我々は、博士に感謝します。原稿上で有益なコメントをメーラセナとジョナサンマティアス。我々は、博士に感謝する。トランスジェニック系統を提供するためのマイケルパーソンズ、パメラレイモンド、そしてレイチェルウォン。動物実験はプロトコル07-12-003を承認MCG IACUCによって定められたガイドラインおよび規制に準拠して行った* B.この作品は、JSMにNIH R21 MH083614とダイムバジルOコナースターターScholarの賞の月によってサポートされていました

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	<li>K&#246;ster, R. W., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+microscopy+of+brain+development.">Time-lapse microscopy of brain development.</a> Methods Cell Biol. 76, 207-235 (2004).</li><li>Mumm, J. S., Williams, P. R., Godinho, L., Koerber, A., Pittman, A. J., Roeser, T., Chien, C. B., Baier, H., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+reveals+dendritic+targeting+of+laminated+afferents+by+zebrafish+retinal+ganglion+cells.">In vivo imaging reveals dendritic targeting of laminated afferents by zebrafish retinal ganglion cells.</a> Neuron. 52, 609-621 (2006).</li><li>Curado, S., Anderson, R. M., Jungblut, B., Mumm, J., Schroeter, E., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+targeted+cell+ablation+in+zebrafish:+a+new+tool+for+regeneration+studies.">Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies.</a> Dev Dyn. 236, 1025-1035 (2007).</li><li>Ren, J. Q., McCarthy, W. R., Zhang, H., Adolph, A. R., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+visual+responses+of+wild-type+and+hypopigmented+zebrafish.">Behavioral visual responses of wild-type and hypopigmented zebrafish.</a> Vision Res. 42, 293-299 (2002).</li><li>Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+ablation+of+beta+cells+in+the+embryonic+zebrafish+pancreas+using+E.+Coli+nitroreductase.">Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. Coli nitroreductase.</a> Mech Dev. 124, 218-229 (2007).</li><li>Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos.">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J Vis Exp. , (2009).</li></ol>

JSMは、ゼブラフィッシュの細胞のアブレーション（マムJS、とシュレーター、ゼブラフィッシュ&quot;米国特許7514595のEHターゲットと地域アブレーション携帯アブレーション。2009年4月7日）のニトロベースのシステムの使用に関する特許を授与されている。この手法は、さツールとJSMはステークホルダーインチ設立し、残っているサービスのバイオテクノロジー企業、Luminomics、（株）、のための一般的なプラットフォームとして使用さ

このビデオでは、我々は多色共焦点タイムラプスイメージングと標的細胞のアブレーションのために使用するテクニックの概要が提供されています。標的細胞のアブレーションが神経回路の機能および細胞特異的神経再生のパラダイムを研究するために使用されている間我々は、 生体内での関心の複数の細胞型の動作を監視するためのタイムラプスイメージング法を用いています。の例では、これらのアプローチから収集することができますいくつかの利点を強調示した。おそらく最も重要なのは、タイムラプスイメージングは​​、内部で制御パラダイムを提供し、観察されたとすべての現象は、以前の状態に戻って関連付けることができます。これは直接ではなく、推測の比較は定量化が容易に相対的な変更を加えると、集団内のばらつきに関連する実験的な&quot;ノイズ&quot;を減らし、実験的なタイムポイント間を行うことができます。多色イメージングの利点は、相互作用および/または隣接する細胞の種類の変化を視覚化する機能です。例えば、ミュラーグリアにラベルを付けるトランスジェニックラインを使用して、我々は今、離散網膜細胞の亜集団の損失にこれらの潜在的な損傷によって誘発された幹細胞の応答を予想されています。我々はまた、神経回路形成2の新たなメカニズムを定義するには、このアプローチを使用している。最後に、細胞再生の研究に加えて、我々は最近、様々な行動パラダイムと電気生理学的アッセイを用いて神経細胞サブタイプこのように離散的な神経回路の機能的役割を調査するためにNTRベースのアブレーションシステムを使用し始めている。このような研究にゼブラフィッシュを用いてのユニークな利点は、彼らの再生能力のために、誘導の赤字は一時的なもの、ということです。このように、タイムラプスイメージングアッセイと相関させることによって我々は、神経再支配につながるメカニズム、ならびに、機能回復のために必要な神経再生の程度を象徴化することができます。 提供されるメソッドは、多くの異なる質問に適合させることができます。例えば、アブレーションと再生の同様の分析は、どのトランスジェニック定義可能な細胞のサブタイプに適用することができます。総称して、このような研究は、個々の細胞型のレベルと離散的幹細胞のニッチ内の再生の我々の理解を拡大する可能性があります。

1。試薬： Danieauのソリューション： <ul><li>塩化ナトリウム（フィッシャー、S271 1） </li><li>塩化カリウム（フィッシャー、P217 500） </li><li> HEPES（フィッシャー、BP310500） </li><li>硫酸マグネシウム（フィッシャー、M65 500） </li><li>硝酸カルシウム（フィッシャー、C109500） </li><li>ペニシリン - ストレプトマイシン（フィッシャー、ICN1670049） </li></ul>その他の試薬： <ul><li>低融点アガロース（フィッシャー、BP165 - 25） </li><li> Tricaneメタン（フィッシャー、NC9435281） </li><li> N -フェニルチオ尿素（フィッシャー、NC9968868） </li><li>メトロニダゾール（フィッシャー、AC21034 - 1000） </li></ul> 2。消耗品： <ul><li>深いペトリ皿（フィッシャーサイエンティフィック/コーニング、08-772-32） </li><li>デュモン＃5微細な鉗子（フィッシャー、NC9404145） </li></ul> 3。設備： <ul><li>ズームステレオスコープ（オリンパス、SZ51） </li><li>蛍光のズームステレオスコープ（オリンパス、SZX16） </li><li>共焦点顕微鏡（オリンパスFV1000） </li><li>デジタルブロックヒーター - Isotemp（フィッシャー、11 - 715 - 125DQ） </li><li>バーンズテッド/ Thermolyneベンチトップインキュベータ（フィッシャー、11-702-4）。 </li></ul>

multicolor time-lapse imaging of transgenic zebrafish: visualizing retinal stem cells activated by targeted neuronal cell ablation

生きているゼブラフィッシュの幼虫の高解像度のタイムラプスイメージングは、生物学的プロセスは、（レビュー用の1を参照）展開を視覚的に利用することができます。隣接セルの種類に異なる蛍光レポーターを表現する化合物トランスジェニック魚は時間をかけて実験操作する細胞間相互作用2および/ ​​または組織レベルの応答を以下の手段を提供します。このビデオでは、我々は数日間に数分からまたがることができる時間のコース上の個々の魚に連載イメージング複数の遺伝子導入によって標識された細胞のタイプに使用できるメソッドを示しています。 ）を分離するための簡略化のアプローチ1）シリアル&quot;キャッチ＆リリース&quot;イメージングのための方法を連続する日、2以上の魚の数が多い：記載された技術は含めて、時間をかけて隣接セルのタイプの&quot;振る舞い&quot;を関連付けるために求めるあらゆる試験に適用可能である重複する励起/発光プロファイル（例えば、GFPおよびYFP）と蛍光体、3）開発の後期幼生の段階に高分解能イメージングのための利用できる時間のウィンドウを拡張するために脱色素の突然変異系統の利用、4）明らかにするために膜を対象と蛍光レポーターの使用個々の細胞だけでなく、細胞の大きな集団での携帯電話の詳細、およびトランスジェニック標的細胞型の化学的に誘導アブレーションのための5）前述の方法の細かい形態学的な詳細、などメトロニダゾールとして、すなわち、プロドラッグ基質のニトロレダクターゼ（NTR）を介した変換、 （MTZ）、細胞傷害性誘導体の3,5へ。 これらのアプローチの例として、我々は数日間にわたって個々の魚内網膜双極ニューロンのサブタイプのアブレーションと再生を見ることができます。同時に我々は、隣接する非標的双極細胞や潜在的な変性刺激による網膜幹細胞（すなわち、Mϋllerのグリア）を含むいくつかの他の網膜細胞の種類を、監視します。この戦略は、標的神経細胞の種類の選択的喪失と再生するために、細胞や組織レベル（例えば、幹細胞ニッチ）の応答を特徴づけるために私たちの研究室で応用されている。

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Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

このビデオでは、多色共焦点タイムラプスイメージングと標的細胞のアブレーションのための技術が提供される。タイムラプスイメージングは​​、関心の複数の細胞型の動作を監視するために使用されます<em&gt; in vivoで</em&gt;。標的細胞のアブレーションでは、研究神経回路の機能および細胞特異的神経再生のパラダイムを容易にします。

トランスジェニックゼブラフィッシュの多色タイムラプスイメージング：標的神経細胞のアブレーションによって活性化を可視化網膜幹細胞

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

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Research

JoVE Journal

Biology

16.3K ビュー.  Medical College of Georgia. このビデオでは、多色共焦点タイムラプスイメージングと標的細胞のアブレーションのための技術が提供される。タイムラプスイメージングは​​、関心の複数の細胞型の動作を監視するために使用されます in vivoで。標的細胞のアブレーションでは、研究神経回路の機能および細胞特異的神経再生のパラダイムを容易にします。