この作品は、健康補助NS - 38849と糖尿病の合併症の研究のためのDK - 076160、少年糖尿病研究財団センター、神経学研究と発見とでA.アルフレッドトーブマン医学研究所のプログラムの国立研究所によってサポートされていましたミシガン大学。この作品は、形態と糖尿病および消化器腎臓病研究所から健康グラント5P60 DK - 20572の国民の協会によって資金を供給ミシガン糖尿病研究研修センター、の画像解析のコアを使用。著者は様々な彼の貴重なアドバイスのための分子プローブ/ InvitrogenからスコットT.クラークに感謝をクリックして、それがEDUの増幅技術の初期の開発を支援するためのキットや試薬の寛大な寄付をラベリングEDU。

<ol>
	<li>Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+fusion+and+fission+in+mammals.">Mitochondrial fusion and fission in mammals.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 79-99 (2006).</li><li>Dimmer, K. S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(De)constructing+mitochondria:+what+for.">(De)constructing mitochondria: what for.</a> Physiology (Bethesda). 21, 233-241 (2006).</li><li>Suen, D. F., Norris, K. L., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics+and+apoptosis.">Mitochondrial dynamics and apoptosis.</a> Genes Dev. 22, 1577-1590 (2008).</li><li>Clay Montier, L. L., Deng, J. J., Bai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Number+matters:+control+of+mammalian+mitochondrial+DNA+copy+number.">Number matters: control of mammalian mitochondrial DNA copy number.</a> J. Genet. Genomics. 36 (3), 125-131 (2009).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).</li><li>Buck, S. B., Bradford, J., Gee, K. R., Agnew, B. J., Clarke, S. T., Salic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+S-phase+cell+cycle+progression+using+5-ethynyl-2'-deoxyuridine+incorporation+with+click+chemistry,+an+alternative+to+using+5-bromo-2'-deoxyuridine+antibodies.">Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies.</a> Biotechniques. 44, 927-929 (2008).</li><li>Yu, Y., Arora, A., Min, W., Roifman, C. 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Cytochem. 45 (2), 315-319 (1997).</li><li>Cappella, P., Gasparri, F., Pulici, M., Moll, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+based+on+click+chemistry,+which+overcomes+limitations+of+cell+cycle+analysis+by+classical+determination+of+BrdU+incorporation,+allowing+multiplex+antibody+staining.">A novel method based on click chemistry, which overcomes limitations of cell cycle analysis by classical determination of BrdU incorporation, allowing multiplex antibody staining.</a> Cytometry A. 73, 626-636 (2008).</li><li>Kaiser, C. L., Kamien, A. J., Shah, P. A., Chapman, B. J., Cotanche, D. 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I., Figueroa-Romero, C., Cerri, F., Backus, C., Hong, Y., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+regulates+mitochondrial+biogenesis+and+fission+in+mouse+neurons.">Diabetes regulates mitochondrial biogenesis and fission in mouse neurons.</a> Diabetologia. 53 (1), 160-169 (2010).</li><li>Davis, A. F., Clayton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+localization+of+mitochondrial+DNA+replication+in+intact+mammalian+cells.">In situ localization of mitochondrial DNA replication in intact mammalian cells.</a> J. Cell Biol. 135, 883-893 (1996).</li><li>Magnusson, J., Orth, M., Lestienne, P., Taanman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+mitochondrial+DNA+occurs+throughout+the+mitochondria+of+cultured+human+cells.">Replication of mitochondrial DNA occurs throughout the mitochondria of cultured human cells.</a> Exp. Cell. Res. 289, 133-142 (2003).</li><li>Amiri, M., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+biogenesis+in+the+axons+of+vertebrate+peripheral+neurons.">Mitochondrial biogenesis in the axons of vertebrate peripheral neurons.</a> Dev. Neurobiol. 68, 1348-1361 (2008).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

我々は、EDUのチラミド信号増幅を使用して、個々の細胞内で新しく合成されたミトコンドリアDNAを標識するために感度の高いアッセイを開発した。このプロトコルの最適化中の最大の問題の1つは、カバーグラスの間に一貫性のない結果だった。変更は、個々のカバーガラス上で少量を混合し、すべてのカバーガラスに使用するマスターソリューションを避けるためにインビトロジェンのキットのプロトコールに行われました。各12ミリメートルの円形のガラスカバースリップのために使用される75から80μLのサンプル間で一貫性のある結果を得るために十分なソリューションを提供しながら、完全に表面の面積をカバーする理想的なボリュームです。インキュベーション時間と試薬の濃度が最適化されたが、改善は、それらの調整と見られるかもしれません。 プロトコルは、一度、各プロセスを実行するように設計されています。しかし、ステップのいくつかは最初の試みの後に失敗したサンプルを回収する新しいソリューションで繰り返されてきた。特に、EDUのクリック反応のステップ（3.4から3.6）は、バックグラウンドの蛍光が大幅に増加することなく繰り返されてきた。抗オレゴングリーン- HRP抗体のインキュベーション（4.1から4.3）とチラミド増幅（4.4〜4.5）の手順では、また繰り返されて、しかし、増加するため、バックグラウンド蛍光の雑音比と劣悪な信号でより頻繁に結果している。 最も敏感な試薬は、Click - IT EDUマイクロプレートアッセイキットからクリックして- IT EDUバッファ添加物（成分G）とウサギ抗オレゴングリーン- HRP抗体（成分I）です。 4℃で保存されていると6-12ヶ月の間にかなり暗くするときにクリックして- IT EDUバッファの添加剤は、徐々に黄色に変わります。 -20℃でクリックして- IT EDUバッファの添加剤の保管は、Cは、この問題を軽減します。ラベリングとチラミド増幅ステップは、ウサギ抗オレゴングリーン- HRP抗体をミリQのdH 2 Oにそれを再構成するの4-6ヶ月以内に使用されているときに最高の仕事 mtDNAのEDUの軽度のラベリングは、追加の細胞マーカー9月11日との直接比較が可能で、そのような過酷な治療が回復するために必要な5 -ブロモ-2 -デオキシウリジン（BrdU）、などの他のチミジン類似体以上この手法の有用性を、強化さDNA内のそのエピトープ。当研究室で11月12日 、他は13から15を正常ミトコンドリアDNAを標識するためにBrdUを使用している。 BrdU標識法は、EDUのために使用されるものと似ていますが、いくつか重要な違い（図5）があります。 （3.1から3.2まで）上記の透過化工程の後に、BrdUをエピトープが変性ステップ（37℃で30分間2 N塩酸° Cの1X PBSで3回洗浄が続く）で回収される。 BrdUのはその後のBrdUに対する一次抗体で標識されている（ベクターラボラトリーズは、TSAキットから1％ブロッキング液で1:50に希釈し、4℃で一晩インキュベート）。二次抗体のステップの前に（ヤギ抗マウスIgG 1パーセントブロッキング溶液で1:100に希釈しTSAキット＃2と＃5、からHRPにコンジュゲートと、室温で45分間インキュベート）のBrdU信号を増幅するために必要ですTSAの手順（上記4.3から4.5）。ラベルのミトコンドリアDNAに2つのチミジン類似体、EDUとBrdUを、持つことのmtDNAを順次パルスラベリングのパラダイム11で標識することができるデュアルラベル実験を行うために有利で ​​ある。 当研究室では、糖尿病性神経障害、糖尿病の一般的な合併症の文脈におけるミトコンドリア生合成の調節を検討するEDUとミトコンドリアDNAのBrdU標識を使用しています。私たちは正常に個々のニューロン11-12のミトコンドリアDNA生合成の変化を測定するために信号増幅を使用している。この手法は、mtDNAの複製と売上高のかミトコンドリアDNAの合成を阻害する薬剤を識別するためのメカニズムを探求するように設計された他の実験で有用であろう。さらに、EDUとBrdU信号を増幅の基本原理は、他​​の研究でその小節のDNA複製や修復に適用することができる。

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>12 mm coverslips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-545-82</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>245 mm x 245 mm BioAssay Dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>431111</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Parafilm M</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>PM-996</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>paraformaldehye</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P6148</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T-8532</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate buffered saline 10X solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP399</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Transfer Pipet</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>13-711-7M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hydrogen peroxide, 30% in water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP2633</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Click-iT EdU Microplate Assay Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>C10214</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TSA Kit #12, with HRP&#x2014;goat anti-rabbit IgG and Alexa Fluor 488 tyramide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T20922</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TSA Kit #15, with HRP&#x2013;goat anti-rabbit IgG and Alexa Fluor 594 tyramide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T20925</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ProLong Gold antifade reagent with DAPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P-36931</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polyclonal rabbit Neurofilament antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chemicon</td>
<td>AB1981</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mouse monoclonal anti-BrdU antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>VP-B209</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TSA Kit #2, with HRP&#x2014;goat anti-mouse IgG and Alexa Fluor 488 tyramide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T20912</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TSA Kit #5, with HRP&#x2014;goat anti-mouse IgG and Alexa Fluor 594 tyramide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T20915</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

visualization of mitochondrial dna replication in individual cells by edu signal amplification

ミトコンドリア細胞のエネルギーとミトコンドリアの生合成の重要な調節因子は1-3健康な細胞のミトコンドリア数を調節するのに不可欠なコンポーネントですがあります。ミトコンドリア発生を監視するための一つのアプローチは、ミトコンドリアDNA（mtDNA）の複製4の速度を測定することです。我々は、ミトコンドリアDNAの生合成を研究するために、個々の細胞で新たに合成されたミトコンドリアDNAを標識するために感度の高い手法を開発した。テクニックは、ニューロンの細胞内コンパートメント内にミトコンドリアDNAの複製を視覚化するチラミドシグナル増幅（TSA）8プロトコル5-7 5 -エチニル-2&#39; -デオキシウリジン（EDU）の混入を兼ね備えています。 EDU 5-7をラベル付けするために最初のクリックの反応がBrdUのエピトープを露出させるために必要とされるその過酷な酸処理または酵素消化を必要としないため、EDUは、例えば5 -ブロモ-2 -デオキシウリジン（BrdU）のような他のチミジン類似体よりも優れている。 EDUの穏やかなラベリングは、他の細胞のマーカー90から10と、その設立の直接比較が可能になります。ミトコンドリアDNAの生合成を可視化し定量化する能力は、ミトコンドリアの生合成を調節するために、薬剤の毒性、老化、がんや神経変性疾患に関連付けられている病因への洞察を提供する使用されるメカニズムを調査するための不可欠なツールを提供しています。私たちの技術は、感覚神経だけでなく、他のタイプの細胞に適用可能です。ミトコンドリアDNAの生合成を測定するためにこのテクニックの使用は、両方とも正常な細胞生理学だけでなく、障害者の疾病状態の理解をすすめるための重要な意味を持っている。

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Visualization of Mitochondrial DNA Replication in Individual Cells by EdU Signal Amplification

我々は、ミトコンドリアDNAの生合成を研究するために、個々の細胞内で新しく合成されたミトコンドリアDNA（mtDNA）を標識するために感度の高い手法を開発した。テクニックは、ニューロンの細胞内コンパートメント内にミトコンドリアDNAの複製を視覚化するチラミドシグナル増幅（TSA）プロトコルと一緒にEDUの取り込みを兼ね備えています。

EDU信号増幅による個別細胞におけるミトコンドリアDNAの複製の可視化

Mitochondria are key regulators of cellular energy and mitochondrial biogenesis is an essential component of regulating mitochondria numbers in healthy ...

visualization-mitochondrial-dna-replication-individual-cells-edu

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Neuroscience

22.8K ビュー.  University of Michigan. 我々は、ミトコンドリアDNAの生合成を研究するために、個々の細胞内で新しく合成されたミトコンドリアDNA（mtDNA）を標識するために感度の高い手法を開発した。テクニックは、ニューロンの細胞内コンパートメント内にミトコンドリアDNAの複製を視覚化するチラミドシグナル増幅（TSA）プロトコルと一緒にEDUの取り込みを兼ね備えています。