Wir möchten Drs danken. Meera Saxena und Jonathan Mathias für hilfreiche Kommentare zum Manuskript. Wir danken Drs. Michael Parsons, Pamela Raymond, und Rachel Wong für die Bereitstellung von transgenen Linien. Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her durch die MCG IACUC genehmigten Protokoll durchgeführt 07-12-003 * B. Diese Arbeit wurde vom NIH R21 MH083614 und March of Dimes Basil O Conner Starter Scholar Award an JSM unterstützt

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	<li>K&#246;ster, R. W., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+microscopy+of+brain+development.">Time-lapse microscopy of brain development.</a> Methods Cell Biol. 76, 207-235 (2004).</li><li>Mumm, J. S., Williams, P. R., Godinho, L., Koerber, A., Pittman, A. J., Roeser, T., Chien, C. B., Baier, H., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+reveals+dendritic+targeting+of+laminated+afferents+by+zebrafish+retinal+ganglion+cells.">In vivo imaging reveals dendritic targeting of laminated afferents by zebrafish retinal ganglion cells.</a> Neuron. 52, 609-621 (2006).</li><li>Curado, S., Anderson, R. M., Jungblut, B., Mumm, J., Schroeter, E., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+targeted+cell+ablation+in+zebrafish:+a+new+tool+for+regeneration+studies.">Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies.</a> Dev Dyn. 236, 1025-1035 (2007).</li><li>Ren, J. Q., McCarthy, W. R., Zhang, H., Adolph, A. R., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+visual+responses+of+wild-type+and+hypopigmented+zebrafish.">Behavioral visual responses of wild-type and hypopigmented zebrafish.</a> Vision Res. 42, 293-299 (2002).</li><li>Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+ablation+of+beta+cells+in+the+embryonic+zebrafish+pancreas+using+E.+Coli+nitroreductase.">Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. Coli nitroreductase.</a> Mech Dev. 124, 218-229 (2007).</li><li>Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos.">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J Vis Exp. , (2009).</li></ol>

JSM hat ein Patent auf die Verwendung des Nitroreduktase-basierte System von Zellablation im Zebrafisch (Mumm JS, und Schroeter, EH Gezielte und Regional Ablation Cellular Ablation im Zebrafisch &quot;US-Patent 7514595. 7. April 2009) ausgezeichnet. Diese Technik ist verwendet als allgemeine Plattform für ein Tools und Services Biotechnologie-Unternehmen, Luminomics, Inc., dass JSM gegründet und ist ein Stakeholder in.

In diesem Video wird ein Überblick über die Techniken, die wir für multicolor konfokalen Zeitraffer-Imaging-und Zielzelle Ablation zur Verfügung gestellt. Wir beschäftigen Zeitraffer-Imaging um das Verhalten der verschiedenen Zelltypen des Interesses in vivo beobachten, während Zielzelle Ablation wird verwendet, um neuronale Schaltkreis Funktion und Zell-spezifische neuronale Regeneration Paradigmen zu studieren. Die gezeigten Beispiele hervorheben mehrere Vorteile, die sich aus diesen Ansätzen entnommen werden kann. Vielleicht am wichtigsten ist, bietet Zeitraffer-Bildgebung eine intern gesteuert Paradigma; sämtliche Phänomene beobachtet werden können zurück zur vorherigen Zustände bezogen werden. Dies ermöglicht den direkten anstatt abgeleitet Vergleiche zwischen experimentellen Zeitpunkten vorgenommen werden, so dass relative Veränderungen leichter zu quantifizieren und zu reduzieren experimentellen &quot;Rauschen&quot; mit Variationen innerhalb einer Population assoziiert. Ein Vorteil der multicolor Bildgebung ist die Fähigkeit, Veränderungen im Umgang und / oder benachbarten Zelltypen zu visualisieren. Zum Beispiel mit Hilfe einer transgenen Linie, die Müller Glia-Etiketten, sind wir nun die Charakterisierung der Reaktion dieser möglichen Verletzung induzierten Stammzellen, um den Verlust von diskreten retinalen Zell-Subpopulationen. Wir haben auch diesen Ansatz verwendet, um neuartige Mechanismen der neuronalen Schaltkreis Bildung 2 zu definieren. Schließlich wird neben dem Studium der Zellregeneration, haben wir vor kurzem begonnen mit der NTR-basierte Ablation System der funktionalen Rolle neuronaler Subtypen damit diskrete neuronale Schaltungen mit verschiedenen Verhaltens-Paradigmen und elektrophysiologische Tests zu untersuchen. Der einzigartige Vorteil der Verwendung der Zebrafisch für solche Untersuchungen ist, dass aufgrund ihrer Regenerationsfähigkeit, induzierte Defizite vorübergehend sind. So kann durch die Korrelation mit Zeitraffer-Imaging-Assays können wir verkörpern Reinnervation Mechanismen, die zu führen, sowie das Ausmaß der Reinnervation für, funktionelle Wiederherstellung erforderlich sind. Die Methoden bereitgestellt werden, um viele verschiedene Fragestellungen angepasst werden. So können ähnliche Analysen der Ablation und Regeneration keine transgen definierbare zellulären Subtyp angewendet werden. Gemeinsam haben solche Studien Potenzial für unser Verständnis der Wiedergeburt auf der Ebene der einzelnen Zelltypen und in diskreter Stammzellnischen erweitern.

1. Reagenzien: Danieau-Lösung: <ul><li> Natriumchlorid (Fisher, S271 1) </li><li> Kaliumchlorid (Fisher, P217 500) </li><li> HEPES (Fisher, BP310500) </li><li> Magnesiumsulfat (Fisher, M65 500) </li><li> Calciumnitrat (Fisher, C109500) </li><li> Penicillin-Streptomycin (Fisher, ICN1670049) </li></ul> Andere Reagenzien: <ul><li> Low Melt Agarose (Fisher, BP165-25) </li><li> Tricane Methansulfonat (Fisher, NC9435281) </li><li> N-Phenylthioharnstoff (Fisher, NC9968868) </li><li> Metronidazol (Fisher, AC21034-1000) </li></ul> 2. Zubehör: <ul><li> Tief Petrischalen (Fisher Scientific / Corning, 08-772-32) </li><li> Dumont Nr. 5 feinen Pinzette (Fisher, NC9404145) </li></ul> 3. Ausstattung: <ul><li> Zoom Stereoskop (Olympus, SZ51) </li><li> Fluoreszenz-Zoom Stereoskop (Olympus, SZX16) </li><li> Konfokalen Mikroskop (Olympus FV1000) </li><li> Digitale Motorvorwärmung - Isotemp (Fisher, 11 bis 715-125DQ) </li><li> Barnstead / Thermolyne Benchtop Inkubator (Fisher, 11-702-4). </li></ul>

multicolor time-lapse imaging of transgenic zebrafish: visualizing retinal stem cells activated by targeted neuronal cell ablation

Hochauflösende Zeitraffer-Imaging lebender Zebrafischlarven kann genutzt werden, um zu visualisieren, wie biologische Prozesse entfalten (für eine Übersicht siehe 1). Compound transgene Fische, die verschiedenen fluoreszierenden Reporter Express in benachbarten Zelltypen bieten eine Möglichkeit, folgende zellulären Interaktionen 2 und / oder Gewebe-Ebene Antworten auf experimentelle Manipulationen im Laufe der Zeit. In diesem Video zeigen wir Methoden, die für die Bildgebung mehrere transgen bezeichnet Zelltypen verwendet werden können seriell in den einzelnen Fisch im Laufe der Zeit Kurse, die von einigen Minuten bis zu mehreren Tagen erstrecken kann. Die beschriebenen Techniken gelten für alle Studie versucht, das &quot;Verhalten&quot; der benachbarten Zellen-Typen im Laufe der Zeit zu korrelieren, darunter: 1) Serie &quot;catch and release&quot;-Methoden für die Bildgebung eine große Anzahl von Fischen über mehrere aufeinander folgende Tage, 2) vereinfachte Ansätze zur Trennung Fluorophore mit überlappenden Anregungs-/ Emissions-Profile (zB GFP und YFP), 3) Verwendung von hypopigmentierte Mutantenlinien zu erweitern das Zeitfenster für hochauflösende Bildgebung in den späten Larvenstadien der Entwicklung, 4) Einsatz von Membran gezielt fluoreszierenden Reporter zu offenbaren feine morphologische Details der einzelnen Zellen sowie zelluläre Details in größeren Populationen von Zellen, und 5) eine zuvor beschriebene Verfahren zum chemisch-induzierte Ablation von transgen gezielte Zelltypen, dh Nitroreduktase (NTR) vermittelte Umwandlung von Prodrug Substrate, wie Metronidazol (MTZ), um zytotoxische Derivate 3,5. Als ein Beispiel dieser Ansätze werden wir visualisieren die Ablation und Regeneration ein Subtyp der Netzhaut bipolaren Neuronen innerhalb der einzelnen Fische über mehrere Tage. Gleichzeitig werden wir überwachen mehrere andere retinale Zelltypen, einschließlich benachbarten Nicht-Ziel bipolaren Zellen und potenziellen Degeneration der Netzhaut-stimulierten Stammzellen (dh Mϋller Glia). Diese Strategie wird in unserem Labor angewendet, Zell-und Gewebe-Ebene (zB Stammzellnische) Antworten auf die selektive Verlust und Regeneration von gezielten neuronalen Zelltypen zu charakterisieren.

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Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

In diesem Video werden Techniken für multicolor konfokalen Zeitraffer-Imaging-und Zielzelle Ablation zur Verfügung gestellt. Zeitraffer-Imaging wird verwendet, um das Verhalten der verschiedenen Zelltypen des Interesses zu überwachen<em&gt; In vivo</em&gt;. Gezielte Zellablation erleichtert die Studie neuronalen Schaltkreis Funktion und Zell-spezifische neuronale Regeneration Paradigmen.

Multicolor Zeitraffer-Imaging transgener Zebrafische: Visualisierung von Retinal Stammzellen durch gezielte Nervenzellen Ablation Activated

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

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16.3K Aufrufe.  Medical College of Georgia. In diesem Video werden Techniken für multicolor konfokalen Zeitraffer-Imaging-und Zielzelle Ablation zur Verfügung gestellt. Zeitraffer-Imaging wird verwendet, um das Verhalten der verschiedenen Zelltypen des Interesses zu überwachen In vivo. Gezielte Zellablation erleichtert die Studie neuronalen Schaltkreis Funktion und Zell-spezifische neuronale Regeneration Paradigmen.