注：無菌培養条件を維持するためには、このプロトコルの手順のすべては、無菌室の安全基準を用いて実施し、層流フードの下に行われている。 開始する前に、すべてのメディアは℃、適切にガス処刑37に平衡であることを確認してください。 Geltrexコーティングした培養皿の準備注：CELLstartコート培養皿を使用するための付録を参照してください。 <ol><li> 2〜8雪解けGeltrexの一管（1mL）をゆっくり° CとノックアウトD-MEM/F-12の99 mLので1:100にそれを希釈する。穏やかに解決策を混ぜる。 注：一部のiPS細胞株は、最適な成長のための異なるGeltrexの希釈が必要な場合があります。代替希釈については、付録を参照してください。 </li><li> Geltrex溶液（35 - mmディッシュに1 mLを、60 mmディッシュでは1.5 mL）でそれぞれ培養皿の表面全体をカバーしています。 </li><li>乾燥を防ぎ、37℃で1時間のための皿をインキュベートするためにパラフィルムで各皿をシール℃に 注：最大1ヶ月間この時点では、4℃でGeltrexコーティングした培養皿が格納されることがあります。乾燥からGeltrexを防ぐためパラフィルムで各皿をシール。 </li><li>使用する前に、層流フードへGeltrex -コートディッシュを転送し、それらが室温（約1時間）に平衡化することができます。 </li></ol>完全ノックアウトSRフィーダーを含まない培地を準備<ol><li> 10μg/ mLの基本的なFGFの溶液1 mLを準備するには、無菌的に以下のコンポーネントを混在させること。 -20℃で分注しソリューションと店舗までの6ヶ月間。 <table border="0"><tbody><tr><td>塩基性FGF </td><td> 10μgの</td></tr><tr><td> D - PBS </td><td> 990μL </td></tr><tr><td> 10％BSA </td><td> 10μL </td></tr></tbody></table> 注：BSAは、同じ濃度でHSAまたはノックアウトSRで置換することができます。 </li><li> 2 mg / mLのディスパーゼの溶液50mlを準備するには、無菌的に以下のコンポーネントを混在させること。 4の解と店舗℃で2週間までを滅菌フィルタします。 <table border="0"><tbody><tr><td>ディスパーゼ</td><td> 100mgの</td></tr><tr><td> D - PBS </td><td> 50 mLの</td></tr></tbody></table></li><li>完全なノックアウトSRフィーダーフリー（KSR - FF）100mLを準備するには無菌的に以下の表に記載されているコンポーネントを組み合わせる。 <table border="1"><tbody><tr><td> コンポーネント </td><td> ストック濃度 </td><td> 最終濃度 </td><td> ボリューム </td></tr><tr><td>ノックアウトDMEM/F12（カタログ番号。12660〜012） </td><td> - </td><td> 1X </td><td> 76.8 mLの</td></tr><tr><td>グルタミン- I（製品番号35050〜061） </td><td> 200mMの</td><td> 2mMの</td><td> 1 mLの</td></tr><tr><td>ノックアウトSR（カタログ番号。10828〜028） </td><td> - </td><td> 20パーセント</td><td> 20 mLの</td></tr><tr><td>ノックアウトSR - GFC（カタログ番号。A10580 - 01） </td><td> 50X </td><td> 1X </td><td> 2 mLの</td></tr><tr><td> bFGFの（カタログ番号。PHG0024）。 </td><td> 10μg/ mLの</td><td> 20 ng / mLの</td><td> 200μL </td></tr></tbody></table> 最大1週間までには2-8 ° CでKSR - FF媒体を格納することがあります。 </li><li>温度とガスに完全培地を事前に平衡化する直前に、無菌的に0.1mMの最終濃度は2 -メルカプトエタノールの必要量 （55 mMストック濃度）を追加します 。例えば、KSR - F 100mLを準備するFの培地は55 mM 2 - メルカプトエタノール（1:550希釈）182μLを加える代わりに、2 - メルカプトエタノールは、1X完了培地に添加し、2〜8℃で1週間までのCで保存することができます。 </li></ol>凍結/凍結保存培地の準備凍結保存培地は2つのメディアから構成され、彼らは別々のタイミングで細胞に添加され、分離されたままにしておく必要があります凍結培地及び凍結培地のB.。彼らは、それぞれの凍結保存媒体の総容積の50％が必要とされています。必要に応じて凍結保存媒体の総体積は、フリーズしたように各バイアルに1 mLです。ヒトES細胞の90％コンフルエント60ミリメートル皿は凍結保存媒体でヒトES細胞のバンク2バイアルに使用することができます。 超過を確実にするために付加的な2 - 5mLを使用して各凍結培地の十分なボリュームを準備します。 <table border="1"><tbody><tr><td>凍結培地（最終容量の50％）： </td><td> 50パーセントDMEM/F12 </td><td> 50％のKSR </td></tr><tr><td>凍結培地B（最終容量の50％）： </td><td> 80パーセントDMEM/F12 </td><td> 20％DMSO </td></tr></tbody></table>例： あなたが細胞の20バイアルを凍結している場合は、凍結保存培地の20mlのが必要になります。 24mL凍結保存培地の合計のために超過分を4mlのを追加。それはあなたが凍結培地（24mLの50％）および凍結培地Bの12mL（24mLの50％）の12mL必要があることを意味します。 <table border="1"><tbody><tr><td>凍結培地（12 mL）中： </td><td> 6 mLのDMEM/F12 </td><td> 6 mLのKSR </td></tr><tr><td>凍結培地B（12 mL）中： </td><td> 9.6 mLのDMEM/F12 </td><td> 2.4mLのDMSO </td></tr></tbody></table>凍結保存培地の最終組成は65％DMEM/F12、25％KSR、および10％DMSOである。 Cryopreserving性IPSC <ol><li> 37℃の水浴中でディスパーゼのプレ暖かい必要なボリューム。必要なボリュームの詳細については、下記の表1を参照してください。 </li><li> 37℃の水浴で15分間でKSR - FFの必要量を事前に平衡化します。必要なボリュームの詳細については、表の1belowを参照してください。 </li><li>ピペットを用いて培養容器から使用済み培地を吸引し、そしてD - PBSで細胞を2回すすいでください。 </li><li>ゆっくりと培養容器（例えば、60 mmの培養皿あたりのディスパーゼ溶液1 mL）に予め温めておいたディスパーゼのソリューションを追加します。コー​​ト全体の細胞表面をにスワール培養容器を。 </li><li> 3分間37℃で培養容器をインキュベートする。 </li><li>インキュベーターから容器を削除、ディスパーゼソリューションを吸引し、そして穏やかに、D - PBSで細胞を洗浄する。 </li><li>優しくセルスクレイパーを用いて培養皿の表面から細胞をこすり、および滅菌15mlの遠心チューブに細胞を移す。 </li><li>静かに切り離されていない任意のセルを&quot;オフ噴霧&quot;、KSR - FFで二回培養皿をすすぎます。プールは、15mlのチューブで細胞と培地を洗い流してください。 </li><li>ペレットに室温で5分間、細胞を200 xgでチューブを遠心分離します。 </li><li>慎重に細胞ペレットを乱すことなく上清を吸引し、それを捨てる。 </li><li> cryovialsの十分な量を準備します。細胞はDMSOと接触していると、彼らは2〜3分以内に分注し、凍結して下さい。 </li><li>ゆっくりと完全に[穏やかに5 mLの血清学的ピペットを使用して上下にピペッティングして]を凍結培地Aにチューブの底からの細胞ペレットと再サスペンド細胞を取り除くために、チューブをフリック。穏やかに混合して細胞懸濁液を渦巻くながら、塊の均一な懸濁液に続いて、、滴下方法で、それに凍結培地Bの等量を追加します。 注：この時点で、細胞はDMSOと接触している、と作業が効率的に実行する必要があります。いったん細胞はDMSOと接触している、それらは2〜3分以内に分注し、凍結して下さい。 </li><li>各クライオバイアルに細胞懸濁液のアリコートを1ミリ​​リットル。 </li><li> ℃で一晩迅速ミスターフロスティでバイアルを配置[急速に凍結する]、-80に転送します。 </li><li> -80℃で一晩保管° Cの後、長期保管のための液体窒素タンクにセルを転送する。 </li></ol> IPSCバイアルの雪解けと細胞の回復注：KSR - FFは、KSR含有MEF -馴化培地、またはフィーダで使用するためのKSRの培地で置き換えられるかもしれません。メディアを準備するための指示については、付録を参照してください。 50 mlチューブにKSR - FF媒体のプレ暖かい10mLを。 <ol><li>ちょうどあなたのめっき前に室温にGeltrex - コートディッシュの適切な量を平衡化し、皿から液体を吸引するR細胞。 </li><li>慎重にヒトES細胞（またはIPSC）液体窒素貯蔵タンクからバイアルを取り外してください。 </li><li>ちょうど小さな冷凍チャンクがバイアルになるまで急速に、37 ° Cの水浴中で細胞の凍結バイアルを解凍。 </li><li>それを除染し、無菌組織培養フードにそれを転送するためにイソプロパノール70％スプレーバイアル。 </li><li>無菌的に5 mLのピペットを用いて15 mLコニカルチューブにバイアルの内容全体を転送する。 </li><li> KSR - FF 1 mlのバイアルをリンスし、15 mlの遠心チューブに以下を追加。 </li><li>ゆっくりと、KSR - FFの4 mLの15mlのコニカルチューブに細胞に滴下して加える。培地を添加しながら、穏やかに細胞を混合する前後にチューブを移動します。 （これは細胞に浸透圧ショックを減らす）。 </li><li>室温で2分間1000rpm（200 × g）で細胞懸濁液を15 mLの試験管を遠心します。 </li><li>慎重に吸引し、細胞ペレットを乱すことなく、上清を捨てます。 </li><li> 5 mLのピペットを用いて予め温めておいたKSR - FF（例えば4mL/60 mmディッシュ）で細胞ペレットを再サスペンドし、細胞ペレットが完全に分散されるまで静かに上下のセルをピペッティング。生存率が70％未満の場合は70％を超えるの生存率が期待されている、しかし、それは、コンフルエントに達するために、細胞のために時間がかかることがあります。 </li><li>同じピペットを使用して、細胞懸濁液を室温に平衡化Geltrexコーティングした培養皿に滴下して転送する。 </li><li>空気中の4〜6％CO 2の加湿雰囲気下で、37℃インキュベーターで培養皿を置きます。均等に細胞を分散させる西側パターンに南、東、北に慎重にスワール容器。 </li><li>静かに培養皿24時間の解凍後、細胞破片を除去すると料理が約70〜80％コンフルエントになるまで、新鮮な栄養素を提供するために、その後毎日流体変更。あなたのiPS細胞の継続的な文化と継代については、&quot;完全ノックアウト血清代替フィーダーを含まない培地を用いてヒトiPS細胞のフィーダーフリー培養と継代&quot;というタイトルの我々のプロトコルを参照してください。 </li></ol>予想される結果細胞は、前の凍結保存にコンフルエントおよそ70から80パーセントにする必要があります。アップカーリングとコロニーの縁に沿ってコロニーの折り畳みのディスパーゼの消化は結果。細胞を収穫した後、彼らは、凍結保存メディアの小さな塊として凍結されています。バイアルを融解されると、細胞が回復し、小さな塊としてプレコートしたディッシュに付着する。彼らは急速に5-6日でコンフルエント皿につながる成長する。 表1 - 推奨ボリューム<table border="1"><tbody><tr><td> コンポーネント </td><td> 35mmのディッシュ </td><td> 60ミリメートルディッシュ </td><td> 100mmディッシュ </td></tr><tr><td>完全にノックアウトSR培地</td><td> 2 mLの</td><td> 4 mLの</td><td> 10mLの</td></tr><tr><td> Geltrexソリューション</td><td> 1 mLの</td><td> 1.5 mLの</td><td> 4〜5 mLの</td></tr><tr><td>ディスパーゼ</td><td> 0.5mLの</td><td> 1 mLの</td><td> 3〜4 mLの</td></tr><tr><td>すすぎのためのD - PBS </td><td> 2 mLの</td><td> 4 mLの</td><td> 10mLの</td></tr></tbody></table>してください<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2237/2237_appendix.pdf">付録を見るにはここをクリック</a> 。

<ol><li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Maherali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+and+techniques+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 595-605 (2008).</li>
<li>Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+rat+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+combining+genetic+reprogramming+and+chemical+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors.</a> Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).</li>
<li>Liao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines+from+adult+rat+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells.</a> Cell Stem Cell. 4, 11-15 (2009).</li>
<li>Dimos, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+patients+with+ALS+can+be+differentiated+into+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons.</a> Science. 321, 1218-1221 (2008).</li>
<li>Aasen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnli%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnli. 26, 1276-1284 (2008).</li>
<li>Park, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of human-induced pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 3, 1180-1186 (2008).</li>
</ol>

この記事の著者は、この記事で使用した試薬と器具を生産Life Technologies社によって採用されています。

<table><tbody><tr><td>Knockout DMEM/F12</td><td></td><td>12660-012</td><td>Note: see appendix for the use of alternative DMEM products GlutaMAX-I (Cat. No. 35050-061)</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td></td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement Growth Factor Cocktail</td><td></td><td>A10580-01</td><td></td></tr><tr><td>FGF-basic, human recombinant protein, 10 &amp;mu;g</td><td></td><td>PHG0024</td><td>Note: see appendix for alternative bFGF pack sizes.</td></tr><tr><td>2-Mercapt&amp;#8211;thanol</td><td></td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td></td><td>17105-041</td><td>Note: see appendix for alternative passaging methods</td></tr><tr><td>Geltrex hESC-Qualified Reduced Growth Factor Basement Matrix, 1 mL</td><td></td><td>A10480-01</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) without calcium and magnesium</td><td></td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, 500mL</td><td>JT Baker</td><td>JT9224-1</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Tissue Culture Hood</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator set at 37&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette-Aid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water Bath set at 37&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile serological pipettes (5 mL, 10 mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL centrifuge tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 mm Tissue Culture treated dishes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liquid nitrogen storage tank</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol freezing containers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Cryovials</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cryopreserving and recovering of human ips cells using complete knockout serum replacement feeder-free medium

ヒトとマウスの線維芽細胞は、胚性幹細胞に非常に似て資質と1月3日 iPS細胞を生成するために再プログラムできることを2006年の発見は、創薬、細胞治療、および基礎研究のための多能性細胞の貴重な新しいソースを作成しました。 GIBCOの培地および試薬は、年間の多能性幹細胞研究の最前線にされている。 DMEMはノックアウト血清代替物を添加したノックアウトは胚性幹細胞の成長と現在のiPS細胞培養3-9最適なメディアです。この金の標準的なメディアシステムは、現在、ノックアウトSRの成長因子のカクテルを追加してフィーダーを含まない培養に使用することができます。 従来のヒトESやiPS細胞の培養法はマウスやヒトの線維芽細胞フィーダー層の使用、またはフィーダ-馴化培地を必要とする。これらの培養法は、スケールにハード、労働集約的であり、それが原因で未定義の条件に未分化腰の細胞を維持することは困難である。インビトロジェンでは、フィーダーフリーへの移行はお尻とhES細胞の培養を、まだノックアウトSRの使用を維持しながら簡単にできるように、ノックアウトSRの成長因子のカクテルを開発しました。

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Cryopreserving and Recovering of Human iPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

このプロトコルはノックアウトSRの凍結保存培地でヒトiPS細胞をcryopreserving、完全ノックアウトSRフィーダーフリー（KSR - FF）培地やフィーダーベースのノックアウトSR培地でこれらの細胞を回収するための詳細な手順を説明します。

完全ノックアウト血清代替のフィーダーを含まない培地を用いてヒトiPS細胞のCryopreservingおよびリカバリ

The discovery in 2006 that human and mouse fibroblasts could be reprogrammed to generate iPS cells 1-3 with qualities remarkably similar to embryonic stem ...

cryopreserving-recovering-human-ips-cells-using-complete-knockout

Universidad San Sebastian

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JoVE Journal

Biology

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ビデオ: Cryopreserving and Recovering of Human iPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

Generating iPS Cells from MEFS through Forced Expression of Sox-2, Oct-4, c-Myc, and Klf4

Pluripotency can be induced in differentiated murine by viral transduction of Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc (Takahashi and Yamanaka, 2006; Wernig, et al., 2007; Okita, et al., 2007; Maherali, et al., 2007). We have devised a reprogramming strategy in which these four transcription factors are expressed from doxycycline (dox)-inducible lentiviral vectors (Brambrink et al., 2008). Using these inducible constructs, we can derive induced pluripotent stem (iPS) cells from mouse embryonic fibroblasts (MEFs). In this video, we demonstrate the procedure for the generation of inducible lentiviruses that express the four transcription factors and show how to infect MEFs with these viruses in order to produce iPS cells. By using inducible lentiviruses, the expression of the four factors in controlled by the addition of doxycyline to the culture medium. The advantage of this system over the traditional retroviral infection is the ability to turn the genes on and off so that the kinetics of reprogramming and gene expression requirements can be analyzed in detail.

This video shows the procedure for generating induced pluripotent stem cells using inducible lentivirus that express Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4.

ソックス- 2の強制発現によってMEFSからiPS細胞を生成し、OCT - 4、c - Mycの、とKLF4

Pluripotency can be induced in differentiated murine by viral transduction of Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc (Takahashi and Yamanaka, 2006;  Wernig, et al., ...

生物学

Small-scale Propagation of Human iPSCs in Serum-free Conditions for Routine Immunocytochemical Characterization

There is great interest in utilizing human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) for disease modeling and cell therapeutics due to their patient specificity and characteristic stemness. However, the pluripotency of iPSCs, which is essential to their functionality, must be confirmed before these cells can be used in such applications. While a rigorous characterization of iPSCs, through different cellular and functional assays is necessary to establish their pluripotency, routine assessment of pluripotency maintenance can be achieved more simply and effectively through immunocytochemical techniques. Here, we present a systematic protocol for culturing hiPSCs, in a scaled-down manner, to particularly facilitate the verification of their pluripotent state using immunocytochemistry. More specifically, this methodology encompasses an efficient and cost-effective means of growing iPSCs in serum-free conditions and plating them on small chamber slides or glass coverslips ideal for immunocytochemistry.

Regular characterization of induced pluripotent stem cells (iPSCs), to ascertain maintenance of their pluripotent state, is an important step before these cells are used for other applications. Here we describe a method for the small-scale propagation of human iPSCs specifically designed to enable their easy and routine characterization via immunocytochemistry.

ルーチンの免疫細胞化学的特性評価のための無血清条件でのヒトiPS細胞の小規模伝播

There is great interest in utilizing human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) for disease modeling and cell therapeutics due to their patient ...

発生生物学

Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of human-induced pluripotent stem cells (iPSCs) is particularly attractive for neurodegenerative disease studies, including retinal dystrophies, where iPSC-derived retinal cell models mark a major step forward to understand and fight blindness. In this paper, we describe a simple and scalable protocol to generate, mature, and cryopreserve retinal organoids. Based on medium changing, the main advantage of this method is to avoid multiple and time-consuming steps commonly required in a guided differentiation of iPSCs. Mimicking the early phases of retinal development by successive changes of defined media on adherent human iPSC cultures, this protocol allows the simultaneous generation of self-forming neuroretinal structures and retinal pigmented epithelial (RPE) cells in a reproducible and efficient manner in 4 weeks. These structures containing retinal progenitor cells (RPCs) can be easily isolated for further maturation in a floating culture condition enabling the differentiation of RPCs into the seven retinal cell types present in the adult human retina. Additionally, we describe quick methods for the cryopreservation of retinal organoids and RPE cells for long-term storage. Combined together, the methods described here will be useful to produce and bank human iPSC-derived retinal cells or tissues for both basic and clinical research.

The production of specialized retinal cells from pluripotent stem cells is a turning point in the development of stem cell-based therapy for retinal diseases. The present paper describes a simple method for an efficient generation of retinal organoids and retinal pigmented epithelium for basic, translational, and clinical research.

Xeno 無料の定義された、人間の世代の iPSC 由来網膜細胞モデル フィーダー フリー培養条件

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...

Feeder-Free Adaptation, Culture and Passaging of Human IPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

The discovery in 2006 that human and mouse fibroblasts could be reprogrammed to generate iPS cells 1-3 with qualities remarkably similar to embryonic stem cells has created a valuable new source of pluripotent cells for drug discovery, cell therapy, and basic research.
GIBCO media and reagents have been at the forefront of pluripotent stem cell research for years. Knockout DMEM supplemented with Knockout Serum Replacement is the media of choice for embryonic stem cell growth and now iPS cell culture 3-9. This gold standard media system can now be used for feeder-free culture with the addition of Knockout SR Growth Factor Cocktail.
Traditional human ES and iPS cell culture methods require the use of mouse or human fibroblast feeder layers, or feeder-conditioned medium. These culture methods are labor-intensive, hard to scale and it is difficult to maintain hiPS cells undifferentiated due to the undefined conditions. Invitrogen has developed Knockout SR Growth Factor Cocktail to allow you to easily transition your hiPS cell cultures to feeder-free while still maintaining your use of Knockout SR.

The following protocol provides instruction for adapting human induced Pluripotent Stem (iPS) Cells to feeder-free culture using complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free medium (KSR-FF). Once adapted, instructions for continual maintenance are also provided.

完全ノックアウト血清代替フィーダーを含まない培地を用いてヒトiPS細胞のフィーダーフリー適応、文化と継

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human embryonic stem cells (HESCs)1. While improvements in several gene delivery methods have been described2-9, transfection remains a capricious process for HESCs, and has not yet been reported in human induced pluripotent stem cells (iPSCs). In this video, we demonstrate how our lab routinely transfects and nucleofects human iPSCs using plasmid with an enhanced green fluorescence protein (eGFP) reporter. Human iPSCs are adapted and maintained as feeder-free cultures to eliminate the possibility of feeder cell transfection and to allow efficient selection of stable transgenic iPSC clones following transfection. For nucleofection, human iPSCs are pre-treated with ROCK inhibitor11, trypsinized into small clumps of cells, nucleofected and replated on feeders in feeder cell-conditioned medium to enhance cell recovery. Transgene-expressing human iPSCs can be obtained after 6 hours. Antibiotic selection is applied after 24 hours and stable transgenic lines appear within 1 week. Our protocol is robust and reproducible for human iPSC lines without altering pluripotency of these cells.

Despite recent advancements in genetic modification, transfection of human embryonic stem cells (HESCs) remains a capricious process. To our knowledge, systematic and efficient methods to transfect human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have not been reported. Here, we describe robust protocols to efficiently transfect and nucleofect human iPSCs.

ヒト人工多能性幹細胞をトランスフェクトしNucleofecting

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable diseases, for the reconstitution and regeneration of injured tissues and for the development of new drugs. Despite all the advantages related to the use of iPSCs, such as the low risk of rejection, the lessened ethical issues, and the possibility to obtain them from both young and old patients without any difference in their reprogramming potential, problems to overcome are still numerous. In fact, cell reprogramming conducted with viral and integrating viruses can cause infections and the introduction of required genes can induce a genomic instability of the recipient cell, impairing their use in clinic. In particular, there are many concerns about the use of c-Myc gene, well-known from several studies for its mutation-inducing activity. Fibroblasts have emerged as the suitable cell population for cellular reprogramming as they are easy to isolate and culture and are harvested by a minimally invasive skin punch biopsy. The protocol described here provides a detailed step-by-step description of the whole procedure, from sample processing to obtain cell cultures, choice of reagents and supplies, cleaning and preparation, to cell reprogramming by the means of a commercial non-modified RNAs (NM-RNAs)-based reprogramming kit. The chosen reprogramming kit allows an effective reprogramming of human dermal fibroblast to iPSCs and small colonies can be seen as early as 24 h after the first transfection, even with modifications with the respect to the standard datasheet. The reprogramming procedure used in this protocol offers the advantage of a safe reprogramming, without the risk of infections caused by viral vector-based methods, reduces the cellular defense mechanisms, and allows the generation of xeno-free iPSCs, all critical features that are mandatory for further clinical applications.

Cell reprogramming requires the introduction of key genes, which regulate and maintain the pluripotent cell state. The protocol described enables the formation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) colonies from human dermal fibroblasts without viral/integrating methods but using non-modified RNAs (NM-RNAs) combined with immune evasion factors reducing cellular defense mechanisms.

腹部皮膚からの成人ヒト皮膚線維芽細胞の分離と非積分法を用いた人工多能性幹細胞の生成

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

生物工学

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is essential first to generate functional human cardiomyocytes (CMs). The use of these cells in drug discovery and toxicology studies would also be highly beneficial, allowing new pharmacological molecules for the treatment of cardiac disorders to be validated pre-clinically on cells of human origin. Of the possible sources of CMs, induced pluripotent stem (iPS) cells are among the most promising, as they can be derived directly from readily accessible patient tissue and possess an intrinsic capacity to give rise to all cell types of the body 1. Several methods have been proposed for differentiating iPS cells into CMs, ranging from the classical embryoid bodies (EBs) aggregation approach to chemically defined protocols 2,3. In this article we propose an EBs-based protocol and show how this method can be employed to efficiently generate functional CM-like cells from feeder-free iPS cells.

Pluripotent stem cells, either embryonic or induced pluripotent stem (iPS) cells, constitute a valuable source of human differentiated cells, including cardiomyocytes. Here, we will focus on cardiac induction of iPS cells, showing how to use them to obtain functional human cardiomyocytes through an embryoid bodies-based protocol.

ヒト心筋細胞の生成：フィーダーフリーヒト人工多能性幹細胞からの分化プロトコル

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Cell Surface Marker Mediated Purification of iPS Cell Intermediates from a Reprogrammable Mouse Model

Mature cells can be reprogrammed to a pluripotent state. These so called induced pluripotent stem (iPS) cells are able to give rise to all cell types of the body and consequently have vast potential for regenerative medicine applications. Traditionally iPS cells are generated by viral introduction of transcription factors Oct-4, Klf-4, Sox-2, and c-Myc (OKSM) into fibroblasts. However, reprogramming is an inefficient process with only 0.1-1% of cells reverting towards a pluripotent state, making it difficult to study the reprogramming mechanism. A proven methodology that has allowed the study of the reprogramming process is to separate the rare intermediates of the reaction from the refractory bulk population. In the case of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), we and others have previously shown that reprogramming cells undergo a distinct series of changes in the expression profile of cell surface markers which can be used for the separation of these cells. During the early stages of OKSM expression successfully reprogramming cells lose fibroblast identity marker Thy-1.2 and up-regulate pluripotency associated marker Ssea-1. The final transition of a subset of Ssea-1 positive cells towards the pluripotent state is marked by the expression of Epcam during the late stages of reprogramming. Here we provide a detailed description of the methodology used to isolate reprogramming intermediates from cultures of reprogramming MEFs. In order to increase experimental reproducibility we use a reprogrammable mouse strain that has been engineered to express a transcriptional transactivator (m2rtTA) under control of the Rosa26 locus and OKSM under control of a doxycycline responsive promoter. Cells isolated from these mice are isogenic and express OKSM homogenously upon addition of doxycycline. We describe in detail the establishment of the reprogrammable mice, the derivation of MEFs, and the subsequent isolation of intermediates during reprogramming into iPS cells via fluorescent activated cells sorting (FACS).

Mouse embryonic fibroblast can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells at low efficiency by the forced expression of transcription factors Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc. The rare intermediates of the reprogramming reaction are FACS isolated via labeling with antibodies against cell surface makers Thy-1.2, Ssea-1, and Epcam.

リプログラマブルマウスモデルからのiPS細胞の中間体の精製を媒介細胞表面マーカー

Mature cells can be reprogrammed to a pluripotent state. These so called induced pluripotent stem (iPS) cells are able to give rise to all cell types of ...

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using episomal plasmids and histone deacetylase (HDAC) inhibitors. The advantages of this approach include: (1) the use of a minimal amount of peripheral blood as a source material; (2) nonintegrating reprogramming vectors; (3) a cost effective method for generating vector free iPSCs; (4) a single transfection; and (5) the use of small molecules to facilitate epigenetic reprogramming. Briefly, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are isolated from routine phlebotomy samples and then cultured in defined growth factors to yield a highly proliferative erythrocyte progenitor cell population that is remarkably amenable to reprogramming. Nonintegrating, nontransmissible episomal plasmids expressing OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A, and a p53 short hairpin (sh)RNA are introduced into the derived erythroblasts via a single nucleofection. Cotransfection of an episome that expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) allows for easy identification of transfected cells. A separate replication-deficient plasmid expressing Epstein-Barr nuclear antigen 1 (EBNA1) is also added to the reaction mixture for increased expression of episomal proteins. Transfected cells are then plated onto a layer of irradiated mouse embryonic fibroblasts (iMEFs) for continued reprogramming. As soon as iPSC-like colonies appear at about twelve days after nucleofection, HDAC inhibitors are added to the medium to facilitate epigenetic remodeling. We have found that the inclusion of HDAC inhibitors routinely increases the generation of fully reprogrammed iPSC colonies by 2 fold. Once iPSC colonies exhibit typical human embryonic stem cell (hESC) morphology, they are gently transferred to individual iMEF-coated tissue culture plates for continued growth and expansion.

Here we describe a protocol for generating human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using an episome based reprogramming strategy and histone deacetylase inhibitors.

エピソームおよびHDAC阻害剤を用いて血液からの効率的なiPS細胞の生成

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

Advances in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Chimeric Antigen Receptor-Expressing Natural Killer Cells

Natural killer (NK) cells are innate immune cells that play a crucial role in the body's defense against tumors and viral infections. The generation of human induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived chimeric antigen receptor (CAR) expressing NK cells has emerged as a promising avenue for "off the shelf" cancer immunotherapy. Here, we utilized an NK cell-optimized CAR construct that includes the transmembrane domain of NKG2D, the 2B4 co-stimulatory domain, and the CD3&#950; signaling domain, which has been demonstrated to stimulate robust antigen-specific NK cell-mediated antitumor activity. The use of iPSCs for CAR NK cell generation offers several advantages, including homogenous CAR expression, scalability, reproducibility, and the potential for clinical application. This detailed step-by-step protocol from cell engineering to differentiation enables the generation of NK cell-optimized iPSC-derived CAR-expressing NK cells, providing a standardized and targeted cancer immunotherapy with improved antitumor activity and highlighting their potential as a promising treatment option for various malignancies.

Here, we present a method to differentiate and expand human iPSC-derived chimeric antigen receptor (CAR)-expressing natural killer cells with improved killing against various malignancies. This protocol demonstrates the differentiation and expansion of natural killer (NK) optimized iPSC-derived CAR-NK cells and the measurement of antitumor activity against various tumor cell lines.

ヒト人工多能性幹細胞由来キメラ抗原受容体発現ナチュラルキラー細胞の進歩

Natural killer (NK) cells are innate immune cells that play a crucial role in the body's defense against tumors and viral infections. The generation of ...

完全ノックアウト血清代替のフィーダーを含まない培地を用いてヒトiPS細胞のCryopreservingおよびリカバリ

文字起こし

要約

さらに動画を探す

ソックス- 2の強制発現によってMEFSからiPS細胞を生成し、OCT - 4、c - Mycの、とKLF4

ルーチンの免疫細胞化学的特性評価のための無血清条件でのヒトiPS細胞の小規模伝播

Xeno 無料の定義された、人間の世代の iPSC 由来網膜細胞モデルフィーダーフリー培養条件

完全ノックアウト血清代替フィーダーを含まない培地を用いてヒトiPS細胞のフィーダーフリー適応、文化と継

ヒト人工多能性幹細胞をトランスフェクトしNucleofecting

腹部皮膚からの成人ヒト皮膚線維芽細胞の分離と非積分法を用いた人工多能性幹細胞の生成

ヒト心筋細胞の生成：フィーダーフリーヒト人工多能性幹細胞からの分化プロトコル

リプログラマブルマウスモデルからのiPS細胞の中間体の精製を媒介細胞表面マーカー

エピソームおよびHDAC阻害剤を用いて血液からの効率的なiPS細胞の生成

ヒト人工多能性幹細胞由来キメラ抗原受容体発現ナチュラルキラー細胞の進歩

完全ノックアウト血清代替のフィーダーを含まない培地を用いてヒトiPS細胞のCryopreservingおよびリカバリ

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ソックス- 2の強制発現によってMEFSからiPS細胞を生成し、OCT - 4、c - Mycの、とKLF4

ルーチンの免疫細胞化学的特性評価のための無血清条件でのヒトiPS細胞の小規模伝播

Xeno 無料の定義された、人間の世代の iPSC 由来網膜細胞モデル フィーダー フリー培養条件

完全ノックアウト血清代替フィーダーを含まない培地を用いてヒトiPS細胞のフィーダーフリー適応、文化と継

ヒト人工多能性幹細胞をトランスフェクトしNucleofecting

腹部皮膚からの成人ヒト皮膚線維芽細胞の分離と非積分法を用いた人工多能性幹細胞の生成

ヒト心筋細胞の生成：フィーダーフリーヒト人工多能性幹細胞からの分化プロトコル

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エピソームおよびHDAC阻害剤を用いて血液からの効率的なiPS細胞の生成

ヒト人工多能性幹細胞由来キメラ抗原受容体発現ナチュラルキラー細胞の進歩

Xeno 無料の定義された、人間の世代の iPSC 由来網膜細胞モデルフィーダーフリー培養条件