注：無菌培養条件を維持するためには、このプロトコルの手順のすべては、無菌室の安全基準を用いて実施し、層流フードの下に行われている。 開始する前に、すべてのメディアは℃、適切にガス処刑37に平衡であることを確認してください。 Geltrexコーティングした培養皿の準備注意：CELLstartコート培養皿を使用するための付録を参照してください<ol><li> 2〜8雪解けGeltrexの一管（1mL）をゆっくり° CとノックアウトD-MEM/F-12の99 mLので1:100にそれを希釈する。穏やかに解決策を混ぜる。 注：一部のiPS細胞株は、最適な成長のための異なるGeltrexの希釈が必要な場合があります。代替希釈については、付録を参照してください。 </li><li> Geltrex溶液（35 - mmディッシュに1 mLを、60 mmディッシュでは1.5 mL）でそれぞれ培養皿の表面全体をカバーしています。 </li><li>乾燥を防ぎ、37℃で1時間のための皿をインキュベートするためにパラフィルムで各皿をシール℃に 注：最大1ヶ月間この時点では、4℃でGeltrexコーティングした培養皿が格納されることがあります。乾燥からGeltrexを防ぐためパラフィルムで各皿をシール。 </li><li>使用する前に、層流フードへGeltrex -コートディッシュを転送し、それらが室温（約1時間）に平衡化することができます。 </li></ol>完全ノックアウトSRフィーダーを含まない培地を準備<ol><li> 10μg/ mLの基本的なFGFの溶液1 mLを準備するには、無菌的に以下のコンポーネントを混在させること。 -20℃で分注しソリューションと店舗までの6ヶ月間。 <table border="0"><tbody><tr><td>塩基性FGF </td><td> 10μgの</td></tr><tr><td> D - PBS </td><td> 990μL </td></tr><tr><td> 10％BSA </td><td> 10μL </td></tr></tbody></table> 注：BSAは、同じ濃度でHSAまたはノックアウトSRで置換することができます。 </li><li> 2 mg / mLのディスパーゼの溶液50mlを準備するには、無菌的に以下のコンポーネントを混在させること。 4の解と店舗℃で2週間までを滅菌フィルタします。 <table border="0"><tbody><tr><td>ディスパーゼ</td><td> 100mgの</td></tr><tr><td> D - PBS </td><td> 50 mLの</td></tr></tbody></table></li><li>完全なノックアウトSRフィーダーフリー（KSR - FF）培地は無菌的に以下の表に示すコンポーネントを組み合わせて100 mlを調製する。 <table border="1"><tbody><tr><td> コンポーネント </td><td> ストック濃度 </td><td> 最終濃度 </td><td> ボリューム </td></tr><tr><td>ノックアウトDMEM/F12（カタログ番号。12660〜012） </td><td> - </td><td> 1X </td><td> 76.8 mLの</td></tr><tr><td>グルタミン- I（製品番号35050〜061） </td><td> 200mMの</td><td> 2mMの</td><td> 1 mLの</td></tr><tr><td>ノックアウトSR（カタログ番号。10828〜028） </td><td> - </td><td> 20パーセント</td><td> 20 mLの</td></tr><tr><td>ノックアウトSR - GFC（カタログ番号。A10580 - 01） </td><td> 50X </td><td> 1X </td><td> 2 mLの</td></tr><tr><td> bFGFの（カタログ番号。PHG0024） </td><td> 10μg/ mLの</td><td> 20 ng / mLの</td><td> 200μL </td></tr></tbody></table>最大1週間までには2-8 ° CでKSR - FF媒体を格納することがあります。 </li><li>温度とガスに完全培地を事前に平衡化する直前に、無菌的に0.1mMの最終濃度は2 - メルカプトエタノールの必要量（55 mMストック濃度）を追加します。例えば、KSR - FFの培地100mlを準備することは2 - メルカプトエタノール（1:550希釈）あるいは55mmの182μLを追加、2 - メルカプトエタノールは、のために1X完了培地に添加し、2〜8℃で保存することができる最大1週間まで。 </li></ol> KSR - FFミディアムに性IPSCを適応<ol><li>起動する前に、フードの室温におGeltrexコートディッシュをあらかじめ平衡化します。 </li><li> MEFフィーダー細胞上の文化は性IPSC彼ら70〜80％コンフルエントになるまで。 MEFベースの文化のプロトコルのためGIBCOマウス胎児線維芽細胞のハンドブックを参照してください。 </LI&gt; <li> 37℃の水浴中でディスパーゼのプレ暖かい必要なボリューム。必要なボリュームの詳細については、下記の表1を参照してください。 </li><li> 37℃の水浴で15分間でKSR - FFの必要量を事前に平衡化します。必要なボリュームの詳細については、下記の表1を参照してください。 </li><li>培養皿から培地を吸引し、ディスパーゼソリューションの適切な量を追加します。 3〜5分間37℃で料理をインキュベートする。 </li><li>各培養容器からディスパーゼソリューションを吸引し、D - PBS（2〜3倍）で穏やかにMEFフィーダー細胞を洗い流してください。 </li><li>それぞれの培養容器に完全ノックアウトSR媒体の適切な量を追加。静かに培養容器の表面から細胞をこすり取る際には、セルスクレイパーまたは5 mLのピペットを使用してください。 注：iPS細胞ラインに適応するのは難しいため、代替適応プロトコルについては、付録Aを参照して、 </li><li>別の15 mLコニカルチューブに各培養皿から細胞懸濁液を収集する。完全なノックアウトSR媒体の適切な量と各培養容器をすすぎ、およびD - PBSで細胞懸濁液を含む15 mLコニカルチューブに培地をすすぎに追加します。単一の細胞に細胞塊を壊さないように注意が必要です</li><li>ペレット性IPSC〜5分間、200 xgで15 mLコニカルチューブを遠心する。 </li><li> IPSCペレットから上清を吸引除去する。スプリット比（表1）によるとKSR - FF媒体の適切な量のペレットを再懸濁する。小さな塊が表面にうまく接続していないので、小さいサイズにし、細胞塊を分割しないでください。 注：性IPSCはIPSC MEFの培養培地からKSR - FFの培地に直接継代された後、我々はまず、3継代のための1:2の分割比をお勧めします。通常は、1:3および1:5の間でスプリット比は適切ですが、1:2の継代は、フィーダーフリー文化に適応する際に必要な細胞の高密度を実現します。 </li><li> Geltrexコートディッシュ上性IPSCをめっきする前に、事前にコートしたディッシュから残留Geltrexソリューションを吸引し、ゆっくりと各培養皿に細胞懸濁液の適切な量を追加します。注：メッキの前に皿を洗っていない。 </li><li>皿の表面を横切って細胞を分散させるために側に数回に前後に培養皿を移動し、サイド。ゆっくりと空気中の4〜6％CO 2の加湿雰囲気下で37℃のインキュベーターで培養皿を置きます。 KSR - FFによる使用済み培地を毎日交換してください。 </li></ol> KSR - FFを用いてヒトiPS細胞を継代<ol start="13"><li>細胞は70〜80％コンフルエントと継代培養する準備ができていることを確認するために顕微鏡下で完全なKSR - FFに成長している人間性IPSCを守ってください。図1を参照してください。 注：コロニーがあまりにも密すぎたり大きくなり場合、増加分化が発生する。 </li><li>切り出しと文化を継代する前にあらゆる差別IPSCコロニーを削除します。 </li><li> 37℃の水浴中でディスパーゼのプレ暖かい必要なボリューム。必要なボリュームの詳細については、下記の表1を参照してください。 </li><li> 37℃の水浴で15分間でKSR - FFの必要量を事前に平衡化します。必要なボリュームの詳細については、下記の表1を参照してください。 </li><li>ピペットを用いて培養容器から使用済み培地を吸引し、そしてD - PBSで細胞を2回すすいでください。 </li><li>ゆっくりと培養容器（例えば、60 mmの培養皿あたりのディスパーゼ溶液1 mL）に予め温めておいたディスパーゼのソリューションを追加します。コー​​ト全体の細胞表面をにスワール培養容器を。 </li><li> 3分間37℃で培養容器をインキュベートする。 </li><li>インキュベーターから容器を削除、ディスパーゼソリューションを吸引し、そして穏やかに、D - PBSで細胞を洗浄する。 </li><li>優しくセルスクレイパーを用いて培養皿の表面から細胞をこすり、および滅菌15mlの遠心チューブに細胞を移す。 </li><li>静かに切り離されていない任意のセルを&quot;オフ噴霧&quot;、KSR - FFで二回培養皿をすすぎます。プールは、15mlのチューブで細胞と培地を洗い流してください。 </li><li>ペレットに室温で5分間、細胞を200 xgでチューブを遠心分離します。 </li><li>慎重に細胞ペレットを乱すことなく上清を吸引し、それを捨てる。 </li><li>ゆっくりと完全にチューブの底から細胞ペレットを取り除くために、チューブをフリック。 </li><li>静かに5mLの血清学的ピペットを用いて予め平衡KSR - FFで細胞を懸濁します。粉薬しないでください。注：それは静かに損傷を避けるために、力を使わずに細胞を再懸濁するステップで非常に重要です。 </li><li>目的のスプリット比で新鮮な60 mmのGeltrex -コートしたディッシュに細胞を移し、その表面を横切って細胞を分散させる側にし、サイド前後に数回の培養皿を移動する。 </li><li>の加湿雰囲気下で37℃のインキュベーターで培養皿を置きます4から6パーセントの空気中のCO 2。 </li><li>次の日、穏やかに細胞破片を除去するためにKSR - FFで使用済み培地を交換してください。その後毎日の使用済み培地を交換してください。 （およそ4-5日）、必要に応じてそれらを毎日通過iPS細胞を守ってください。継代は細胞が70-80％のコンフルエントに達したときに推奨されます。 iPS細胞の凍結保存および解凍の場合は、&quot;完全ノックアウト血清代替のフィーダーを含まない培地を用いてヒトiPS細胞のCryopreservingと回復&quot;という我々のプロトコルを参照してください。 </li></ol>予想される結果<img src="/files/ftp_upload/2236/2236fig1.jpg" alt="図1" /> 図1下の位相コントラスト画像は、完全にノックアウト血清代替のフィーダーフリー培地を使用してGeltrexコーティングした培養皿上に成長性IPSCを示しています。性IPSCは、大規模な核とわずかな細胞質を特徴とヒトES細胞への形態似て示す。 （40倍拡大） <table border="1"><tbody><tr><td> コンポーネント </td><td> 35mmのディッシュ </td><td> 60ミリメートルディッシュ </td><td> 100mmディッシュ </td></tr><tr valign="top"><td>完全にノックアウトSR培地</td><td> 2 mLの</td><td> 4 mLの</td><td> 10mLの</td></tr><tr valign="top"><td> Geltrexソリューション</td><td> 1 mLの</td><td> 1.5 mLの</td><td> 4〜5 mLの</td></tr><tr valign="top"><td>ディスパーゼ</td><td> 0.5mLの</td><td> 1 mLの</td><td> 3〜4 mLの</td></tr><tr valign="top"><td>すすぎのためのD - PBS </td><td> 2 mLの</td><td> 4 mLの</td><td> 10mLの</td></tr></tbody></table> 表1。推奨されるボリューム <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2236/2236appendix.pdf">付録を見るにはここをクリックしてください</a> 。

<ol>
	<li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li><li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li><li>Maherali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+and+techniques+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 595-605 (2008).</li><li>Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+rat+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+combining+genetic+reprogramming+and+chemical+inhibitors.">Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors.</a> Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).</li><li>Liao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines+from+adult+rat+cells.">Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells.</a> Cell Stem Cell. 4, 11-15 (2009).</li><li>Dimos, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+patients+with+ALS+can+be+differentiated+into+motor+neurons.">Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons.</a> Science. 321, 1218-1221 (2008).</li><li>Aasen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes.">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnli. 26, 1276-1284 (2008).</li><li>Park, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of human-induced pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 3, 1180-1186 (2008).</li></ol>

この記事の著者は、この記事で使用した試薬と器具を生産Life Technologies社によって採用されています。

<table><tbody><tr><td>Knockout DMEM/F12</td><td></td><td>Cat. no. 12660-012</td><td>Note: see appendix for the use of alternative DMEM products</td></tr><tr><td>GlutaMAX-I</td><td></td><td>Cat. No. 35050-061</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td></td><td>KnockOut SR, Cat. no. 10828-028</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement Growth Factor Cocktail</td><td></td><td>KnockOut SR-GFC, Cat. no. A10580-01</td><td></td></tr><tr><td>FGF-basic, human recombinant protein, 10 &amp;mu;g</td><td></td><td>bFGF, Cat. no. PHG0024</td><td>Note: see appendix for alternative bFGF pack sizes.</td></tr><tr><td>2-Mercapt&amp;#8211;thanol</td><td></td><td>Cat. no. 21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td></td><td>Cat. no. 17105-041</td><td>Note: see appendix for alternative passaging methods.</td></tr><tr><td>Geltrex hESC-Qualified Reduced Growth Factor Basement Matrix, 1 mL</td><td></td><td>Cat. no. A10480-01</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) without calcium and magnesium </td><td></td><td>Cat. no. 14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Tissue Culture Hood</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator set at 37&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette-Aid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water Bath set at 37&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile serological pipettes (5 mL, 10 mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL centrifuge tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60mm Tissue Culture treated dishes</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

feeder-free adaptation, culture and passaging of human ips cells using complete knockout serum replacement feeder-free medium

ヒトとマウスの線維芽細胞は、胚性幹細胞に非常に似て資質と1月3日 iPS細胞を生成するために再プログラムできることを2006年の発見は、創薬、細胞治療、および基礎研究のための多能性細胞の貴重な新しいソースを作成しました。 GIBCOの培地および試薬は、年間の多能性幹細胞研究の最前線にされている。 DMEMはノックアウト血清代替物を添加したノックアウトは胚性幹細胞の成長と現在のiPS細胞培養3-9最適なメディアです。この金の標準的なメディアシステムは、現在、ノックアウトSRの成長因子のカクテルを追加してフィーダーを含まない培養に使用することができます。 従来のヒトESやiPS細胞の培養法はマウスやヒトの線維芽細胞フィーダー層の使用、またはフィーダ-馴化培地を必要とする。これらの培養法は、スケールにハード、労働集約的であり、それが原因で未定義の条件に未分化腰の細胞を維持することは困難である。インビトロジェンはまだノックアウトSRの使用を維持しながら、フィーダーフリーへの移行、お尻の細胞培養を容易にできるようにノックアウトSRの成長因子のカクテルを開発しました。

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Feeder-Free Adaptation, Culture and Passaging of Human IPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

以下のプロトコルは、完全なノックアウト血清代替のフィーダーフリー培地（KSR - FF）を使用して、フィーダーフリー文化に人間の人工多能性幹（iPS）細胞を適応させるための命令が用意されています。適応一度、継続的に維持するための手順も記載されています。

完全ノックアウト血清代替フィーダーを含まない培地を用いてヒトiPS細胞のフィーダーフリー適応、文化と継

The discovery in 2006 that human and mouse fibroblasts could be reprogrammed to generate iPS cells 1-3 with qualities remarkably similar to embryonic stem ...

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Research

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Biology

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ビデオ: Feeder-Free Adaptation, Culture and Passaging of Human IPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

Small-scale Propagation of Human iPSCs in Serum-free Conditions for Routine Immunocytochemical Characterization

There is great interest in utilizing human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) for disease modeling and cell therapeutics due to their patient specificity and characteristic stemness. However, the pluripotency of iPSCs, which is essential to their functionality, must be confirmed before these cells can be used in such applications. While a rigorous characterization of iPSCs, through different cellular and functional assays is necessary to establish their pluripotency, routine assessment of pluripotency maintenance can be achieved more simply and effectively through immunocytochemical techniques. Here, we present a systematic protocol for culturing hiPSCs, in a scaled-down manner, to particularly facilitate the verification of their pluripotent state using immunocytochemistry. More specifically, this methodology encompasses an efficient and cost-effective means of growing iPSCs in serum-free conditions and plating them on small chamber slides or glass coverslips ideal for immunocytochemistry.

Regular characterization of induced pluripotent stem cells (iPSCs), to ascertain maintenance of their pluripotent state, is an important step before these cells are used for other applications. Here we describe a method for the small-scale propagation of human iPSCs specifically designed to enable their easy and routine characterization via immunocytochemistry.

ルーチンの免疫細胞化学的特性評価のための無血清条件でのヒトiPS細胞の小規模伝播

There is great interest in utilizing human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) for disease modeling and cell therapeutics due to their patient ...

発生生物学

Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of human-induced pluripotent stem cells (iPSCs) is particularly attractive for neurodegenerative disease studies, including retinal dystrophies, where iPSC-derived retinal cell models mark a major step forward to understand and fight blindness. In this paper, we describe a simple and scalable protocol to generate, mature, and cryopreserve retinal organoids. Based on medium changing, the main advantage of this method is to avoid multiple and time-consuming steps commonly required in a guided differentiation of iPSCs. Mimicking the early phases of retinal development by successive changes of defined media on adherent human iPSC cultures, this protocol allows the simultaneous generation of self-forming neuroretinal structures and retinal pigmented epithelial (RPE) cells in a reproducible and efficient manner in 4 weeks. These structures containing retinal progenitor cells (RPCs) can be easily isolated for further maturation in a floating culture condition enabling the differentiation of RPCs into the seven retinal cell types present in the adult human retina. Additionally, we describe quick methods for the cryopreservation of retinal organoids and RPE cells for long-term storage. Combined together, the methods described here will be useful to produce and bank human iPSC-derived retinal cells or tissues for both basic and clinical research.

The production of specialized retinal cells from pluripotent stem cells is a turning point in the development of stem cell-based therapy for retinal diseases. The present paper describes a simple method for an efficient generation of retinal organoids and retinal pigmented epithelium for basic, translational, and clinical research.

Xeno 無料の定義された、人間の世代の iPSC 由来網膜細胞モデル フィーダー フリー培養条件

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

体節誘導体誘導される人間からの体外世代多能性幹細胞します。

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

ヒト多能性幹細胞からの神経堤前駆細胞のフィーダーフリー導出

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

神経科学

Cryopreserving and Recovering of Human iPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

The discovery in 2006 that human and mouse fibroblasts could be reprogrammed to generate iPS cells 1-3 with qualities remarkably similar to embryonic stem cells has created a valuable new source of pluripotent cells for drug discovery, cell therapy, and basic research.
GIBCO media and reagents have been at the forefront of pluripotent stem cell research for years. Knockout DMEM supplemented with Knockout Serum Replacement is the media of choice for embryonic stem cell growth and now iPS cell culture 3-9. This gold standard media system can now be used for feeder-free culture with the addition of Knockout SR Growth Factor Cocktail.
Traditional human ES and iPS cell culture methods require the use of mouse or human fibroblast feeder layers, or feeder-conditioned medium. These culture methods are labor-intensive, hard to scale and it is difficult to maintain hiPS cells undifferentiated due to the undefined conditions. Invitrogen has developed Knockout SR Growth Factor Cocktail to allow you to easily transition your hiPS and hES cell cultures to feeder-free while still maintaining your use of Knockout SR.

This protocol describes the detailed procedure for cryopreserving human iPS cells in KnockOut SR cryopreservation medium and recovering these cells in complete KnockOut SR Feeder Free (KSR-FF) medium or feeder-based KnockOut SR medium.

完全ノックアウト血清代替のフィーダーを含まない培地を用いてヒトiPS細胞のCryopreservingおよびリカバリ

生物学

自動培養システムによる多能性幹細胞分化の誘導

An Automated Culture System for Maintaining and Differentiating Human-Induced Pluripotent Stem Cells

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) with infinite self-proliferating ability have been expected to have applications in numerous fields, including the elucidation of rare disease pathologies, the development of new medicines, and regenerative medicine aiming to restore damaged organs. Despite this, the social implementation of hiPSCs is still limited. This is partly because of the difficulty of reproducing differentiation in culture, even with advanced knowledge and sophisticated technical skills, due to the high sensitivity of iPSCs to minute environmental changes. The application of an automated culture system can solve this issue. Experiments with high reproducibility independent of a researcher's skill can be expected according to a shared procedure across various institutes. Although several automated culture systems that can maintain iPSC cultures and induce differentiation have been developed previously, these systems are heavy, large, and costly because they make use of humanized, multi-articulated robotic arms. To improve on the above issues, we developed a new system using a simple x-y-z axis slide rail system, allowing it to be more compact, lighter, and cheaper. Furthermore, the user can easily modify parameters in the new system to develop new handling tasks. Once a task is established, all the user needs to do is prepare the iPSC, supply the reagents and consumables needed for the desired task in advance, select the task number, and specify the time. We confirmed that the system could maintain iPSCs in an undifferentiated state through several passages without feeder cells and differentiate into various cell types, including cardiomyocytes, hepatocytes, neural progenitors, and keratinocytes. The system will enable highly reproducible experiments across institutions without the need for skilled researchers and will facilitate the social implementation of hiPSCs in a wider range of research fields by diminishing the obstacles for new entries.

著者スポットライト:iPS細胞培養の自動化による再現性の向上 

Here, we present a protocol for an automated cell culture system. This automated culture system reduces labor and benefits the users, including researchers unfamiliar with handling induced pluripotent stem (iPS) cells, from the maintenance of iPS cells to differentiation into various types of cells.

ヒト人工多能性幹細胞の維持・分化のための自動培養システム

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) with infinite self-proliferating ability have been expected to have applications in numerous fields, ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it is not easy to establish an effective system for culturing these cells. Since the culture conditions can influence gene expression that confers pluripotency in hESCs and hiPSCs, the optimization and standardization of the culture method is crucial.
The establishment of hESC lines was first described by using MEFs as feeder cells and fetal bovine serum (FBS)-containing culture medium2. Next, FBS was replaced with knockout serum replacement (KSR) and FGF2, which enhances proliferation of hESCs3. Finally, feeder-free culture systems enable culturing cells on Matrigel-coated plates in KSR-containing conditioned medium (medium conditioned by MEFs)4. Subsequently, hESCs culture conditions have moved towards feeder-free culture in chemically defined conditions5-7. Moreover, to avoid the potential contamination by pathogens and animal proteins culture methods using xeno-free components have been established8.
To obtain improved conditions mouse feeder cells have been replaced with human cell lines (e.g. fetal muscle and skin cells9, adult skin cells10, foreskin fibroblasts11-12, amniotic mesenchymal cells13). However, the efficiency of maintaining undifferentiated hESCs using human foreskin fibroblast-derived feeder layers is not as high as that from mouse feeder cells due to the lower level of secretion of Activin A14. Obviously, there is an evident difference in growth factor production by mouse and human feeder cells.
Analyses of the transcriptomes of mouse and human feeder cells revealed significant differences between supportive and non-supportive cells. Exogenous FGF2 is crucial for maintaining self-renewal of hESCs and hiPSCs, and has been identified as a key factor regulating the expression of Tgf&beta;1, Activin A and Gremlin (a BMP antagonist) in feeder cells. Activin A has been shown to induce the expression of OCT4, SOX2, and NANOG in hESCs15-16.
For long-term culture, hESCs and hiPSCs can be grown on mitotically inactivated MEFs or under feeder-free conditions in MEF-CM (MEF-Conditioned Medium) on Matrigel-coated plates to maintain their undifferentiated state. Success of both culture conditions fully depends on the quality of the feeder cells, since they directly affect the growth of hESCs.
Here, we present an optimized method for the isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), preparation of conditioned medium (CM) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the levels of Activin A within the media.

The quality of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) is dictated by the right strain of mouse such as CF-1. Pluripotency-supportive MEFs and conditioned media (CM) obtained from these should contain optimal concentrations of Activin A, Gremlin and Tgf&beta;1 needed for the Activin/Nodal and FGF pathways to co-operatively maintain self-renewal and pluripotency.

培養ヒト胚および誘導多能性幹細胞に適したマウス胚性線維芽細胞の調製

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Rapid Fibroblast Removal from High Density Human Embryonic Stem Cell Cultures

Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) were used to establish human embryonic stem cells (hESCs) cultures after blastocyst isolation1. This feeder system maintains hESCs from undergoing spontaneous differentiation during cell expansion. However, this co-culture method is labor intensive, requires highly trained personnel, and yields low hESC purity4. Many laboratories have attempted to minimize the number of feeder cells in hESC cultures (i.e. incorporating matrix-coated dishes or other feeder cell types5-8). These modified culture systems have shown some promise, but have not supplanted the standard method for culturing hESCs with mitomycin C-treated mouse embyronic fibroblasts in order to retard unwanted spontaneous differentiation of the hESC cultures. Therefore, the feeder cells used in hESC expansion should be removed during differentiation experiments. Although several techniques are available for purifying the hESC colonies (FACS, MACS, or use of drug resistant vectors) from feeders, these techniques are labor intensive, costly and/or destructive to the hESC. The aim of this project was to invent a method of purification that enables the harvesting of a purer population of hESCs. We have observed that in a confluent hESC culture, the MEF population can be removed using a simple and rapid aspiration of the MEF sheet. This removal is dependent on several factors, including lateral cell-to-cell binding of MEFs that have a lower binding affinity to the styrene culture dish, and the ability of the stem cell colonies to push the fibroblasts outward during the generation of their own "niche". The hESC were then examined for SSEA-4, Oct3/4 and Tra 1-81 expression up to 10 days after MEF removal to ensure maintenance of pluripotency. Moreover, hESC colonies were able to continue growing from into larger formations after MEF removal, providing an additional level of hESC expansion.

Despite ongoing efforts to transition cultures to feeder-free conditions, the derivation and culture of human embryonic stem cells (hESC) remain largely dependent on co-cultures with mouse embryonic feeders (MEFs). Here, we show a novel methodology for rapidly removing feeders from hESC cultures prior to experimentation.

高密度ヒト胚性幹細胞の培養線維芽細胞からの迅速な除去

Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) were used to establish human embryonic stem cells (hESCs) cultures after blastocyst isolation1. This feeder system ...

完全ノックアウト血清代替フィーダーを含まない培地を用いてヒトiPS細胞のフィーダーフリー適応、文化と継

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ルーチンの免疫細胞化学的特性評価のための無血清条件でのヒトiPS細胞の小規模伝播

Xeno 無料の定義された、人間の世代の iPSC 由来網膜細胞モデルフィーダーフリー培養条件

体節誘導体誘導される人間からの体外世代多能性幹細胞します。

ヒト多能性幹細胞からの神経堤前駆細胞のフィーダーフリー導出

完全ノックアウト血清代替のフィーダーを含まない培地を用いてヒトiPS細胞のCryopreservingおよびリカバリ

ヒト人工多能性幹細胞の維持・分化のための自動培養システム

ヒト人工多能性幹細胞の維持・分化のための自動培養システム

ヒト人工多能性幹細胞の維持・分化のための自動培養システム

培養ヒト胚および誘導多能性幹細胞に適したマウス胚性線維芽細胞の調製

高密度ヒト胚性幹細胞の培養線維芽細胞からの迅速な除去

完全ノックアウト血清代替フィーダーを含まない培地を用いてヒトiPS細胞のフィーダーフリー適応、文化と継

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ルーチンの免疫細胞化学的特性評価のための無血清条件でのヒトiPS細胞の小規模伝播

Xeno 無料の定義された、人間の世代の iPSC 由来網膜細胞モデル フィーダー フリー培養条件

体節誘導体誘導される人間からの体外世代多能性幹細胞します。

ヒト多能性幹細胞からの神経堤前駆細胞のフィーダーフリー導出

完全ノックアウト血清代替のフィーダーを含まない培地を用いてヒトiPS細胞のCryopreservingおよびリカバリ

ヒト人工多能性幹細胞の維持・分化のための自動培養システム

ヒト人工多能性幹細胞の維持・分化のための自動培養システム

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培養ヒト胚および誘導多能性幹細胞に適したマウス胚性線維芽細胞の調製

高密度ヒト胚性幹細胞の培養線維芽細胞からの迅速な除去

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