作業は、薬物乱用センター（P50 DA 011806）の国立研究所と国防総省の米国陸軍省（W81XWH - 07 - 1〜0183）によって部分的にサポートされていました。

1。カスタムmiRNAのマイクロアレイの印刷<ol><li>マイクロアレイは、大学や企業ではマイクロアレイの中核施設のサービスを使用してスライド印刷。マイクロアレイ製造の品質は、マイクロアレイ実験の成功のための最も重要な要因の一つです。可能であればいくつかのサービスをお試しください。理想的には、一度に50から100までのスライドを印刷して、そしてすべてのスライドがうまく分離された、個々のスポットで、同一になります。 </li><li>マイクロアレイのサポートについては、我々はGAPS IIコートスライドを使用してください。 </li><li> miRNAのプローブでは、nCodeの複数種のマイクロアレイプローブがV2に設定miRNAを使用してください。 </li><li> 10μMで、3 × SSC内のすべてのオリゴヌクレオチドを​​溶解し、四重にスライド上に印刷してください。 GAAPS IIスライドの指示に従って紫外線を照射して、スライドを固定。印刷されたプローブによるエリアとサイドをマークするためにダイヤモンドペンでスライドにラベルを付けます。 22℃で保存する</li></ol> 2。サンプルの準備<ol><li>任意のメソッドまたは試薬は、限り、それは、small RNAを保持するように、RNAを単離するために使用することができます。我々は一般的に260nmのと280nmの測定値が測定される、RNA調製物の十分な量と質で、トータルRNAを抽出するためにトリゾール（Invitrogen）を使用してください。 </li><li> RNAラベリング、5&#39; - PCU - DY547 - 3の0.5μgのトータルRNAのミックス〜25μgの1&#39;で6 ×緩衝液（50mMのHEPES、pH7.8の20 mMのMgCl 2、10μg/ mlのBSA、10％ DMSO）〜10 mMのDTTとATP用10 × T4 RNAリガーゼ1バッファの〜0.02から0.03最終容量を補充〜20単位のT4 RNAリガーゼ1を、含んでいる。 </li><li> 2〜24時間、冷蔵庫内の氷の上で進めてラベリングできるように。 0.3 M酢酸ナトリウムとエタノールの3つのボリュームを持つRNAを沈殿させる。効率的なライゲーションと降水量の場合は、上の2 mg / mlのでトータルRNAを溶解し、〜20μlので合計ライゲーションのボリュームを維持する。 <ol><li>少ないRNAが使用可能な場合は、入力RNAおよび5&#39; - PCU - DY547 - 3の量は、&quot;スケールダウンすることができます。&lt;/ LI&gt; <li> RNAは非常に希釈されている場合は、降水を支援するために、酵母のtRNAなどの担体を加える。 </li></ol></li><li> UlysisのAlexa Fluor ®ハイブリダイゼーションプロセスの制御として647核酸ラベリングキット6を用いて哺乳動物のmiRNAのサブセットに対応する基準DNAオリゴヌクレオチドの合計1μgのに組み合わせるとラベル。 CentriSepカラムを用いて標識DNAを精製し、-20℃で暗所で保存</li></ol> 3。マイクロアレイハイブリダイゼーション<ol><li>初めてのスライドを使用するには、3 × SSC、0.1％SDS、37℃で30〜60分間、0.2％BSA℃のフィルタリングソリューションでプレハイブリダイズスライド沈める水を数回で、その後、イソプロパノールでそれらを。 22℃5分間100gでスライドアダプタ℃で遠心分離機を用いてスライドを乾燥させる</li></ol>注：我々は、マイクロアレイのハイブリダイゼーションを行うためにコーニングマイクロアレイのハイブリダイゼーションチャンバーとLifterslipsのエリーサイエンティフィック社のmSeriesを使用する。 <ol start="2"><li> liをリンス空気中で乾燥前に水でfterslips、そ​​の後エタノールで、。マイクロアレイのハイブリダイゼーションチャンバーの基地内のスライド、そしてスライドの上にlifterslipを置きます。 lifterslipは、スライドに接触すると白いストリップで、プローブの領域をカバーします。 </li><li>暗闇の中で、、標識RNAを沈殿をスピンダウン。 70％エタノールで1回それを洗って、そして空気がペレットを乾燥させます。ペレットは、赤でなければなりません。 </li><li> 400mMののNa 2 HPO 4 pH 7.0の、0.8％BSA、5％SDS、精製の​​1/15-1/100μlの12％ホルムアミド6、RNAサンプルごとに標識された参照DNA（2.4）を含むハイブリダイゼーション溶液を準備します。追加された参照DNAの量が異なるオリゴヌクレオチドを​​標識しているかによって異なってきます（2.4）。 100以上存在する場合は、以下の希釈が必要です。 </li><li>ハイブリダイゼーション溶液の約60μlを加えRNAペレットを溶解する。 </li><li>コー​​ニングマイクロアレイのハイブリダイゼーションチャンバーベースの加湿各ウェルに水20μlを添加する。 </li><li> tを追加彼のスライドに標識されたRNAとリファレンスのDNAの混合物。細いピペットチップを使用して、そっとlifterslipの端に触れ、そして解決策は、吸引によってlifterslipとスライドの間にスペースを入力することができます。 </li><li>ベース上でハイブリダイゼーションチャンバーカバーを取り付け、その後、金属製のクリップでチャンバーを密閉する。 </li><li>コー​​ニングからチャンバーのカセットに付属のビニール袋の内側全体チャンバーを置く。 </li><li>接液ペーパータオルを容器の内側チャンバーカセット（s）を置き、ラップで容器を覆い、約24時間、37℃で湿度の高い、細胞培養インキュベーター内に配置。これらの予防措置（3.6、3.9、3.10）ハイブリダイゼーション溶液は、インキュベーション中に乾燥しないようにしてください。 </li></ol> 4。ポストハイブリダイゼーション処理<ol><li>チャンバーカセット一つ一つを分解。 22で2 × SSCに浸し、スライドとそのlifterslip℃のlifterslipは自然にスライドして減少していきます。 0.8 × SSCに入れてください。洗う二回、その後、0.8 × SSC中でスライドを0.4 × SSC、合計で1〜2分で三回。スライドアダプター付き遠心機を使用してスライドを乾燥させる。水でlifterslipsを洗って、後で再利用のために保存。 </li><li>任意の適切なスキャナ、例えば、パーキンエルマーScanArray 5000またはMolecular Devices社軸索GenePix 4000Bマイクロアレイスキャナーを使用してスライドをスキャンします。対応する画像ファイルを取得するために近い547 nmと647 nmの波長でスキャンする。 </li><li>入力、4.2からイメージファイル）内のピクセル強度を定量化するなどBlueFuseなどのプログラムを使用してください。今後の検討からマイクロアレイ上の異常な箇所を除外するためのプログラムと個々のスポットを点検。これらの異常なスポットは、通常、ハイブリダイゼーション後の取り扱い不良スライドの印刷またはスライドから生じる。 </li><li>データ分析とプレゼンテーションのためのそのようなジーンスプリングやExcelなどのプログラムを使用してください。マイクロアレイデータの正規化のための一般的な考慮事項は、このホワイトペーパーの範囲を超えている、適用する。 </li><li>十分な信号がAFを取得するとTER 4.3）、再利用7マイクロアレイスライドを取り除く。 10-20分間、62℃染色皿に予め温めておいた、1 mMのNaOHおよび0.1 × SSC ° Cにして浸漬、水にスライドをすすぎます。一度インキュベーションを繰り返します。 22℃まで穏やかに振盪しながら60分間、水で数回スライド℃を洗う遠心分離機を使用してスライド、および22℃で保存して乾燥させる</li><li>再生されたスライドを使用するには、それは再びそれらを事前にハイブリダイズさせる必要はありません。単にイソプロパノールに続いて水で洗って、右ハイブリダイゼーション前にスライドを乾燥させる。 </li></ol> 5。代表的な結果： 我々は主に、すなわち、数千のサンプルでグローバルなmiRNA発現をプロファイルするために多くの異なる条件の下でゼブラフィッシュからヒト試料に単離されたRNAを説明する手順に従っている。 図1に非常に正確で強力なハイブリダイゼーションシグナルを示すために、マイクロアレイのスキャンした画像を示していますスライド。ピアソンcorrelati技術は、マイクロアレイのハイブリダイゼーションの複製との間の係数に優れた再現性を示す、〜0.99 7です。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3250/3250fig1.jpg" /> ハイブリダイゼーション後のスキャンされたmiRNAのマイクロアレイのスライドの1コンポジット画像を図 。黄色の斑点が同じプローブにDNAとRNAの両方でのハイブリダイゼーションからいる間に赤い斑点は、リファレンスのDNA、DY547標識RNAサンプルからの緑のスポットでハイブリダイゼーションに起因する。

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	<li>Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functions+of+animal+microRNAs.">The functions of animal microRNAs.</a> Nature. 431, 350-355 (2004).</li><li>Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs.">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19, 92-105 (2009).</li><li>Chekulaeva, M., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+miRNA-mediated+post-transcriptional+regulation+in+animal+cells.">Mechanisms of miRNA-mediated post-transcriptional regulation in animal cells.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 21, 452-460 (2009).</li><li>Farazi, T. A., Spitzer, J. I., Morozov, P., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNAs+in+human+cancer.">miRNAs in human cancer.</a> J. Pathol. 223, 102-115 (2011).</li><li>Small, E. M., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pervasive+roles+of+microRNAs+in+cardiovascular+biology.">Pervasive roles of microRNAs in cardiovascular biology.</a> Nature. 469, 336-342 (2011).</li><li>Thomson, J. M., Parker, J., Perou, C. M., Hammond, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+custom+microarray+platform+for+analysis+of+microRNA+gene+expression.">A custom microarray platform for analysis of microRNA gene expression.</a> Nat. Methods. 1, 47-53 (2004).</li><li>Zhang, X., Xu, W., Tan, J., Zeng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stripping+custom+microRNA+microarrays+and+the+lessons+learned+about+probe:slide+interactions.">Stripping custom microRNA microarrays and the lessons learned about probe:slide interactions.</a> Anal. Biochem. 386, 222-227 (2009).</li><li>Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+tools+for+microRNA+genomics.">miRBase: tools for microRNA genomics.</a> Nucl. Acids. Res. 36, D154-D158 (2008).</li><li>Landgraf, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mammalian+microRNA+expression+atlas+based+on+small+RNA+library+sequencing.">A mammalian microRNA expression atlas based on small RNA library sequencing.</a> Cell. 129, 1401-1414 (2007).</li><li>Chiang, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+microRNAs:+experimental+evaluation+of+novel+and+previously+annotated+genes.">Mammalian microRNAs: experimental evaluation of novel and previously annotated genes.</a> Genes. Dev. 24, 992-1009 (2010).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

深いシーケンシング技術の最近の進歩にもかかわらず、マイクロアレイは、DNAとRNAのハイスループット分析のための実行可能な選択肢です。ディープシーケンシングに比べて、マイクロアレイ実験には安上がりだし、典型的な分子生物学の研究室では、柔軟性を可能にすると時間の節約、社内での実験とデータ分析のほとんどを実行できます。将来的には、マイクロアレイの可能性は適して?...

<table border="1"><tbody><tr><th>アイテム</th><th>ベンダ</th><th>カタログ番号</th><th>コメント</th></tr><tr><td>マイクロアレイプローブセットV2をmiRNAの複数種をnCodeの</td><td>インビトロジェン</td><td> MIRMPS201 </td><td> miRBaseリリース9.0（2006年10月）に基づいて設計されています。それは、〜1140変更されていない、ワーム、ハエ、ゼブラフィッシュ、マウス、ラット、及びヒトmiRNAのプローブとして、34〜44 ntの長いオリゴヌクレオチド、およびそのようなsnoRNAsのような内部統制のプローブの数が含まれています。 miRNAのプローブは、それ故に成熟miRNAに相補的な配列、〜44ヌクレオチドのサイズのダブレットです。分析のために一つは関心のある特定のゲノム（s）からのmiRNAに焦点を当てることができます。 </td></tr><tr><td>トリゾール</td><td>インビトロジェン</td><td> 15596018 </td><td>トータルRNAサンプルは、このようなmRNAの解析のようなダウンストリームアプリケーションのための迅速かつ容易に準備すると、定量化し、適しているものの、我々はまた、標識のための豊かな、small RNA画分を使用している。 </td></tr><tr><td> T4 RNAリガーゼ1 </td><td>ニューイングランドBiolABS </td><td> M0204L </td><td></td></tr><tr><td> UlysisのAlexa Fluor ® 647核酸標識キット</td><td>インビトロジェン</td><td> U21660 </td><td>このキットまたは類似の製品も同様に実験的なRNAサンプルやコントロールRNAを（代わりに、コントロールDNAの）ラベルを付けるために使用することができます。 </td></tr><tr><td> 5&#39; - PCU - DY547 - 3&#39; </td><td> Dharmacon </td><td>カスタムは行わ</td><td> small RNAの画分を同様に連結することにより標識することができる。 </td></tr><tr><td> CentriSep列</td><td>プリンストンセパレーション</td><td> CS - 901 </td><td></td></tr><tr><td> GAPSIIコートスライド</td><td>コー​​ニング</td><td> 40004 </td><td>スライドの他のタイプも使用されることがあります。 </td></tr><tr><td>マイクロアレイハイブリダイゼーションチャンバー</td><td>コー​​ニング</td><td> 2551または40080 </td><td>ハイブリダイゼーションチャンバーとカバースリップの他の種類も動作するはずです。市販のハイブリダイゼーションのマシンを使用すると、約2時間、、大幅に例えばハイブリダイゼーションの時間を短縮することができます。 </td></tr><tr><td> Lifterslips </td><td>目ermo /エリー科学</td><td> 25X60I - M5439 - 001 - LS </td><td></td></tr><tr><td> BlueFuse </td><td> BlueGenome </td><td></td><td></td></tr><tr><td>ジーンスプリング</td><td>アジレント</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

performing custom microrna microarray experiments

マイクロRNA（miRNA）は、広く真核生物1で表されている〜22ヌクレオチド（nt）長いRNA分子の大家族です。複雑なゲノムは主に転写後に標的遺伝子の膨大な数の2、3の発現を阻害するmiRNAは、の少なくとも数百人をエンコードする。 miRNAは生物学的プロセス1の広い範囲を制御します。さらに、変更されたmiRNAの発現は、癌などのヒトの疾患と関連している、とmiRNAは病気と予後4、5のためのバイオマーカーとして機能することができる。それは多くの異なる条件下での発現とmiRNAの機能を理解することが重要です。 リアルタイムPCR、マイクロアレイ、およびディープシーケンシング：三つの主要なアプローチは、プロファイルのmiRNAの発現に用いられてきた。 miRNAのマイクロアレイの技術は、一般的に安価、高スループットという利点があり、実験と解析の手順のほとんどは、カーすることができますほとんどの大学、医学校および関連病院での分子生物学の実験室でIED。ここでは、カスタムのmiRNAマイクロアレイ実験を行う方法を説明します。 miRNAのプローブセットは、miRNAのマイクロアレイを製造するガラススライド上に印刷されます。 RNAは、小さなRNA種を保存する方法または試薬を用いて単離し、そしてその後、蛍光色素で標識されている。コントロールとして、miRNAのサブセットに対応する基準DNAオリゴヌクレオチドはまた、異なる蛍光色素で標識されています。リファレンスDNAは、スライドとハイブリダイゼーションの品質を実証するのに役立つだろうし、また、データの正規化のために使用されます。 RNAとDNAを混合し、データベースにおけるmiRNAのほとんどのプローブを含むマイクロアレイスライドにハイブリダイズさせる。洗浄後、スライド、画像、および定量化の個々のスポットの強度を得るためにスキャンされます。これらの生信号をさらに処理し、対応するmiRNAの発現データとして解析されます。 Microarrayのスライドは、マイクロアレイのコストを削減し、マイクロアレイ実験の一貫性を高めるために除去し、再生成することができます。同じ原理と手順は、カスタムマイクロアレイ実験の他のタイプに適用可能である。

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Performing Custom MicroRNA Microarray Experiments

カスタムmicroRNAのマイクロアレイの実験を行うの簡単な手順が説明されています。手順は、ハイブリダイゼーションシグナルを定量化し、分析、マイクロアレイのスキャン、マイクロアレイにサンプルをハイブリダイズ、RNA、標識RNAとリファレンスのDNAを単離することがあります。

カスタムmicroRNAのマイクロアレイの実験を行う

microRNAs (miRNAs) are a large family of &tilde; 22 nucleotides (nt) long RNA molecules that are widely expressed in eukaryotes 1.  Complex genomes encode ...

performing-custom-microrna-microarray-experiments

Research

JoVE Journal

Biology

19.4K ビュー.  University of Minnesota. カスタムmicroRNAのマイクロアレイの実験を行うの簡単な手順が説明されています。手順は、ハイブリダイゼーションシグナルを定量化し、分析、マイクロアレイのスキャン、マイクロアレイにサンプルをハイブリダイズ、RNA、標識RNAとリファレンスのDNAを単離することがあります。

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Gibberella zeae Ascospore Production and Collection for Microarray Experiments.

Fusarium graminearum Schwabe (teleomorph Gibberella zeae) is a plant pathogen causing scab disease on wheat and barley that reduces crop yield and grain quality. F. graminearum also causes stalk and ear rots of maize and is a producer of mycotoxins such as the trichothecenes that contaminate grain and are harmful to humans and livestock (Goswami and Kistler, 2004).

The fungus produces two types of spores. Ascospores, the propagules resulting from sexual reproduction, are the main source of primary infection.  These spores are forcibly discharged from mature perithecia and dispersed by wind (Francl et al 1999). Secondary infections are mainly caused by macroconidia which are produced by asexual means on the plant surface. To study the developmental processes of ascospores in this fungus, a procedure for their collection in large quantity under sterile conditions was required. Our protocol was filmed in order to generate the highest level of information for understanding and reproducibility; crucial aspects when full genome gene expression profiles are generated and interpreted. In particular, the variability of ascospore germination and biological activity are dependent on the prior manipulation of the material. The use of video for documenting every step in ascospore production is proposed in order to increase standardization, complying with the increasingly stringent requirements for microarray analysis. The procedure requires only standard laboratory equipment. Steps are shown to prevent contamination and favor time synchronization of ascospores.

To study the developmental processes of ascospores in Gibberella zeae, a procedure for collection under sterile conditions is filmed in order to generate the highest level of information for protocol description. This should facilitate the reproducibility of the experiment, a crucial aspect when full genome expression profile tests are implemented.

マイクロアレイ実験のためのジベレラzeae子嚢胞子の生産とコレクション。

Fusarium graminearum Schwabe (teleomorph Gibberella zeae) is a plant pathogen causing scab disease on wheat and barley that reduces crop yield and grain ...

生物学

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can be used for many different studies, such as the characterization of membrane-active peptides, the reconstitution of ion channels or investigations on how changes in lipid bilayer properties alter the function of bilayer-spanning channels.  Here, we show how to form a planar bilayer and how to isolate small patches from the bilayer, and in a second video  will also demonstrate a procedure for using gramicidin channels to determine changes in lipid bilayer elastic properties.   We also demonstrate the individual steps needed to prepare the bilayer chamber, the electrodes and how to test that the bilayer is suitable for single-channel measurements.

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. Here, we demonstrate the individual steps needed to prepare the bilayer chamber, the electrodes and how to test that the bilayer is suitable for single-channel measurements.

電気生理学的実験のための人工二重層の準備

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can ...

Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

PtGen2 is a 26,496 feature cDNA microarray containing amplified loblolly pine ESTs. The array is produced in our laboratory for use by researchers studying gene expression in pine and other conifer species. PtGen2 was developed as a result of our gene discovery efforts in loblolly pine, and is comprised of sequences identified primarily from root tissues, but also from needle and stem.1,2 PtGen2 has been tested by hybridizing different Cy-dye labeled conifer target cDNAs, using both amplified and non-amplified indirect labeling methods, and also tested with a number of hybridization and washing conditions. This video focuses on the handling and processing of slides before and after pre-hybridization, as well as after hybridization, using some modifications to procedures developed previously.3,4 Also included, in text form only, are the protocols used for the generation, labeling and clean up of target cDNA s, as well as information on software used for downstream data processing. 
PtGen2 is printed with a proprietary print buffer that contains high concentrations of salt that can be difficult to remove completely. The slides are washed first in a warm SDS solution prior to pre-hybridization. After pre-hybridization, the slides are washed vigorously in several changes of water to complete removal of remaining salts. LifterSlips&trade; are then cleaned and positioned on the slides and labeled cDNA is carefully loaded onto the microarray by way of capillary action which provides for even distribution of the sample across the slide, and reduces the chance of bubble incorporation. Hybridization of targets to the array is done at 48&deg;C in high humidity conditions. After hybridization, a series of standard washes are done at 53&deg;C and room temperature for extended times. Processing PtGen2 slides using this technique reduces salt and SDS-derived artifacts often seen when the array is processed less rigorously. Hybridizing targets derived from several different conifer RNA sources, this processing protocol yielded fewer artifacts, reduced background, and provided better consistency among different experimental groups of arrays.

The cDNA microarray PtGen2 was developed for gene expression studies in loblolly pine, P. taeda, and other conifer species. Here, we show pre- and post-hybridization handling and washing techniques that can be used with this array to yield better consistency, reduced artifacts, and lower backgrounds.

ロボロリーパインPtGen2 cDNAマイクロアレイの処理

PtGen2 is a 26,496 feature cDNA microarray containing amplified loblolly pine ESTs.  The array is produced in our laboratory for use by researchers ...

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray technology is used in numerous biological disciplines in a variety of applications including global gene expression analysis in relation to developmental stage, to a disease state, and in toxic responses. Herein, we include a demonstration of global gene expression analysis using a comprehensive zebrafish-specific oligonucleotide microarray platform. The zebrafish expression microarray platform contains 385,000 probes, 60 base pairs in length, interrogating 37,157 targets with up to 12 probes per target. For this platform, all cDNA and genomic information available for the zebrafish was collected from various genomic databases including Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (http://genome.ucsc.edu), and ZFIN (http://www.zfin.org). As a result this expression array provides complete coverage of the current zebrafish transcriptome. The zebrafish expression microarray was printed by Roche NimbleGen (Madison, WI). This technical demonstration includes the fluorescent labeling of a cDNA product, hybridization of the labeled cDNA product to the microarray platform, and array scanning for signal acquisition using the one color analysis strategy.  

Gene microarrays are powerful tools in gene expression profiling at a genome-wide level. This technology has application in a variety of biological disciplines including developmental biology and toxicology. In this video, we detail a protocol for global gene expression analysis using a comprehensive oligonucleotide microarray platform for the zebrafish.

ゼブラフィッシュオリゴヌクレオチドのマイクロアレイプラットフォームを使用してグローバルな遺伝子発現解析

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

マイクロアレイ解析のためのサッカロマイセスセレビシエ</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such as chemical-based mutagenesis or random integration of DNA sequences confer indiscriminate genetic changes in an overall inefficient manner and require incorporation of undesirable synthetic sequences or use of aberrant culture conditions, potentially confusing biological study. By contrast, transient ZFN expression in a cell can facilitate precise, heritable gene editing in a highly efficient manner without the need for administration of chemicals or integration of synthetic transgenes.
Zinc finger nucleases (ZFNs) are enzymes which bind and cut distinct sequences of double-stranded DNA (dsDNA). A functional CompoZr ZFN unit consists of two individual monomeric proteins that bind a DNA "half-site" of approximately 15-18 nucleotides (see Figure 1). When two ZFN monomers "home" to their adjacent target sites the DNA-cleavage domains dimerize and create a double-strand break (DSB) in the DNA.1 Introduction of ZFN-mediated DSBs in the genome lays a foundation for highly efficient genome editing. Imperfect repair of DSBs in a cell via the non-homologous end-joining (NHEJ) DNA repair pathway can result in small insertions and deletions (indels). Creation of indels within the gene coding sequence of a cell can result in frameshift and subsequent functional knockout of a gene locus at high efficiency.2 While this protocol describes the use of ZFNs to create a gene knockout, integration of transgenes may also be conducted via homology-directed repair at the ZFN cut site.
The CompoZr Custom ZFN Service represents a systematic, comprehensive, and well-characterized approach to targeted gene editing for the scientific community with ZFN technology. Sigma scientists work closely with investigators to 1) perform due diligence analysis including analysis of relevant gene structure, biology, and model system pursuant to the project goals, 2) apply this knowledge to develop a sound targeting strategy, 3) then design, build, and functionally validate ZFNs for activity in a relevant cell line. The investigator receives positive control genomic DNA and primers, and ready-to-use ZFN reagents supplied in both plasmid DNA and in-vitro transcribed mRNA format. These reagents may then be delivered for transient expression in the investigator&#x2019;s cell line or cell type of choice. Samples are then tested for gene editing at the locus of interest by standard molecular biology techniques including PCR amplification, enzymatic digest, and electrophoresis. After positive signal for gene editing is detected in the initial population, cells are single-cell cloned and genotyped for identification of mutant clones/alleles.

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs

The CompoZr Custom Zinc-Finger Nuclease (ZFN) Service enables precise genome editing in any organism or cell line at any locus defined by the user. This article describes the process for the design, manufacture, validation and implementation of the CompoZr Custom ZFN Service.

CompoZrカスタムジンクフィンガーヌクレアーゼによるゲノム編集（ZFNs）

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such ...

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA probes. This protocol, originally developed by Kloosterman and colleagues for broad use with Exiqon miRNA probes1, has been modified to overcome challenges inherent in miRNA analysis in kidney tissues. These include issues such as structure identification and hard to remove residual probe and antibody. Use of relatively thin, 5 mm thick, tissue sections allowed for clear visualization of kidney structures, while a strong probe signal was retained in cells. Additionally, probe concentration and incubation conditions were optimized to facilitate visualization of microRNA expression with low background and nonspecific signal. Here, the optimized protocol is described, covering the initial tissue collection and preparation through the mounting of slides at the end of the procedure. The basic components of this protocol can be altered for application to other tissues and cell culture models.

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

This article describes an in situ hybridization protocol optimized for colormetric detection of microRNA expression in formalin fixed kidney sections.

マイクロRNA<em&gt;その場で</em&gt;ホルマリン固定腎臓組織のためのハイブリダイゼーション

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

In Vivo Nanovector Delivery of a Heart-specific MicroRNA-sponge

MicroRNA (miRNA) is small non-coding RNA which inhibits post-transcriptional messenger RNA (mRNA) expression. Human diseases, such as cancer and cardiovascular disease, have been shown to activate tissue and/or cell-specific miRNA expression associated with disease progression. The inhibition of miRNA expression offers the potential for a therapeutic intervention. However, traditional approaches to inhibit miRNAs, employing antagomir oligonucleotides, affect specific miRNA functions upon global delivery. Herein, we present a protocol for the in vivo cardio-specific inhibition of the miR-181 family in a rat model. A miRNA-sponge construct is designed to include 10 repeated anti-miR-181 binding sequences. The cardio-specific &#945;-MHC promoter is cloned into the pEGFP backbone to drive the cardio-specific miR-181 miRNA-sponge expression. To create a stable cell line expressing the miR-181-sponge, myoblast H9c2 cells are transfected with the &#945;-MHC-EGFP-miR-181-sponge construct and sorted by fluorescence-activated cell sorting (FACs) into GFP positive H9c2 cells which are cultured with neomycin (G418). Following stable growth in neomycin, monoclonal cell populations are established by additional FACs and single cell cloning. The resulting myoblast H9c2-miR-181-sponge-GFP cells exhibit a loss of function of miR-181 family members as assessed through the increased expression of miR-181 target proteins and compared to H9c2 cells expressing a scramble non-functional sponge. In addition, we develop a nanovector for the systemic delivery of the miR-181-sponge construct by complexing positively charged liposomal nanoparticles and negatively charged miR-181-sponge plasmids. In vivo imaging of GFP reveals that multiple tail vein injections of a nanovector over a three-week period are able to promote a significant expression of the miR-181-sponge in a cardio-specific manner. Importantly, a loss of miR-181 function is observed in the heart tissue but not in the kidney or the liver. The miRNA-sponge is a powerful method to inhibit tissue-specific miRNA expression. Driving the miRNA-sponge expression from a tissue-specific promoter provides specificity for the miRNA inhibition, which can be confined to a targeted organ or tissue. Furthermore, combining nanovector and miRNA-sponge technologies permits an effective delivery and tissue-specific miRNA inhibition in vivo.

In Vivo Nanovector Delivery of a Heart-specific MicroRNA-sponge

Tissue-specific microRNA inhibition is a technology that is underdeveloped in the microRNA field. Herein, we describe a protocol to successfully inhibit the miR-181 microRNA family in myoblast cells from the heart. Nanovector technology is used to deliver a microRNA sponge that demonstrates significant in vivo cardio-specific miR-181 family inhibition.

生体内で心臓特定のマイクロ Rna スポンジの Nanovector 配信

MicroRNA (miRNA) is small non-coding RNA which inhibits post-transcriptional messenger RNA (mRNA) expression. Human diseases, such as cancer and ...

CRISPR Gene Editing Tool for MicroRNA Cluster Network Analysis

MicroRNAs (miRNAs) have emerged as important cellular regulators (tumor suppressors, pro-oncogenic factors) of cancer and metastasis. Most published studies focus on a single miRNA when characterizing the role of small RNAs in cancer. However, ~30%&#160;of human miRNA genes are organized in clustered units that are often co-expressed, indicating a complex and coordinated system of noncoding RNA regulation. A clearer understating of how clustered miRNA networks function cooperatively to regulate tumor growth, cancer aggressiveness, and drug resistance is required before translating noncoding small RNAs to the clinic.
The use of a high-throughput clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-mediated gene editing procedure has been employed to study the oncogenic role of a genomic cluster of seven miRNA genes located within a locus spanning ~35,000 bp in length in the context of prostate cancer. For this approach, human cancer cell lines were infected with a lentivirus vector for doxycycline (DOX)-inducible Cas9 nuclease grown in DOX-containing medium for 48 h. The cells were subsequently co-transfected with synthetic trans-activating CRISPR RNA (tracrRNA) complexed with genomic site-specific CRISPR RNA (crRNA) oligonucleotides to allow the rapid generation of cancer cell lines carrying the entire miRNA cluster deletion and individual or combination miRNA gene cluster deletions within a single experiment.
The advantages of this high-throughput gene editing system are the ability to avoid time-consuming DNA vector subcloning, the flexibility in transfecting cells with unique guide RNA combinations in a 24-well format, and the lower-cost PCR genotyping using crude cell lysates. Studies using this streamlined approach promise to uncover functional redundancies and synergistic/antagonistic interactions between miRNA cluster members, which will aid in characterizing the complex small noncoding RNA networks involved in human disease and better inform future therapeutic design.

This protocol describes a high-throughput clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) gene editing workflow for microRNA cluster network analysis that allows the rapid generation of a panel of genetically modified cell lines carrying unique miRNA cluster member deletion combinations as large as 35 kb within a single experiment.

マイクロRNAクラスターネットワーク解析のためのCRISPR遺伝子編集ツール

MicroRNAs (miRNAs) have emerged as important cellular regulators (tumor suppressors, pro-oncogenic factors) of cancer and metastasis. Most published ...

マイクロアレイポリマープロファイリングによる糖鎖の構造と出現性の解明

Microarray Polymer Profiling (MAPP) for High-Throughput Glycan Analysis

Microarray polymer profiling (MAPP) is a robust and reproducible approach to systematically determine the composition and relative abundance of glycans and glycoconjugates within a variety of biological samples, including plant and algal tissues, food materials, and human, animal, and microbial samples. Microarray technology underpins the efficacy of this method by providing a miniaturized, high-throughput screening platform, allowing thousands of interactions between glycans and highly specific glycan-directed molecular probes to be characterized concomitantly, using only small amounts of analytes. Constituent glycans are chemically and enzymatically fractionated, before being sequentially extracted from the sample and directly immobilized onto nitrocellulose membranes. The glycan composition is determined by the attachment of specific glycan-recognizing molecular probes to the extorted and printed molecules. MAPP is complementary to conventional glycan analysis techniques, such as monosaccharide and linkage analysis and mass spectrometry. However, glycan-recognizing molecular probes provide insight into the structural configurations of glycans, which can aid in elucidating biological interactions and functional roles.

著者スポットライト: MAPP Protocol – Advancing Glycan Analysis 

Microarray polymer profiling (MAPP) is a high-throughput technique for compositional analysis of glycans in biological samples.

ハイスループット糖鎖分析のためのマイクロアレイポリマープロファイリング(MAPP)

Microarray polymer profiling (MAPP) is a robust and reproducible approach to systematically determine the composition and relative abundance of glycans ...

Methods Article

カスタムmicroRNAのマイクロアレイの実験を行う