Queremos agradecer a los Dres. Meera Saxena y Jonathan Mathias por sus valiosos comentarios sobre el manuscrito. Agradecemos a los Dres. Michael Parsons, Raymond Pamela, y Wong Rachel para proporcionar líneas transgénicas. Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y normas establecidas por el protocolo aprobado IACUC MCG 07-12-003 * B. Este trabajo fue apoyado por el NIH R21 MH083614 y March of Dimes Premio Basilio O Conner Académico de inicio de JSM

<ol>
	<li>K&#246;ster, R. W., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+microscopy+of+brain+development.">Time-lapse microscopy of brain development.</a> Methods Cell Biol. 76, 207-235 (2004).</li><li>Mumm, J. S., Williams, P. R., Godinho, L., Koerber, A., Pittman, A. J., Roeser, T., Chien, C. B., Baier, H., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+reveals+dendritic+targeting+of+laminated+afferents+by+zebrafish+retinal+ganglion+cells.">In vivo imaging reveals dendritic targeting of laminated afferents by zebrafish retinal ganglion cells.</a> Neuron. 52, 609-621 (2006).</li><li>Curado, S., Anderson, R. M., Jungblut, B., Mumm, J., Schroeter, E., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+targeted+cell+ablation+in+zebrafish:+a+new+tool+for+regeneration+studies.">Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies.</a> Dev Dyn. 236, 1025-1035 (2007).</li><li>Ren, J. Q., McCarthy, W. R., Zhang, H., Adolph, A. R., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+visual+responses+of+wild-type+and+hypopigmented+zebrafish.">Behavioral visual responses of wild-type and hypopigmented zebrafish.</a> Vision Res. 42, 293-299 (2002).</li><li>Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+ablation+of+beta+cells+in+the+embryonic+zebrafish+pancreas+using+E.+Coli+nitroreductase.">Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. Coli nitroreductase.</a> Mech Dev. 124, 218-229 (2007).</li><li>Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos.">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J Vis Exp. , (2009).</li></ol>

JSM ha otorgado una patente sobre el uso del sistema de nitrorreductasa basado en la ablación de células en el pez cebra (Mumm JS, y Schroeter, EH ablación La ablación selectiva y regionales celular en el pez cebra de Patentes &quot;EE.UU. 7.514.595. 07 de abril 2009). Esta técnica es utilizado como la plataforma general para una empresa de servicios y herramientas de la biotecnología, Luminomics, Inc., que JSM fundó y sigue siendo una parte interesada pulg

En este vídeo, un resumen de las técnicas que utilizamos para la multicolor confocal de imágenes a intervalos de tiempo y la ablación de células específicas se proporciona. Contamos con time-lapse de imágenes para controlar el comportamiento de los múltiples tipos de células de interés en vivo, mientras que la ablación dirigida celda se utiliza para estudiar la función de circuitos neuronales y células específicas de los paradigmas de regeneración neuronal. Los ejemplos que se muestran destacan varias ventajas que se puede extraer de estos enfoques. Quizá lo más importante, time-lapse de imágenes proporciona un paradigma controlado internamente, fenómenos todos y cada uno observado puede relacionarse con estados previos. Esto permite que las comparaciones directas en lugar de inferir que se hizo a través de los puntos de tiempo experimental, por lo que los cambios relativos más fáciles de cuantificar y reducir experimental &quot;ruido&quot; asociado a las variaciones dentro de una población. Una ventaja de la imagen multicolor es la capacidad de visualizar los cambios en la interacción y / o tipos de células vecinas. Por ejemplo, utilizando una línea transgénica que las etiquetas de las células de Müller, que ahora caracterizan la respuesta de estas células madre potencial de lesión inducida por la pérdida de la discreta subpoblaciones de células retinianas. También hemos utilizado este enfoque para definir nuevos mecanismos de formación de circuitos neurales 2. Finalmente, además de los estudios de regeneración celular, recientemente hemos comenzado a utilizar el sistema de ablación por NTR basada en investigar el papel funcional de los subtipos neuronales tanto los circuitos neuronales discretos utilizando diversos paradigmas de comportamiento y ensayos electrofisiológicos. La única ventaja de emplear al pez cebra para tales estudios es que, debido a su capacidad de regeneración, los déficits inducidos son temporales. De este modo, mediante la correlación con los ensayos de imágenes con lapso de tiempo se pueden tipificar los mecanismos que conducen a la reinervación, así como la extensión de la reinervación necesarios para la recuperación funcional. Los métodos siempre se puede adaptar a muchas preguntas diferentes. Por ejemplo, los análisis similar de la ablación y la regeneración se puede aplicar a cualquier subtipo celular transgénica definible. En conjunto, estos estudios tienen el potencial para ampliar nuestra comprensión de la regeneración en el nivel de tipos de células individuales y en discreta nichos de células madre.

1. Reactivos: Danieau solución de: <ul><li> cloruro de sodio (Fisher, S271 1) </li><li> cloruro de potasio (Fisher, P217 500) </li><li> HEPES (Fisher, BP310500) </li><li> sulfato de magnesio (Fisher, M65 500) </li><li> nitrato de calcio (Fisher, C109500) </li><li> Penicilina-estreptomicina (Fisher, ICN1670049) </li></ul> Otros reactivos: <ul><li> Bajo agarosa fundido (Fisher, BP165-25) </li><li> Tricane metanosulfonato (Fisher, NC9435281) </li><li> N-feniltiourea (Fisher, NC9968868) </li><li> Metronidazol (Fisher, AC21034-1000) </li></ul> 2. Suministros: <ul><li> Profunda placas petri (Fisher Scientific / Corning, 08-772-32) </li><li> Dumont # 5 pinzas finas (Fisher, NC9404145) </li></ul> 3. Equipos: <ul><li> Ampliar estereoscopio (Olympus, SZ51) </li><li> Fluorescencia Estereoscopio Zoom (Olympus, SZX16) </li><li> Microscopio confocal (Olympus FV1000) </li><li> Digital calentador del bloque - Isotemp (Fisher, 11-715-125DQ) </li><li> Barnstead / Thermolyne Incubadora de sobremesa (Fisher, 11-702-4). </li></ul>

multicolor time-lapse imaging of transgenic zebrafish: visualizing retinal stem cells activated by targeted neuronal cell ablation

De alta resolución de imágenes a intervalos de tiempo de larvas de pez cebra de vida se puede utilizar para visualizar cómo se desarrollan los procesos biológicos (para revisión ver 1). Pescado compuesto transgénicos que expresan diferentes reporteros fluorescentes en los tipos de células vecinas proporcionar un medio para seguir las interacciones celulares 2 y / o respuestas a nivel de tejido de manipulaciones experimentales en el tiempo. En este vídeo, que muestran los métodos que se pueden utilizar para obtener imágenes de múltiples tipos de células en serie en la etiqueta transgénica pez sobre los cursos de tiempo que puede abarcar desde unos minutos hasta varios días. Las técnicas descritas son aplicables a cualquier estudio que busque relacionar el &quot;comportamiento&quot; de los tipos de células vecinas a través del tiempo, incluyendo: &quot;catch and release&quot; 1) serie de métodos para obtener imágenes de una gran cantidad de pescado en los días sucesivos, 2) métodos simplificados para la separación fluoróforos con la superposición de excitación / emisión perfiles (por ejemplo, las buenas prácticas agrarias y YFP), 3) el uso de hipopigmentadas líneas mutantes de extender la ventana de tiempo disponible para imágenes de alta resolución en las últimas etapas de larvas de desarrollo, 4) el uso de la membrana dirigido a los periodistas a revelar fluorescentes pequeños detalles morfológicos de las células individuales, así como los detalles celulares en poblaciones más grandes de las células, y 5) un método descrito anteriormente para químicamente inducida por la ablación de los tipos de células transgénicamente objetivo, es decir, nitrorreductasa (NTR) mediada la conversión de sustratos profármaco, como metronidazol (MTZ), a los derivados citotóxicos 3,5. Como ejemplo de estos enfoques, que se podrá visualizar la ablación y la regeneración de un subtipo de la retina neurona bipolar en cada pez durante varios días. Al mismo tiempo vamos a analizar varios otros tipos de células retinianas, incluyendo vecinos no atacaba las células bipolares y el potencial de estimular la degeneración de las células madre de la retina (es decir, las células de Mϋller). Esta estrategia está siendo aplicada en nuestro laboratorio para caracterizar las células y los tejidos a nivel (por ejemplo, el nicho de células madre) las respuestas a la pérdida selectiva y regeneración de los dirigidos tipos de células neuronales.

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Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

En este video, las técnicas para la multicolor confocal de imágenes a intervalos de tiempo y la ablación de células específicas se proporcionan. Time-lapse de imágenes se utiliza para controlar el comportamiento de los múltiples tipos de células de interés<em&gt; In vivo</em&gt;. La ablación dirigida celular facilita la función de estudio de circuitos neuronales y células específicas de los paradigmas regeneración neuronal.

Multicolor Time-lapse de imágenes de pez cebra transgénico: Visualización de células madre retinianas activado por la ablación selectiva de células neuronales

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

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Research

JoVE Journal

Biology

16.3K vistas.  Medical College of Georgia. En este video, las técnicas para la multicolor confocal de imágenes a intervalos de tiempo y la ablación de células específicas se proporcionan. Time-lapse de imágenes se utiliza para controlar el comportamiento de los múltiples tipos de células de interés In vivo. La ablación dirigida celular facilita la función de estudio de circuitos neuronales y células específicas de los paradigmas regeneración neuronal.