol>パート4：追跡アッセイの準備 - プレート錯体を設定 、コンポーネントを組み立てるスライドの複合体を準備し、栄養ディスクを置き、TPMメディア/アガロースを注ぎ、別と乾板の複合体、プレートの細胞を、そして追跡アッセイプレートの複合体を組み立てる。 プレート複雑なコンポーネントを組み立てる<ol><li>それぞれ複雑なため、炎がガラスの顕微鏡スライドを滅菌</li><li>スライドの上にオートクレーブガスケットを配置して（面を上にして滅菌）脇に置いておきます。これは、アッセイの底部を形成することになる。 </li><li>炎は、ガラスのカバースリップを滅菌し、第2のガラス顕微鏡スライドラベルテープ（またはパラフィルム）で包み、（側を上に滅菌）取っておくの上に置きます。これは、クラッキングからカバースリップを保つためにサポートのスライドとして使用されます。これは、アッセイの上部を形成することになる。 </li><li>炎はサードガラスの顕微鏡スライドを滅菌して（面を上にして滅菌）脇に置いておきます。これは、アガロースを平らにするために使用されます。 重要：ガスケットは、鉗子でそれを押すことで、ガラスとのシールを形成することを確認し、そうでなければメディア/アガロースが完全に乾くことがあります。 </li></ol> P<html>栄養ディスクをレース重要：手順5〜10は、一度に複雑な1枚のスライドに行う必要があります、それ以外のメディア/アガロースは悪いムービーの画質が得固化し始めることができます。 <ol start="5"><li>栄養ディスク複雑なフォームを削除4 ° C（パート3からステップ5）と、今固化CTTYE /アガロースを公開するスライドを離れてテコで。 </li><li>よく100μlのガラス使い捨てチップとマイクロサンプリングピペットを用いて、上記CTTYEメディア/アガロースから直径1mm&quot;栄養ディスク&#39;を削除してもカバースリップ（上記手順3）でガスケットによって作成されたに入れてください。 </li></ol>プレートに注ぎ 重要なステップ <ol start="7"><li>ピペットでよくカバースリップでガスケットによって作成され、栄養ディスクを含むに55℃TPMメディア/アガロースを300μl。 TPMメディア/アガロースは、マウンドアップすべき。 重要なステップ </li><li> TPMメディア/アガロースの上にないガスケット（ステップ3から）を持つ火炎滅菌スライドを置きます。 重要：このスライドは、形成される気泡を防ぐために、角度で下に設定する必要があります。 </li><li>スライドは、（ステップ5から）配置されると、ミニバインダークリップと一緒に複雑なクランプ - 各側に1つを。 </li><li> 4で切り取られた複雑なを置き° Cとメディア/アガロースを設定することができます。これは通常、約5分かかります。 </li></ol>独立したと乾板重要：乾燥からメディア/アガロースを防ぐために、〜20手順11は、一度に一つのスライドの複雑で実行する必要があります。 重要：最良の結果を得るには、11〜13を工程は4で実施されるべき℃の<ol start="11"><li>メディア/アガロース設定した後、バインダークリップを削除し、テープでラップされたスライドを緩めるために複雑なの終わりを絞る。 </li><li>テープラップされたスライドを削除し、後で使用できるようにベンチの上に置きます。 重要なステップ</li><li>ウェッジとして鉗子を使用して、サポートのスライド（なしガスケット付き）からカバースリップ/ガスケット/メディア/アガロース複合体を分離し、サポートのスライドを捨てる。 重要：カバースリップ/ガスケット複合体を分離するために詮索好きなモーションを使用しないでください。これにより、カバーガラスの破壊及び/またはメディア/アガロース支持のスライドに付着する可能性があります。 </li><li>テープによって包まれたスライドにカバースリップ/ガスケット/メディア/アガロース複合体（ガスケットのある面を上に）配置し、4から削除℃まで以上より1分 - すべて目に見える水分が新たに露出したメディア/アガロース表面から蒸発できるように、バーナーへのこの複雑な横に置きます。 重要：これはM.に影響を与える可能性があるとして長すぎるためにメディア/アガロース乾燥をさせてくださいザンザス群れ行動。 </li></ol>プレートの細胞重要なステップ<ol><li>一度、余分な水分は、離れて栄養ディスクからメディア/アガロース約1mm上に濃縮された細胞（パート1から手順8）のピペット0.5μlを蒸発している。 重要：細胞がまっすぐにまっすぐ下にしてからピペットを移動することによって堆積されていることを確認することが極めて重要です。これは群れが円形になることが保証されます。 重要：これは、メディア/アガロースにピペットの先端に触れないように非常に重要です。これは、表面にうつ病を行い、M.の動作を変更しますザンザス群れ。 ヒント：メディア/アガロースに近づいて前にピペットチップを押圧し。これは、セルのドロップがピペットの先端の下部に表示されるとそれが簡単に細胞を付着させるようにすることができます。 </li><li>一度細胞が堆積され、細胞のスポットを乾燥させるためにバーナーへの複雑な次を配置 - は20を超える秒。 </li></ol>アッセイを組み立てる<ol><li>セルのスポットが乾燥した後、カバースリップ/ガスケット/メディア/アガロース/細胞複合体（ステップ13から）上のガスケットとスライド/ガスケットの複合体を（ステップ1から）に合わせ、ゆっくりと軸シールを形成するために一緒に押します。 重要なステップ</li><li>スライドの表面を清掃し、パラフィルムで残留物を除去するためにキムワイプでスリップをカバー。完成したアッセイは、図1のようになります。 </li><li>すぐに結露のフォームを防止するために（ステップ15）ワイプの後に32 ° C（スライドダウン、アップスリップカバー）に維持加熱ステージ上で複雑な完成したスライドを置きます。結露が形成されている場合は、複雑なスライドが画像集録ソフトウェアを起動する前に数秒間加熱ステージの上に座ってみましょう。 </li><li>適切な目標を（、2X 4X、または10倍）を選択します。 </li></ol>パート5：ムービーの準備T&quot;&gt;重要なステップ<ol><li>カメラと顕微鏡の電源をオンにして、（光が強すぎるではないことを確認してください）​​光のレベルを確認してください。コンピュータを起動し、画像取得プログラムを開きます。 </li><li>ライブ画像のウィンドウをクリックして、顕微鏡の焦点を合わせる。画像は、図3に見られるもののように表示されるはずです。均一な寒天の表面に注目してください。 </li><li>画像を取得開始します。 重要なステップ</li><li>メディア/寒天がドリフトにフォーカスを引き起こして解決する傾向があるので、1時間の間、定期的にフォーカスを確認してください。 </li><li>作業領域をきれいに。 </li><li>画像の取り込みが完了すると、転送はストレージ用の画像を取得し、一晩90％エタノールに浸漬することによってスライド複合体を分解する。 </li><li>再利用のためにオートクレーブガスケット。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。TMプレートの複雑なの漫画イラスト。 （A）分解図と​​断面図の基本的なTMのプレートコンプレックスを示しています。 （B）より大きいガスケットの使用方法を示します。 <img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig2.jpg" alt="図2" /> 図2顕微鏡のクラスタ。各顕微鏡のノードは、（挿入図）ニコンE400顕微鏡、目標、加熱ステージ、インサイトのカメラ、およびノー​​トブックコンピュータで構成されています。各ノードが相互にネットワーク接続し、マスタコントローラのコンピュータにリンクされています。ノードの二つは、EXFO光源二Uniblitzのシャッターで構成される蛍光の機能を使用して設定されます。 <img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。追跡アッセイ装置の20倍の画像を一度に= 0。スケールバーは1mm。 <img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig4.jpg" alt="図4" /> 図4。TMプレートの複合体の適応性。 M.の（A）100Xの画像1.0％寒天でCTTYE上ザンザス滑走運動。 Pの（B）20Xの画像緑膿菌は運動性をけいれん。 （C）20X画像S.マルセッセンスでは、運動性を分封。両方（B）と（C）は1.0％の寒天のLBで検定した。 M.の（D）40 ×画像スメグマチスは、0.5％寒天のLBで運動をスライディング。この画像は、図1Bに見られる別のアッセイの設定を使用して捕獲した。 ビデオ1。追跡アッセイに供群れのタイムラプスビデオ。 M.のビデオ2。タイムラプスビデオ細胞の1％が蛍光標識されているザンザス群れ。交互位相コントラストおよび蛍光画像がキャプチャされ、群れの中で蛍光細胞の位置を明らかにするために重ねていた。このビデオは、1.0％寒天でCTTYEでキャプチャされました。 M.のビデオ3。タイムラプスビデオザンザス滑走運動。このビデオは、1.0％寒天でCTTYEでキャプチャされました。 P.のビデオは、4。タイムラプスビデオ緑膿菌は運動性をけいれん。このビデオは、1.0％寒天のLBでキャプチャされました。 ビデオ5。S.のタイムラプスビデオマルセッセンスでは、運動性を分封。このビデオは、1.0％寒天のLBでキャプチャされました。 ビデオ6。M.のタイムラプスビデオチスは運動性をスライディング。このビデオは、図1Bに見られる別のアッセイの設定を使用して、0.5％寒天のLBでキャプチャされました。

<ol>
	<li>Taylor, R. G., Welch, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+as+an+emergent+property+of+a+swarm.">Chemotaxis as an emergent property of a swarm.</a> J Bacteriol. 190, 6811-6816 (2008).</li><li>Curtis, P. D., Taylor, R. G., Welch, R. D., Shimkets, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+Organization+of+Myxococcus+xanthus+During+Fruiting+Body+Formation.">Spatial Organization of Myxococcus xanthus During Fruiting Body Formation.</a> J Bacteriol. 189, 9126-9130 (2007).</li><li>Mignot, T., Merlie, J. P., Zusman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+pole-to-pole+oscillations+of+a+bacterial+gliding+motility+protein.">Regulated pole-to-pole oscillations of a bacterial gliding motility protein.</a> Science. 310, 855-857 (2005).</li><li>Stoodley, P., Hall-Stoodley, L., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detachment+surface+migration,+and+other+dynamic+behavior+in+bacterial+biofilms+revealed+by+digital+time-lapse+imaging.">Detachment surface migration, and other dynamic behavior in bacterial biofilms revealed by digital time-lapse imaging.</a> Methods Enzymol. 337, 306-319 (2001).</li><li>O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation+as+microbial+development.">Biofilm formation as microbial development.</a> Annu Rev Microbiol. 54, 49-79 (2000).</li><li>O'Toole, G. A., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flagellar+and+twitching+motility+are+necessary+for+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+development.">Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development.</a> Mol Microbiol. 30, 295-304 (1998).</li><li>Dalton, H. M., Poulsen, L. K., Halasz, P., Angles, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substratum-induced+morphological+changes+in+a+marine+bacterium+and+their+relevance+to+biofilm+structure.">Substratum-induced morphological changes in a marine bacterium and their relevance to biofilm structure.</a> J Bacteriol. 176, 6900-6906 (1994).</li><li>Dworkin, M., Eide, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myxococcus+xanthus+does+not+respond+chemotactically+to+moderate+concentration+gradients.">Myxococcus xanthus does not respond chemotactically to moderate concentration gradients.</a> J Bacteriol. 154, 437-442 (1983).</li><li>Dworkin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tactic+behavior+of+Myxococcus+xanthus.">Tactic behavior of Myxococcus xanthus.</a> J Bacteriol. 154, 452-459 (1983).</li><li>Wu, S. S., Kaiser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+expression+of+the+pilA+gene+in+Myxococcus+xanthus.">Regulation of expression of the pilA gene in Myxococcus xanthus.</a> J Bacteriol. 179, 7748-7758 (1997).</li><li>Bustamante, V. H., Mart&#237;nez-Flores, I., Vlamakis, H. C., Zusman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+Frz+signal+transduction+system+of+Myxococcus+xanthus+shows+the+importance+of+the+conserved+C-terminal+region+of+the+cytoplasmic+chemoreceptor+FrzCD+in+sensing+signals.">Analysis of the Frz signal transduction system of Myxococcus xanthus shows the importance of the conserved C-terminal region of the cytoplasmic chemoreceptor FrzCD in sensing signals.</a> Mol Microbiol. 53, 1501-1513 (2004).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

タイムラプスmicrocinematography（TM）は、原核生物の運動性2-7を研究するための一般的な手法となっています。伝統的に、TMは、基板8から11のようにろ紙の芯、薄い寒天パッド、または寒天のスラブを使用して実行されます。細菌の運動の一般的なイラストのためのイメージシーケンスを生成するために使用するときにこれらのメソッドは効果が十分とコストです。しかし、イメ?...

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>1.0% Casitone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco Laboratories</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.5% yeast extract</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco Laboratories</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micro-sampling pipette</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100 &mu;l glass disposable tip</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2 x 2 cm, 0.5-mm-thick silicone rubber gasket</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Grace Bio-Lab Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

recording multicellular behavior in myxococcus xanthus biofilms using time-lapse microcinematography

δ-プロテオバクテリアMyxococcusザンザスの群れは、環境の手がかりへの応答として、複雑な、動的なパターンを作成するために一連の信号を通じて、集団的、協調運動として作用する細胞の数百万が含まれています。これらのパターンは、自己組織化と創発であり、それらは個々の細胞の挙動を観察することによって予測することはできません。タイムラプスmicrocinematography追跡アッセイを用いて、我々は、M.の明確な緊急のパターンを同定したザンザスは、そのソース1に向けて栄養勾配まで群れの指示運動として定義されて、走化性と呼ばれる。 効率的にタイムラプスmicrocinematographyを経由して走化性を特徴付けるために、我々は高度に変更可能なプレート複合体を開発した（図1）と8顕微鏡（図2）、キャプチャタイムラプスビデオの各能力のクラスタを構築した。アッセイは、定量データの一貫性のある複製を可能にするのに十分厳格であり、結果のビデオは、私たちは群れの行動の微妙な変化を観察し、追跡することができます。一度キャプチャ、ビデオはビデオの何千もの処理および格納するのに十分なメモリと分析/ストレージコンピュータに転送されます。このセットアップの柔軟性は、M.のいくつかのメンバーに役立っていますザンザスコミュニティ。

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Recording Multicellular Behavior in Myxococcus xanthus Biofilms using Time-lapse Microcinematography

勉強する<em&gt; Myxococcusザンザス</em&gt;群れ行動、我々は、異なるアッセイ用に変更することができるタイムラプスmicrocinematographyプロトコルを設計した。それは、顕微鏡に適合した標準的な成長条件を採用し、安価な、再利用可能なシリコンガスケットを使用して再現性のある結果が得られます。我々は、多細胞走化性を定量化するためにこのメソッドを使用している。

で多細胞の動作を記録する Myxococcusザンザス</emタイムラプスMicrocinematographyを使用して>バイオフィルム

A swarm of the &delta;-proteobacterium Myxococcus xanthus contains millions of cells that act as a collective, coordinating movement through a series of ...

recording-multicellular-behavior-myxococcus-xanthus-biofilms-using

Research

JoVE Journal

Biology

Recording Multicellular Behavior in Myxococcus xanthus Biofilms using Time-lapse Microcinematography

12.2K ビュー.  University of South Carolina (USC). 勉強する Myxococcusザンザス群れ行動、我々は、異なるアッセイ用に変更することができるタイムラプスmicrocinematographyプロトコルを設計した。それは、顕微鏡に適合した標準的な成長条件を採用し、安価な、再利用可能なシリコンガスケットを使用して再現性のある結果が得られます。我々は、多細胞走化性を定量化するためにこのメソッドを?...

ビデオ: Recording Multicellular Behavior in Myxococcus xanthus Biofilms using Time-lapse Microcinematography

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

タイムラプス顕微鏡で分解アクチンの監視

生物学

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

ライブゼブラフィッシュの胚における二光子軸索切断とタイムラプス共焦点イメージング

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

siRNAトランスフェクション後の有糸分裂のタイムラプスイメージング

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

の初期発生のタイムラプス顕微鏡線虫（Caenorhabditis elegans）

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During directional migration, cells move rapidly in response to an extracellular chemotactic signal, or in response to intrinsic cues 3 provided by the basic motility machinery. Random migration occurs when a cell possesses low intrinsic directionality, allowing the cells to explore their local environment.
Cell migration is a complex process, in the initial response cell undergoes polarization and extends protrusions in the direction of migration 2. Traditional methods to measure migration such as the Boyden chamber migration assay is an easy method to measure chemotaxis in vitro, which allows measuring migration as an end point result. However, this approach neither allows measurement of individual migration parameters, nor does it allow to visualization of morphological changes that cell undergoes during migration.
Here, we present a method that allows us to monitor migrating cells in real time using video - time lapse microscopy. Since cell migration and invasion are hallmarks of cancer, this method will be applicable in studying cancer cell migration and invasion in vitro. Random migration of platelets has been considered as one of the parameters of platelet function 4, hence this method could also be helpful in studying platelet functions. This assay has the advantage of being rapid, reliable, reproducible, and does not require optimization of cell numbers. In order to maintain physiologically suitable conditions for cells, the microscope is equipped with CO2 supply and temperature thermostat. Cell movement is monitored by taking pictures using a camera fitted to the microscope at regular intervals. Cell migration can be calculated by measuring average speed and average displacement, which is calculated by Slidebook software.

This method allows monitoring of cells in real time and quantitative measurements of different cell migration parameters such as speed, displacement, and velocity. Unlike the traditional methods, this real time approach is not based on endpoint quantitative migration measurements; instead it allows monitoring and calculating different parameters continuously.

タイムラプスビデオ顕微鏡を用いた細胞のランダムな移行の定量分析

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

シングルおよび多細胞コンテキストでInvadopodia媒介細胞外マトリックスタンパク分解の定量測定

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages as well as by the availability of genetic mutants and transgenic strains expressing a myriad of fusion proteins1-4. In addition, dynamic processes such as cell division can be viewed using fluorescently labeled reporter proteins. The study of mitosis can be facilitated through the use of time-lapse experiments in various systems including intact organisms; thus the early C. elegans embryo is well suited for this study. Presented here is a technique by which in vivo imaging of sub-cellular structures in response to anoxic (99.999% N2; &lt;2 ppm O2) stress is possible using a simple gas flow through setup on a high-powered microscope. A microincubation chamber is used in conjunction with nitrogen gas flow through and a spinning disc confocal microscope to create a controlled environment in which animals can be imaged in vivo. Using GFP-tagged gamma tubulin and histone, the dynamics and arrest of cell division can be monitored before, during and after exposure to an oxygen-deprived environment. The results of this technique are high resolution, detailed videos and images of cellular structures within blastomeres of embryos exposed to oxygen deprivation.

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Described here is an in vivo technique to image sub-cellular structures in animals exposed to anoxia using a gas flow through microincubation chamber in conjunction with a spinning disc confocal microscope. This method is straightforward and flexible enough to suit a variety of experimental parameters and model systems.

における酸素欠乏によって誘導された仮死状態を可視化するために時間の経過顕微​​鏡の使用<em&gt; Cエレガンス</em&gt;胚

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies depicting the temporal dependence of gene expression provide insight into the dynamics of its regulation; however, there are many technical challenges to obtaining and analyzing fluorescence movies of single cells. We describe here a simple protocol using a commercially available microfluidic culture device to generate such data, and a MATLAB-based, graphical user interface (GUI) -based software package to quantify the fluorescence images. The software segments and tracks cells, enables the user to visually curate errors in the data, and automatically assigns lineage and division times. The GUI further analyzes the time series to produce whole cell traces as well as their first and second time derivatives. While the software was designed for S. cerevisiae, its modularity and versatility should allow it to serve as a platform for studying other cell types with few modifications.

We present a simple protocol to obtain fluorescence microscopy movies of growing yeast cells, and a GUI-based software package to extract single-cell time series data. The analysis includes automated lineage and division time assignment integrated with visual inspection and manual curation of tracked data.

出芽酵母の蛍光タイムラプス作品を取得し、移植片を使用したシングルセルダイナミクスの解析

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, convergence and extension of facial prominences, and maturation of the craniofacial skeleton. To study the contribution of the cranial neural crest to specific regions of the zebrafish palate a sox10: kaede transgenic zebrafish line was generated. Sox10 provides lineage restriction of the kaede reporter protein to the neural crest, thereby making the cell labeling a more precise process than traditional dye or reporter mRNA injection. Kaede is a photo-convertible protein that turns from green to red after photo activation and makes it possible to follow cells precisely. The sox10: kaede transgenic line was used to perform lineage analysis to delineate CNC cell populations that give rise to maxillary versus mandibular elements and illustrate homology of facial prominences to amniotes. This protocol describes the steps to generate a live time-lapse video of a sox10: kaede zebrafish embryo. Development of the ethmoid plate will serve as a practical example. This protocol can be applied to making a time-lapse confocal recording of any kaede or similar photoconvertible reporter protein in transgenic zebrafish. Furthermore, it can be used to capture not only normal, but also abnormal development of craniofacial structures in the zebrafish mutants.

Visualization of experimental data has become a key element in presenting results to the scientific community. Generation of live time-lapse recording of growing embryos contributes to better presentation and understanding of complex developmental processes. This protocol is a step-by-step guide to cell labeling via photoconversion of kaede protein in zebrafish.

SOX10中の顔面の開発の可視化：楓トランスジェニックゼブラフィッシュラインタイムラプス共焦点顕微鏡を用いて

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

で多細胞の動作を記録する Myxococcusザンザスバイオフィルム