この研究は優秀プログラムのその研究センターの下で教育シンガポール国立研究財団と省によってサポートされ、スタートアップ助成ナンヤン工科大学から（M4330002.C70）、およびACRFティア2（MOE2014-T2-2-172）教育省、シンガポールから。著者は、このプロトコルのデモに参加するためジョーイヤムクオックHoongに感謝します。

1.バイオフィルム栽培<ol><li>細菌株の作製<ol><li> 1日前にバイオフィルムの栽培に、凍結した細菌培養物からの適切な成長培地2mlを接種することにより、浮遊性細菌培養液を準備します。ムコイドPのルリア-ブロス培地（10gのL -1のNaCl、10グラムL -1の酵母抽出物、および10gのL -1トリプトン）を使用します緑膿菌とそのΔ ペルとΔPSL欠損変異株。 37℃、200 rpmで振とうした条件で一晩インキュベートします。分光光度計を用いて0.40のOD 600に一晩培養を希釈します。 </li><li>好ましくは、分解することなく、フローセルを撮像する顕微鏡部屋にすることができる移動局またはトロリーに、以前に記載14されたフローセルのセットアップを組み立てます。 </li><li> 2 Lまたは各フローセル5 Lボトルに無菌成長培地を準備します。最少培地M9（48ミリモルの Na 2 HPO 4、22 mMのを使用してくださいKH 2 PO 4、19 mMのNH 4 Clで、9のNaCl、2mMのMgSO 4を、および0.1mMのCaCl 2）Pの 0.04％グルコース（重量/容量）および0.2％（重量/容量）カザミノ酸）を補充し緑膿菌は、セルバイオフィルムを流します。 </li><li>マイクロ遠心チューブに小分け蛍光マイクロスフェアおよび9,391.2 gで遠心分離器で5分間滅菌H 2 Oにスピンダウン。前2 Lまたは5 L培地ボトルに増殖培地に添加するアジ化ナトリウム（消毒剤）を除去するために1ミリリットルの増殖培地中で上清と再懸濁を削除します。 注：マイクロスフェアの異なるサイズが異なる濃度で来て、指示に応じて希釈してください。例えば、2.18×10 6マイクロml -1の各粒子サイズのを与えるために直径1.0μmのマイクロスフェアの120μlを、0.5μmの直径のミクロスフェアと成長培地の2リットルに0.2μmの直径のミクロスフェアの0.96μlの15μlのを分散させます。 </li><li> upstを培地ボトルを取り付けフローセルの連増殖培地全体設定を通って流れることを可能にします。流れを停止し、フローセルチャンバーに希釈した一晩培養を注入。細菌が約5.5×10 -3 Mの秒 -1、または蠕動ポンプで8回転数の流量で成長培地の流れを継続する前に1時間カバーガラスの基層にアタッチすることを許可します。 注：バイオフィルムは、通常3-7日、室温（25℃）で栽培されています。 </li><li>また、静的な文化のセットアップのために、粒子と1ミリリットルの成長培地に一晩培養物10μlを加えることによって、微量遠心管中で一晩培養を100倍に希釈します。フローバイオフィルムに使用されるものに比べて約500倍の静的培養のための増殖培地中の粒子濃度を増やしフローセルバイオフィルムを常に補充される（例えば、増殖培地10mlに1.0μmの直径の球の600μLを洗浄し、再懸濁）粒子が、静置培養ではありません。 <ol><li> 200を追加します。1; 8ウェルスライドチャンバーに粒子と希釈し一晩培養物のリットル。静的な条件の下で、37℃でインキュベートします。バイオフィルムは、通常、1日に栽培されています。バイオフィルムは、1日以上成長させると粒子と新鮮な増殖培地で毎日過ごした成長培地を交換してください。 </li></ol></li></ol></li></ol> 2.顕微鏡<ol><li> 3日目と5日、蠕動ポンプからの流れを切り、顕微鏡室にフローセルのセットアップを持って来ます。フローからドリフト（環境の変化によって、系統誤差の原因）を防止するために、フローセルチャンバーの入口と出口の近くにチューブを固定します。正立顕微鏡の顕微鏡ステージ上にフローセルを置きます。 注：マイクロウェルのイメージングのために倒立顕微鏡を使用してください。 </li><li>以下のために（3日目および5）さまざまな場所（微小コロニーとフラット未分化層）で、別の日に、バイオフィルムに埋め込まれたマイクロスフェアの動きのビデオを取るために40倍油浸対物レンズで蛍光顕微鏡を使用してください時間的・空間的な調査。長い時間をかけてイベントを調査するために、短い時間スケール（高速ダイナミクス毎秒25〜50フレームのフレームレートで例えば 1.5〜3分ビデオ）内で発生するイベント、低いフレームレートで長い動画を調査するために、高いフレームレートで短いビデオを撮影スケール（2.5〜5フレーム/遅いダイナミクスのための秒のフレームレートで例えば 15〜30分間のビデオ）。 注：ビデオは、典型的には5~10の粒子を含み、ファイルサイズ、典型的に1.0から2.5 GBのです。大きい微小コロニーは、より多くの粒子を保持することができます。各カテゴリの5-10動画（異なる微小コロニーのとフラット未分化層内の異なる場所の例 5-10ビデオ）を取ります。バイオフィルムマイクロコロニー、チャネル、ボイドやフラット未分化の層から成ってもよい異種のアーキテクチャを有しています。 </li><li>フィジー/ ImageJの（例えばCZI、TIF）で読み取ることができる適切な形式で動画を保存します。 </li><li>完成したVIDをスクロールしてドリフトのためのビデオをチェックEO粒子が同時に同じ方向に移動しないことを観察します。ドリフトは、Zステージの動き、フローセル内の電流、除振台、空気圧や温度変化の不均衡によって引き起こされ得ます。正しいマイナー通常顕微鏡ソフトウェアを備えた後処理技術を使用して漂流。ドリフトを補正することはできませんここで任意のビデオを破棄します。解像度（ピクセル/ UM）、フレーム、時間数：粒子追跡解析時に必要とされている以下のパラメータを、記録しておきます。 </li><li>顕微鏡ステージからフローセルを取り外し、バイオフィルムを栽培継続する蠕動ポンプを再起動します。 </li></ol> 3.粒子追跡解析<ol><li>オープンソースソフトウェア（ImageJの）にプラグインTrackMateを使用することにより、粒子の軌跡を取得します。フィジーでダウンロード<a href="http://fiji.sc/Fiji">http://fiji.sc/Fiji。</a>フィジーでビデオを開き、プラグインメニューの下、トラッキングとTrackMateを選択します。 </li><li>目の設定を確認するか、調整Eウィンドウステップ2.4​​に記録されたビデオのパラメータを一致させるために、初期キャリブレーション設定を示唆しています。 </li><li> ImageJのを使用してTrackMate中の粒子を検出します。 <ol><li> （例えば1000）のログ検出器」、入力された粒子径およびしきい値を選択します。紫色の円は、ビデオ全体の粒子に従うことを確認するには、「プレビュー」ボタンをクリックしながら、映像をスクロールします。必要に応じて直径値としきい値を調整します。紫色の円は空のスペースに表示された場合のしきい値を大きくします。十分ではない粒子が検出された場合のしきい値を減らします。検出に粒子を完了するために、次のボタンをクリックします。 </li><li> 「初期しきい値」で検出された粒子を追加または削除するオプションが提示された場合、次のボタンをクリックし、[ビューを選択 &#39;と初期粒子検出が良好であった場合は調整せずに続行するには、Windows「フィルタを選択」を。 </li><li> OPTIの「簡易LAPトラッカー」を選択します「トラッカー方法を選択]ウィンドウのバーに粒子はほとんどバイオフィルムに焦点の外に移動しないと簡単に追跡されます。提案し、低リンクとギャップ閉鎖最大距離値を使用して、次へをクリックします。 </li><li>その粒子追跡は、粒子がTrackMateによって描かれたトラックに従うこと、および不要なまたは不足しているトラックがないことを確認するためにビデオをスクロールすることにより、良好であることを確認してください。さまざまなフィルタリングステップをスキップします。 「アクションを選択」最後のウィンドウに移動します。ドロップダウンメニューから「xmlファイルにエクスポートトラック」を選択し、「実行」をクリックします。トラックを保存するフォルダを選択してください。 注：粒子軌跡とマイクロレオロジーの使用を分析するためのパブリックドメインで利用できる様々なプログラムがあります。 msdanalyzerとTrackArtは、MATLAB環境で実行粒子トラッキング解析プログラムの一例です。 </li></ol></li><li>のメニューで選択することで、xmlファイル内の粒子軌跡をインポートするためにMATLABを準備MATLABファイル&gt; ...パスを設定し、フィジーのパッケージに使用可能なスクリプトフォルダを追加します。 </li><li> msdanalyzerと粒子軌跡を分析するために、zipファイルまたはtar.gzファイルへのリンクをダウンロードat <a href="http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/40692-mean-square-displacement-analysis-of-particles-trajectories">http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/40692-mean-square-displacement-analysis-of-particles-trajectories</a> . <ol><li> @msdanalyzerフォルダ15を抽出し、MATLABパスに属するフォルダにドロップします（ 例：C： Documents and Settings &lt;ユーザー名&gt; マイドキュメントは、MATLABを）。 MATLABを起動し、入力してアナライザを開始： MA = msdanalyzer（2、「ええと &#39;、&#39;秒 &#39;） UMと秒は、ビデオ内の物理的な空間と時間の単位である場合。 <ol><li>次のように入力して、粒子の軌道をインポートします。 [トラック、MD] = importTrackMateTracks（ &#39;ファイル名.xml&#39;、 &#39;C​​LIPZ」; &#39;scaleT&#39;） MA = ma.addAll（トラック）; ここで「CLIPZ」は、2D映像のためのZディメンションを削除し、「scaleT」。 </li><li>使用してグラフ上に軌跡をプロットします。 ma.plotTracks; ma.labelPlotTracks; </li><li>使用して粒子のMSDのを計算します。 MA = ma.computeMSD。 ma.msd </li><li>各粒子のMSDのをプロットします。 図 ma.plotMSD </li><li> ）3.5.1.4に3.5.1.1を繰り返して、同一categery（3日目に野生型微小コロニーに埋め込 ​​ま例えば粒子）の他のビデオから粒子軌跡を組み合わせます。 </li><li>アンサンブル平均または全ての曲線の平均値をプロットします。 ma.plotMeanMSD リニアから対数スケールにy軸とx軸を変更します。長いラグタイムで、MSD曲線はより長い時間スケールでの不十分な統計にノイジーになります。 MSD曲線はまた、動的エラーに急激に上昇することがあります。曲線のこれらの領域は、ブラシツールを使用して除去することができ&gt;曲線の終点を選択し、選択 &#39;ブラッシング」するツールメニューの「ブラシのかけていないと削除」。 </li></ol></li><li>でEzyfitをダウンロード<a href="http://www.fast.u-psud.fr/ezyfit/">http://www.fast.u-psud.fr/ezyfit/</a>とMATLABパスに属するフォルダにEzyfitを追加する（ 例：C： Documents and Settings &lt;ユーザー名&gt; マイドキュメントは、MATLABを）。インストールefmenu MATLABワークスペースを入力してEzyfitメニューをインストールします。 FigureウィンドウにEzyfitメニューを使ってMATLABを再起動します。 Ezyfitメニュー」が表示フィット&#39;&gt;&#39;パワー&#39;&gt;&#39; * X ^ n &#39;の中で選択することで、べき乗則にMSDカーブフィットは、nは、推定拡散指数 αでした。 注：msdanalyzerは、MSDカーブのフィッティングのためのMatlabの曲線フィッティングツールボックスが必要です。 Ezyfitはカーブフィッティングを行うことができ、代替とフリーソフトウェアです。 </li><li>他の場所や時間に新しい粒子のMSDを計算するためのクリア現在の粒子軌跡とのMSD： 明確な</LI&gt; <li>媒体中の粒子の様々な平均MSD曲線（コントロール）を算出した後、および微小コロニーと様々な株の未分化領域、比較のために1つのグラフにカーブをコピーして貼り付けます。試料の剛性と低いMSD値で増加を架橋。フラット曲線は低いαを持っており、サンプルが高いαで急勾配の曲線よりも弾力性があります。 </li><li>カーブを選択し、そのような中央値と範囲として、データ統計を見て、「ツール」を参照してください。ビーズのMSDは、ビーズが関係に応じて埋め込 ​​まれた材料のJ（t）はクリープコンプライアンスに比例し、 <img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/53093/53093eq1.jpg" /> ここで、J =クリープコンプライアンス、D =粒子径、k個のB =ボルツマン定数、T =温度と t =時間。 </li></ol></li></ol>

<ol>
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PAO1 and Desulfovibrio sp. 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The authors have nothing to disclose.

マイクロレオロジーは、微生物バイオフィルムなどの異種システム、で地元のレオロジー測定のための便利なツールです。これは、複数の時点にわたって同じ生物学的サンプル中のレオロジーの変化のリアルタイム監視を可能にする、非破壊的技術です。このプロトコルでは、粒子追跡マイクロレオロジーは、それらが弾力性とバイオフィルムマトリックスの効果的な架橋をどのように影響?...

ほとんどの細菌細胞は、両方のプランクトン（自由生活）と成長1の表面に付着した（固着）モードを採用することができます。成長の表面接続モードでは、細菌細胞が分泌し、バイオフィルムを形成するために、細胞外高分子物質（EPS）を大量に身を包みます。 EPSは、主にタンパク質、エキソポリサッカライド、外DNAで構成され、バイオフィルム形成2に不可欠です。これは、細菌が空間的に区別するために使用することが可能な物理的な足場として機能し、有害な環境条件と宿主応答から細菌を保護します。 EPSのさまざまなコンポーネントは、バイオフィルム形成3で異なる役割を持っており、EPSの成分の発現の変化は劇的にバイオフィルム構造体4 を改造することができます。 EPS成分も分子5のシグナルとして機能することができ、最近の研究では、それらの移動およびバイオフィルム差分を案内するために微生物細胞と相互作用する特定のEPSのコンポーネントを示していますerentiation 6-8。 EPSの研究は大きく、EPS 9,10の特定のコンポーネントで欠損変異によって生成したバイオフィルムの形態学的な分析に基づいて進んでいます。また、EPSは通常、マクロスケール（バルク特性評価）11で特徴づけられます。形態学的には、しかし、定量的なディテールやバルク特性評価を欠いて、平均値を返し、バイオフィルムの異質内に存在する詳細を失うことができます分析します。マイクロスケールでのEPSのメカニック特性のリアルタイム特性評価に進行する増加傾向が存在することになります。このプロトコルは、粒子追跡マイクロレオロジーは、 緑膿菌バイオフィルム4の粘弾性および有効な架橋のマトリックス成 ​​分ペルとPSLエキソポリサッカライドの時空間的効果を決定することができる方法を示しています。 パッシブマイクロレオロジーは、簡単かつ安価であるRH日付12,13の材料の空間microrheologicalサンプリングの最高のスループットを提供eology方法。受動的なマイクロレオロジーでは、プローブ球体は、サンプル中に配置され、熱エネルギー（k BはT）によって駆動されるそれらのブラウン運動は、ビデオ顕微鏡が続きます。いくつかの粒子が同時に追跡することができ、粒子の時間依存座標は、従来のランダムウォークに従ってください。したがって、平均して、粒子は、同じ位置にとどまります。しかし、粒子の変位の標準偏差または平均二乗変位（MSD）は、ゼロではありません。粘性流体が流れているので、時間が進むにつれて、粘性流体中の粒子のMSDは、直線的に増加します。これとは対照的に、粘弾性又は弾性物質で見られる高分子架橋は、彼らが流れに抵抗するのに役立ち、かつ粒子がMSD曲線（ 図1A）でプラトーにつながる、その変位の限らになります。この観察は、関係を次のMSDαt <sαは、物質の弾性と粘性の寄与の割合を関連している拡散指数であるα、&gt;アップ。 MSDはまた、恒久的に上に変形する材料の傾向である、クリープコンプライアンスを計算するために使用することができる粘性流体にα= 1、粘弾性物質で0 &lt;α&lt;1、及び弾性物質でα= 0で移動する粒子について時間とは、どのように簡単に材料のスプレッドを推定します。 粒子の大きさ、密度、および表面化学はmicrorheological実験の正確な適用に重要である（この場合、バイオフィルムマトリックスのポリマーは、 図1Bを参照）について検討システムに関して選択されます。まず、粒子は、粒子自体よりもはるかに小さい構造を持つ物質のレオロジーを測定します。物質の構造は、粒子、額面の動きと同様の規模のものである場合ticleは、個々の構造の形状や向きによって乱されます。しかし、粒子の周囲の構造が非常に小さい場合、この効果は小さく、粒子（ 図1B）に均質な環境を提示し、平均化。第二に、粒子の密度は、媒体（1.05グラムml -1の水性媒体のための）沈降を回避し、慣性力が無視できるようにしていることのようになります。ポリスチレンラテックス粒子のほとんどは、上記の基準を満たしています。運動は、物質の構造と熱エネルギーとの衝突によって駆動される、ランダムであれば、粒子のMSDのレオロジー解釈にのみ有効ですとして理想的には、粒子がバイオフィルムマトリックスのポリマーと相互作用しません。これは、プローブ粒子は、プレバイオフィルムの成長表面に結合するか、バウンスする傾向があるかどうかをチェックすることによって観察することができます。しかし、バイオフィルムへの魅力の欠如にもかかわらず、粒子がマトリックスに組み込むことができる必要があります。また、バイオフィルムの物理化学的不均一性は、異なる粒子は、バイオフィルムの異なる領域におけるプローブとして、より適している可能性があります。したがって、異なるサイズおよび表面化学の粒子は、バイオフィルムに適用されるべきです。 このように、粒子のMSDは、異なる成分がレオロジーに寄与し、バイオフィルムの拡散方法に関する有用な情報を提供することができます。さらに、異なるプローブの使用は1つがバイオフィルムの空間の物理化学的不均一性に関する情報を導出することができます。この方法は、バイオフィルムの機械的特性に影響抗菌治療を試験するために使用される、またはバイオフィルムの機械的特性は、別の種の導入によって変更されたかを調査するために、混合種バイオフィルムに適用することができます。粒子のMSDはまた、バイオフィルムの分散を特徴付けるために有用であり得ます。このような研究は、潜在的にAバイオフィルムの治療を改善する、バイオフィルムの我々の理解に役立つであろうND便利な活動のためのバイオフィルムのエンジニアリング。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fluorspheres</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F-8821</td>
			<td>1.0 um red fluorescent (580/605) microspheres with carboxylate modification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio Imager M1</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Epifluorescent Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Digital Drive 07523-80</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-07523-80</td>
			<td>Peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cell Chambers</td>
			<td colspan="3">Technical University of Denmark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bubble Trap</td>
			<td colspan="3">Technical University of Denmark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Tubing</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td>3 mm outer diameter, 1 mm inner diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear polypropylene plastic connectors&#160;</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>06365-83</td>
			<td>1/16 in. (1.588 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binder Clips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To clamp tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td colspan="2">Thermo Scientific&#8482; Nunc&#8482;</td>
			<td>50 x 24 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 3 mL</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G Needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2L Storage/Media Bottles</td>
			<td>VWR&#174;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trolley</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To hold biofilm setup</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ mapping of the mechanical properties of biofilms by particle-tracking microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

ボイド（バイオフィルム上記培地）、平野（細胞の未分化フラット層）と微小コロニーを（ 図2A内のラベルを参照してください）含まバイオフィルム、の異なる領域におけるバイオフィルムの局所的な粘弾性特性を調べました。日3〜5の成熟の間のバイオフィルムの粘弾性特性の経時変化も測定しました。空隙中の粒子のMSDは、純粋な媒体中での粒子のMSDに制御匹敵として使用し...

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In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

粒子追跡マイクロレオロジーによりバイオフィルムの機械的特性のその場でのマッピング

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

9.6K ビュー.  Nanyang Technological University. Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

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Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not have been accomplished by other approaches1. With the use of the calcium- and voltage-sensitive dyes, optical mapping allows measurement of transmembrane action potentials and calcium transients with high spatial resolution without the physical contact with the tissue. This makes measurements of the cardiac electrical activity possible under many conditions where the use of electrodes is inconvenient or impossible1. For example, optical recordings provide accurate morphological changes of membrane potential during and immediately after stimulation and defibrillation, while conventional electrode techniques suffer from stimulus-induced artifacts during and after stimuli due to electrode polarization1. 
The Langendorff-perfused rabbit heart is one of the most studied models of human heart physiology and pathophysiology. Many types of arrhythmias observed clinically could be recapitulated in the rabbit heart model. It was shown that wave patterns in the rabbit heart during ventricular arrhythmias, determined by effective size of the heart and the wavelength of reentry, are very similar to that in the human heart2. It was also shown that critical aspects of excitation-contraction (EC) coupling in rabbit myocardium, such as the relative contribution of sarcoplasmic reticulum (SR), is very similar to human EC coupling3. Here we present the basic procedures of optical mapping experiments in Langendorff-perfused rabbit hearts, including the Langendorff perfusion system setup, the optical mapping systems setup, the isolation and cannulation of the heart, perfusion and dye-staining of the heart, excitation-contraction uncoupling, and collection of optical signals. These methods could be also applied to the heart from species other than rabbit with adjustments to flow rates, optics, solutions, etc.
Two optical mapping systems are described. The panoramic mapping system is used to map the entire epicardium of the rabbit heart4-7. This system provides a global view of the evolution of reentrant circuits during arrhythmogenesis and defibrillation, and has been used to study the mechanisms of arrhythmias and antiarrhythmia therapy8,9. The dual mapping system is used to map the action potential (AP) and calcium transient (CaT) simultaneously from the same field of view10-13. This approach has enhanced our understanding of the important role of calcium in the electrical alternans and the induction of arrhythmia14-16.

This article describes the basic procedures for conducting optical mapping experiments in the Langendorff-perfused rabbit heart using the panoramic imaging system, and the dual (voltage and calcium) imaging modality.

ランゲンドルフ灌流ウサギの心臓のMultiparametric光学マッピング

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

生物工学

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

マウスの心臓の活動電位およびカルシウムトランジェントの光学的マッピング

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

原子間力顕微鏡と内皮グリコカリックスの機械的性質の定量化

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

原子間力顕微鏡を用いた生細胞の機械的特性を測定する

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Remote Magnetic Actuation of Micrometric Probes for in situ 3D Mapping of Bacterial Biofilm Physical Properties

Bacterial adhesion and growth on interfaces lead to the formation of three-dimensional heterogeneous structures so-called biofilms. The cells dwelling in these structures are held together by physical interactions mediated by a network of extracellular polymeric substances. Bacterial biofilms impact many human activities and the understanding of their properties is crucial for a better control of their development &#8212; maintenance or eradication &#8212; depending on their adverse or beneficial outcome. This paper describes a novel methodology aiming to measure in situ the local physical properties of the biofilm that had been, until now, examined only from a macroscopic and homogeneous material perspective. The experiment described here&#160;involves introducing magnetic particles into a growing biofilm to seed local probes that can be remotely actuated without disturbing the structural properties of the biofilm. Dedicated magnetic tweezers were developed to exert a defined force on each particle embedded in the biofilm. The setup is mounted on the stage of a microscope to enable the&#160;recording of time-lapse images of the particle-pulling period. The particle trajectories are then extracted from the pulling sequence and the local viscoelastic parameters are derived from each particle displacement curve, thereby providing the 3D-spatial distribution of the parameters. Gaining insights into the biofilm mechanical profile is essential from an engineer&#39;s point of view for biofilm control purposes but also from a fundamental perspective to clarify the relationship between the architectural properties and the specific biology of these structures.

Remote Magnetic Actuation of Micrometric Probes for in situ 3D Mapping of Bacterial Biofilm Physical Properties

This paper shows an original methodology based on the remote actuation of magnetic particles seeded in a bacterial biofilm and the development of dedicated magnetic tweezers to measure in situ the local mechanical properties of the complex living material built by micro-organisms at interfaces.

のためのマイクロメトリックプローブの遠隔磁気作動<em&gt;その場での</em細菌バイオフィルム物性&gt; 3Dマッピング

Bacterial adhesion and growth on interfaces lead to the formation of three-dimensional heterogeneous structures so-called biofilms. The cells dwelling in ...

Investigating the Three-dimensional Flow Separation Induced by a Model Vocal Fold Polyp

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. Polyps and nodules, which are geometric abnormalities that form on the medial surface of the vocal folds, can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Our laboratory has reported particle image velocimetry (PIV) measurements, within an investigation of a model polyp located on the medial surface of an in&#160;vitro driven vocal fold model, which show that such a geometric abnormality considerably disrupts the glottal jet behavior. This flow field adjustment is a likely reason for the severe degradation of the vocal quality in patients with polyps. A more complete understanding of the formation and propagation of vortical structures from a geometric protuberance, such as a vocal fold polyp, and the resulting influence on the aerodynamic loadings that drive the vocal fold dynamics, is necessary for advancing the treatment of this pathological condition. The present investigation concerns the three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted prolate hemispheroid with a 2:1 aspect ratio in cross flow, i.e. a model vocal fold polyp, using an oil-film visualization technique. Unsteady, three-dimensional flow separation and its impact of the wall pressure loading are examined using skin friction line visualization and wall pressure measurements.

Vocal fold polyps can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted model polyp and its impact on the wall pressure loading are examined using particle image velocimetry, skin friction line visualization, and wall pressure measurements.

モデルの声帯ポリープによる三次元流分離の調査

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. ...

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and modified as part of a set of complex, two-way mechanosensitive interactions. While the development of biologically-relevant 3D tumor models have facilitated mechanistic studies on the impact of matrix rheology on tumor growth, the inverse problem of mapping changes in the mechanical environment induced by tumors remains challenging. Here, we describe the implementation of particle-tracking microrheology (PTM) in conjunction with 3D models of pancreatic cancer as part of a robust and viable approach for longitudinally monitoring physical changes in the tumor microenvironment, in situ. The methodology described here integrates a system of preparing in vitro 3D models embedded in a model extracellular matrix (ECM) scaffold of Type I collagen with fluorescently labeled probes uniformly distributed for position- and time-dependent microrheology measurements throughout the specimen. In vitro tumors are plated and probed in parallel conditions using multiwell imaging plates. Drawing on established methods, videos of tracer probe movements are transformed via the Generalized Stokes Einstein Relation (GSER) to report the complex frequency-dependent viscoelastic shear modulus, G*(&#969;). Because this approach is imaging-based, mechanical characterization is also mapped onto large transmitted-light spatial fields to simultaneously report qualitative changes in 3D tumor size and phenotype. Representative results showing contrasting mechanical response in sub-regions associated with localized invasion-induced matrix degradation as well as system calibration, validation data are presented. Undesirable outcomes from common experimental errors and troubleshooting of these issues are also presented. The 96-well 3D culture plating format implemented in this protocol is conducive to correlation of microrheology measurements with therapeutic screening assays or molecular imaging to gain new insights into impact of treatments or biochemical stimuli on the mechanical microenvironment.

Particle-tracking microrheology can be used to non-destructively quantify and spatially map changes in extracellular matrix mechanical properties in 3D tumor models.

粒子追跡マイクロレオロジーを用いて3次元腫瘍モデルにおける細胞外マトリックス剛性の縦測定

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

アン<em&gt;インビトロ</emマウス椎間板の&gt;器官培養モデル

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

A Millimeter Scale Flexural Testing System for Measuring the Mechanical Properties of Marine Sponge Spicules

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the flexural behavior of these LBBSs is important for understanding the origins of their remarkable mechanical functions.
We describe a protocol for performing three-point bending tests using a custom-built mechanical testing device that can measure forces ranging from 10-5 to 101 N and displacements ranging from 10-7 to 10-2 m. The primary advantage of this mechanical testing device is that the force and displacement capacities can be easily adjusted for different LBBSs. The device&#39;s operating principle is similar to that of an atomic force microscope. Namely, force is applied to the LBBS by a load point that is attached to the end of a cantilever. The load point displacement is measured by a fiber optic displacement sensor and converted into a force using the measured cantilever stiffness. The device&#39;s force range can be adjusted by using cantilevers of different stiffnesses.
The device&#39;s capabilities are demonstrated by performing three-point bending tests on the skeletal elements of the marine sponge Euplectella aspergillum. The skeletal elements&#8212;known as spicules&#8212;are silica fibers that are approximately 50 &#181;m in diameter. We describe the procedures for calibrating the mechanical testing device, mounting the spicules on a three-point bending fixture with a &#8776;1.3 mm span, and performing a bending test. The force applied to the spicule and its deflection at the location of the applied force are measured.

We present a protocol for performing three-point bending tests on sub-millimeter scale fibers using a custom-built mechanical testing device. The device can measure forces ranging from 20 &#181;N up to 10 N and can therefore accommodate a variety of fiber sizes.

海綿骨の機械的性質を測定するためミリ スケール曲げテスト システム

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although various RT-3D-SPT methods have been put forward in recent years, tracking high speed 3D diffusing particles at low photon count rates remains a challenge. Moreover, RT-3D-SPT setups are generally complex and difficult to implement, limiting their widespread application to biological problems. This protocol presents a RT-3D-SPT system named 3D Dynamic Photon Localization Tracking (3D-DyPLoT), which can track particles with high diffusive speed (up to 20 &#181;m2/s) at low photon count rates (down to 10 kHz). 3D-DyPLoT employs a 2D electro-optic deflector (2D-EOD) and a tunable acoustic gradient (TAG) lens to drive a single focused laser spot dynamically in 3D. Combined with an optimized position estimation algorithm, 3D-DyPLoT can lock onto single particles with high tracking speed and high localization precision. Owing to the single excitation and single detection path layout, 3D-DyPLoT is robust and easy to set up. This protocol discusses how to build 3D-DyPLoT step by step. First, the optical layout is described. Next, the system is calibrated and optimized by raster scanning a 190 nm fluorescent bead with the piezoelectric nanopositioner. Finally, to demonstrate real-time 3D tracking ability, 110 nm fluorescent beads are tracked in water.

This protocol details the construction and operation of a real-time 3D single particle tracking microscope capable of tracking nanoscale fluorescent probes at high diffusive speeds and low photon count rates.

リアルタイム 3 D 単一粒子追跡のためのプロトコル

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...