アフリカツメガエル卵母細胞におけるコネキシンおよびイネキシンの異種発現は、ギャップ接合部の生物物理学的特性を分析するための強力なアプローチである。当社の技術の主な利点は、ダブルサイト電圧クランプに適したハイサイド電流測定アプローチを使用することです。この手順は、私の研究室のポスドク研究員であるYuan Shuiによって実証されます。
卵母細胞の70〜80%が剥離したらすぐに、チューブを静かに傾けて酵素溶液をデカントする。チューブにND96溶液を充填し、次いで溶液をデカントすることによって卵母細胞を5回洗浄する。最終洗浄後、卵母細胞をND96溶液を含む60ミリメートルのシャーレに移す。
清潔なガラスパスツールピペットを使用して、大きくて健康に見える卵母細胞をピックアップし、ピルビン酸ナトリウムとペニシリンストレプトマイシンを添加したND96溶液を含む60ミリメートルのペトリ皿に移します。ナイロンメッシュの小片を35ミリメートルのペトリ皿の底に接着することによって卵母細胞注入皿を準備する。卵母細胞注射皿をほぼ半分にピルビン酸およびペニシリンストレプトマイシンを添加したND96溶液で満たす。
次に、25〜30個の卵母細胞をペトリ皿の内側に並べて置きます。インジェクションマイクロピペットに軽量ミネラルオイルをバックフィルし、インジェクタのマイクロピペットホルダーに挿入します。保存されたアリコートの1つから、ピペッティングによってシャーレカバーまたは底部の内面にcRNAを移す。
インジェクターコントローラーのフィルボタンを押して、cRNA液滴をマイクロピペットの先端に吸引します。次に、注入ボタンを押してcRNAを注入する。注入した卵母細胞を、ピルビン酸およびペニシリンストレプトマイシンを添加したND96溶液を含む新しいペトリ皿に移す。
1〜3日間、15〜18°Cの環境チャンバー内に保管してください。卵母細胞を新しいペトリ皿に移すことによって、毎日溶液を交換する。2本の細かいピンセットを使って、卵母細胞を包み込んでいる透明なビリン膜を優しく剥がします。
次いで、ND96溶液を含む卵母細胞対形成チャンバーに1ウェル当たり2つの卵母細胞を配置する。差動電圧プローブと電流ケーブルをモデルセルに接続します。次に、付属のジャンパで赤と黒のソケットを差動電圧プローブに接続し、ジャンパのどちらかの脚をモデルセルのどちらかのピンに接続します。
モデルセルのアース線をアンプのアース回路ソケットからのケーブルに接続します。VMオフセットノブとVEオフセットノブを回して、メンブレン電圧とメンブレン電流メーターをゼロにします。クランプをオフから高速または低速に切り替え、ゲインダイヤルを時計回りに回して、アンプの電圧電極およびバス電極メーターをゼロにするための適切な電圧クランプを可能にするレベルにします。
いくつかの電圧ステップを含む簡単な集録プロトコルを実行して、メンブレン電圧計に表示される電圧が集録プロトコルに従って変化し、電圧と電流のトレースがClampexに正しく表示されることを確認します。対をなす卵母細胞を含むペトリ皿を、記録プラットフォームのペトリ皿レセプタクルに入れる。一対の卵母細胞を選択し、必要に応じてペトリ皿を回転させて、2つの卵母細胞が左右方向になるようにする。
ステージを磁気ベースで所定の位置にロックします。参照電極をシャーレの端付近にユーザー側に向けて配置します。次に、参照電極を2つの差動電圧プローブのうちの1つだけで黒いソケットに接続します。
ガラスのマイクロピペットを取り、ダイヤモンドスクライバーで先端を少し切り落とし、火の研磨で先端の端を滑らかにします。マイクロピペットをアルコールバーナーの炎の上にかざし、先端から約1センチメートル離れたところで滑らかな角度に曲げます。ガラスピペットをND96溶液で完全に戻し、プレフィルドマイクロ電極ホルダーに挿入します。
システムに気泡が含まれていないことを確認します。微小電極ホルダーの2mmピンを差動電圧電極接続ワイヤの2mmソケットに挿入します。磁気ベースのクランプで2ミリメートルのソケットをクランプし、差動電圧電極の先端を2つの卵母細胞のうちの1つに向けます。
差動電圧電極接続線の1mmピンを、同じ側の差動電圧プローブの赤いソケットに挿入します。ガラス毛細血管から電圧電極と電流電極を準備し、塩化カリウム溶液でそれらをバックフィルします。次に、増幅器を備えた電極ホルダーに電極を挿入します。
電極を浴液に下ろし、VMオフセットとVEオフセットダイヤルを回してメンブレン電圧とメンブレン電流メーターをゼロにします。VM電極テストとVE電極テストを押して電極抵抗を確認します。電流電極と電圧電極を卵母細胞に挿入し、負の膜電位を観察します。
次に、アンプのクランプ部で、DCゲインがインポジションにあることを確認します。ゲインノブを時計回りに適切な電圧クランプができるレベルまで回し、クランプスイッチをオフから高速に回します。最後に、集録プロトコルを実行します。
卵母細胞実験の図をここに示す。負および正の膜電圧ステップは、マイナス30ミリボルトの保持膜電圧から卵母細胞1に印加され、一方、卵母細胞2は、マイナス30ミリボルトの一定の膜電圧で保持される。接合間電圧(Vj)は、卵母細胞2の膜電圧から卵母細胞1の膜電圧を引いた値として定義される。
代表的な画像は、サンプルLjトレースと、UNC-9ホモタイプギャップ接合の正規化接合コンダクタンス経接合電圧関係を示す。サンプルLjトレースとUNC-7bホモタイプギャップ接合の正規化されたGj-Vj関係をここに示す。その結果、これら2種類のGjsは、Vj依存性のIj不活性化率、Vj依存性、残留Gjの量が異なることが分かりました。この手順を試みる際には、差動電圧電極系に気泡がなく、その先端が卵母細胞に非常に近く、電圧電極と電流電極の抵抗が約1マイクロオームであることを確認することが非常に重要です。
私たちのテクニックは実装が簡単です。これは、アフリカツメガエル卵母細胞を使用してギャップ接合を研究することに新たに興味を持っている研究室にとって特に興味深いかもしれません。
