A pesquisa é suportada pelo National Institutes of Health bolsas AI-52381, CA138623 e Lung Cancer Research Board Kentucky e apoio institucional de James Graham Brown Cancer Center.

Metodologia Descrição do Microscópio Experimentos com imagens ao vivo celular realizado TE-FM sistema Epi-Fluorescência anexado ao microscópio invertido Nikon Eclipse TE300. O microscópio equipado com estágio de aquecimento. A HQ digital de pressão fresca B / W CCD (Roper Scientific) câmera e LAMDA 02/10 óptico filtro changer (Sutter empresa instrumento) é anexado ao microscópio. Comprimentos de onda de excitação e emissão são controlados com rodas de filtros e controlado por controlador de roda Lamba 02/10 filtro, Sutter Instruments Co. tempo de exposição de 500 ms deve ser o suficiente para ver RFP ou GFP em células vivas. Controle de hardware e aquisição de imagens são controladas por software Metamorph. A escolha dos filtros para o presente estudo são, filtro define S480/20x, S525/40m e S565/25x, S620/60m para GFP e RFP, respectivamente; EGFP / DsRed dupla Tecnologia, dicróicas Chroma. Esta roda de filtros podem acomodar até seis conjuntos de filtros. Microscópio está ligado com o controlador fase anterior Proscan com vara Joy. Todos esses anexos hardware pode ser controlado por software Metamorph. O microscópio também está ligado com micromanipuladores para segurar o micropipetas. A. Medição dos leucotrienos B 4 Migração de Células Dendríticas Direção Utilizando a definição de microscópio acima descrito, desenvolvemos métodos para seguir ligante migração de células dendríticas dirigido em tempo real. Dois micromanipuladores (Narishige) estão ligados ao microscópio. A quimiotaxia de medula óssea de camundongos derivados células dendríticas (BMDCs) em direção a LTB gradiente 4 foi gravado. Aqui, descrevemos os métodos para preparar as pipetas micro, utilizando micro-pipeta extrator, o carregamento do ligante em micro-pipeta e configurar o experimento quimiotaxia no palco aquecida do microscópio para monitorar a migração direcional das células. Este método pode ser aplicado para testar a eficácia de quimioatrativos distintas na indução de migração, bem como efeito de inibidores da quimiotaxia em células vivas. O isolamento de BMDCs 21 de rato tem sido descrita em várias publicações, incluindo JOVE 22. 1. Preparação de BMDCs <ol><li> Placa do BMDCs (após o cultivo por 10 dias) para a tampa prato Fluoro deslizamento inferior e permitir-lhes crescer por 16 hr antes do experimento. </li><li> Lavar as células com 3 ml de 1X PBS, pelo menos, duas vezes (pela adição de 3 ml de 1X PBS a placa e aspiração para fora buffer). </li><li> Adicionar 2 mL de 1XPBS ao prato. As células estão prontas para o experimento. Manter as células em 37 ° C incubadora antes de experimentar. </li></ol> Preparação do ligante carregado micro pipeta: <ol start="4"><li> Fixar a tubos capilares de vidro (Glass padrão, 0,75 mm x 0,4 mm; 6 &quot;, Cat # 625500, AM Systems, INC) na vertical micropipeta extrator (Narishige Internacional EUA, Inc). </li><li> Manter a temperatura a 52 ° C e deixe o vidro para derreter e se separam para formar dicas borda afiada. </li><li> Corrigir a pipeta no suporte micro-pipeta. </li><li> Suavizar as arestas de micro pipeta usando Micro forjar M-900 (Narishige Internacional EUA, Inc), observando ao microscópio. </li><li> Prepare pelo menos 10-20 pipetas para cada experimento. Nota: As micropipetas também pode ser comprado de Instrumentos de Precisão Mundial (TIP μ, T1801TW1F). </li><li> Tome concentração desejada (500 mL de 100 nM LTB 4 na experiência atual) do ligante em um tubo de effendorf mL e manter a ponta da pipeta micro na solução e permitir que a solução para entrar no micro pipeta (back enchimento). </li><li> Tome 1 mL de ligante e com a seringa (1 cc de tuberculina seringa) e, lentamente, preencher o ligante utilizando Micro-Fill agulha (28G MF-5, instrumentos de precisão World) em micro pipeta de cima. </li><li> Conecte o tubo, que se encaixa bem para a pipeta para pipeta e tubo para agulha (21 G 02/11) acoplado a seringa de 1 mL, que é preenchido com ligante. </li><li> Agora, cuidadosamente mover o ligante cheia micro-pipeta para o estágio do microscópio e corrigir para manipuladores micro. </li><li> Aplique pouca pressão da seringa para fazer ligante certeza é liberando lentamente a partir da ponta. </li><li> Trazer o BMDCs banhado imaturo para o microscópio e mantê-los na chapa aquecida (37 ° C) palco. </li><li> Remova a tampa do prato fluoro. </li><li> Foco as células usando óleo de imersão lente objetiva 60X. </li><li> Cuidadosamente, derrubar o ligante carregado pipeta usando &#39;Coarse manual Manipulator MN-188NE&#39; à proximidade das células. </li><li> O foco da pipeta usando &#39;micromanipulador hidráulico Belas MN-188 NE. </li><li> Aplique pouca pressão da seringa para se certificar de que ligante está lançando no prato. </li><li> Definir os parâmetros de aquisição de imagem para adquirir em brilhante arquivado (10 a exposição ms) em cada 15 segundos durante 2 horas usando software Metamorph. </li><li> Manter monitoramento a cada 30 minutos para progression de migração para ligante. </li><li> Se as células estão lotados na ponta da pipeta, alterar a localização da ponta da placa para continuar a migração de experiência. </li></ol> B. Medição GPCR (BLT1) e proteína citosólica (β-arrestina) Interações, Translocação em células vivas 1. Preparação de DNA plasmidial Constrói Os detalhes de construções de DNA plasmidial foram descritas em Jala et al. (2005) 18. 2. Transfecção de Human BLT1-RFP e β-Arrestina-GFP em Células RBL-2H3 <ol><li> Manter o Rat basofílico Leukomia (RBL-2H3) Cells (60 a 70% confluência) a 37 ° C em atmosfera húmida do ar de 95%, 5% de CO 2 como culturas em monocamada em meio de crescimento (DMEM suplementado com 15% FBS, 2 mM L-glutamina, 100 U / mL de penicilina e 100 mg / mL de estreptomicina) em frascos T75. </li><li> Separar as células do prato / frascos usando 6 mL de tripsina-EDTA (0,05% de tripsina, 0,53 mM EDTA) e incubação por 5 min a 37 ° CO C em atmosfera húmida do ar de 95%, 5% 2. Agite suavemente o frasco para acompanhar o grau de descolamento das células. </li><li> Adicionar 6 mL de meio de crescimento para frasco contendo 6 mL de tripsina-EDTA e coletar as células, misturando-os por pipetagem cima e para baixo várias vezes. Transferência de células em tubos de 15 mL falcão. </li><li> Contar as células usando um hemocitômetro e tomar 4 x 10 6 células em tubos de 15 mL de centrífuga e centrifugar a 480g rpm por 3 minutos e ressuspender em 200 mL de mídia transfecção (DMEM, FBS 20%, 50 mM HEPES). Se você pretende realizar 3 transfections, prepare as células e mídia tranfection nesse sentido pelo número de células e aumentando o volume de meio de transfecção. </li><li> Prepare os plasmídeos a serem transfectadas nas concentrações de, pelo menos, 1,5 mcg / mL. Nós preparamos o DNA plasmidial usando DNA QIAGEN Maxi kit plasmídeo. Adicionar o indivíduo ou a codificação DNAs plasmídeo para humanos BLT1-RFP (25 mg) e β-arrestin1-GFP (15 mg) para cubetas eletroforese estéril, (Bio-Rad # 16552088), que tem 0,4 distância entre os eléctrodos cm. </li><li> Tome 200 mL das células acima ressuspenso e colocá-los em cubetas contendo um ou outro hBLT1-RFP ou β-arrestin1-GFP ou os dois juntos e misture-os suavemente com uma pipeta mL estéril. </li><li> Deixe o cubetas acima em temperatura ambiente por 10 min. </li><li> Electroporate as células do Gene Pulser II com tensão de 250 V e capacidade de 500 mF. </li><li> Depois de deixar o eletroporação células permanecem em temperatura ambiente por 10 min. </li><li> Tome 1 mL de meio de crescimento regular e misturá-lo com células electroporated na cubetas. </li><li> Distribuir 300 mL desta mistura em 35 milímetros de tecido de vidro pratos fundo de cultura (prato Fluoro, instrumentos de precisão World) contendo 2 ml de meio de crescimento regular e incubar por 1 hora a 37 ° C em atmosfera húmida do ar de 95%, 5% de CO 2. Permitir que as células a aderir ao fundo do prato. </li><li> Substituir a mídia após 1 h de incubação com meio de crescimento regular e permitir que eles crescem a 37 ° C em atmosfera húmida do ar de 95%, 5% incubadora de CO 2 por 18-24 horas. </li></ol> 3. Imagens de células vivas Aquisição de imagens <ol><li> Após 18-24 horas, lave a 2 células ou 3 vezes com 2 ml de vermelho de fenol livre quentes RPMI contendo 10 mM HEPES, pH 7.55 (Adicionar 2 mL de mídia quente diretamente a placa e media aspirar. Repita 2 ou 3 vezes). Adicionar 1,8 mL de vermelho de fenol livre quentes RPMI contendo 10 mM HEPES. </li><li> Coloque 30 milímetros de vidro de fundo lamela placas de cultura contendo células RBL-2H3, transfectadas com hBLT1-RFP e β-arrestin1-GFP no palco microscópio aquecida (37 ° C). </li><li> Recolher as imagens das células em aumento de 600x usando 60 X objectiva Nikon Plano de Apo 60X/1.4 numérica abertura da lente de imersão em óleo (disponível em nosso sistema de microscópio). </li><li> Coloque uma gota de óleo na lente objetiva 60 x e foco as células com campo claro regulares de luz transmitida ao tocar o fundo do prato. </li><li> Para monitorar a fluorescência de proteínas transfectadas, mudar de campo claro (luz transmitida) para filtros de fluorescência (RFP filtro, se você quiser ver receptor ou GFP, se você quiser ver β-arrestin1). </li><li> Escolha a célula brilhantes e saudáveis, que expressa hBLT1-RFP na superfície da célula usando RFP filtro e capturar a imagem. </li><li> Em seguida, mudar para GFP filtro e certifique-se que β-arrestina-GFP expressa no citoplasma e capturar a imagem. Então cor pseudo tanto as imagens, antes que o tempo decorrido capturar imagens de células vivas para se certificar de que sangram através da fluorescência não está tomando ocorrendo entre RFP e GFP. </li><li> Uma vez que a escolha de seu celular feito, definir os parâmetros de acordo com seu propósito usando software (Software Metamorph neste caso). </li><li> Na demonstração atual, dezesseis imagens bit são adquiridos com o veiora definir binning a 1 X 1 combinado com 60 X Plano Nikon objetivo Apo 60X/1.4 numérica abertura da lente de imersão em óleo. </li><li> Recolher as imagens de fluorescência para RFP e fluorocromos GFP simultaneamente em intervalos de 30 segundos de tempo (se as interações translocação / são muito rápido, pode-se reduzir os intervalos de tempo) dessas rodas usando filtro controlado por software Metamorph. </li><li> Os tempos de exposição da câmera definido para 1000 ms para RFP e GFP. (Definir o tempo de exposição específica de acordo com a intensidade de fluorescência da GFP e RFP). </li><li> Primeiro coletar as imagens para 1 min, sem adição de ligante, que serve como ponto 0 tempo. </li><li> Adicione o mL 200 de ligante (do estoque de 10 mM para uma concentração final de 1 mM), após 1 min sem perturbar a placa / ou posição da célula. </li><li> As imagens de fluorescência são colhidos por 60 min após a adição do ligante e armazenados como imagens TIFF com a ordem crescente dos nomes de arquivo. </li><li> Todos esses arquivos podem ser feitos como arquivos de pilha com individual / combinado imagens de fluorescência com selos de tempo usando o software. </li></ol> Processo de imagens e quantificação da fluorescência de proteínas e de localização <ol><li> Adquirir as imagens com os meios simples (sem células) com RFP e GFP filtros fluorescentes e salvá-los como imagens de fundo. Usar essas imagens para subtrair a partir de imagens reais de dados obtidos acima. </li><li> Prepare a pilha de imagens individualmente para imagens RFP e GFP. </li><li> Selecione / define as várias regiões (superfície vs citosólica) para medir a intensidade de fluorescência da GFP e RFP (BLT1 e β-arrestina translocação) </li><li> Plot as intensidades de fluorescência quantidade como a função do tempo. Este gráfico irá fornecer as informações sobre a cinética de translocação de determinada molécula. </li></ol> Resultados representante A. Medição dos leucotrienos B 4 Migração de Células Dendríticas Direção O método descrito neste protocolo foi utilizado para determinar a migração de células dendríticas para leucotrieno B 4 (Figura 1 e vídeo em anexo 1) 21. Podemos aplicar metodologia semelhante para determinar a capacidade quimiotática de células para um ligante específico em células vivas. <img src="/files/ftp_upload/2315/2315fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Medula óssea do rato derivados da migração de células dendríticas para 100 nM LTB 4. Vídeo 1. Viva a migração celular de BMDCs para LTB 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2315/Jala and Boddulrui_Video1.AVI">Clique aqui para ver o vídeo</a> . B. Medição GPCR (BLT1) e proteína citosólica (β-arrestina) Interações, Translocação em células vivas Após a conclusão deste procedimento, pode-se obter as seguintes informações em eventos GPCR sinalização. <ol class="lroman"><li> A localização de GPCR e proteínas citosólicas e núcleo (Figura 2). </li><li> Interação ligante induzida da superfície GPCR (BLT1 neste caso) com proteína citosólica (β arrestina, neste caso) (Fig. 3). </li><li> Cinética da internalização de receptores e β-arrestina translocação para membrana seguida de internalização, juntamente com os receptores (Figura 4) (Jala et al. 2005) 18. </li><li> Pode-se determinar o status de ativação ligante dependente de receptores em células vivas (em anexo video 2) e determinar motivos críticos ou processos envolvidos na ativação do receptor (Jala et al. 2005) 18. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2315/2315fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Expressão de BLT1-RFP (A), β-arrestina-GFP (B), pNuc-PCP (C) em células RBL-2H3. Imagem da cor combinada mostrado no painel de D. <img src="/files/ftp_upload/2315/2315fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Translocação Ligand induzida do receptor e β arrestina. Scan linha de intensidades de fluorescência nas células são mostrados. <img src="/files/ftp_upload/2315/2315fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Cinética de internalização de receptores e β-arrestina translocação com a adição de 1 mM LTB 4. As intensidades de fluorescência foram medidos em função do tempo na membrana e locais citosólicos da célula. Imagens de vídeo ao vivo de duas células que expressam BLT1-RFP e β-arrestina-GFP sobre a adição de 1 mM LTB 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2315/Jala and Bodduluri_Video2.AVI">Clique aqui para assistir ao vídeo</a>

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	<li>Wess, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-protein-coupled+receptors:+molecular+mechanisms+involved+in+receptor+activation+and+selectivity+of+G-protein+recognition.">G-protein-coupled receptors: molecular mechanisms involved in receptor activation and selectivity of G-protein recognition.</a> FASEB J. 11, 346-354 (1997).</li><li>Gether, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+molecular+mechanisms+involved+in+activation+of+G+protein-coupled+receptors.">Uncovering molecular mechanisms involved in activation of G protein-coupled receptors.</a> Endocr Rev. 21, 90-113 (2000).</li><li>Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven-transmembrane+receptors.">Seven-transmembrane receptors.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).</li><li>Lefkowitz, R. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=protein-coupled+receptors.+III.+New+roles+for+receptor+kinases+and+beta-arrestins+in+receptor+signaling+and+desensitization.">protein-coupled receptors. III. New roles for receptor kinases and beta-arrestins in receptor signaling and desensitization.</a> J Biol Chem. 273, 18677-18680 (1998).</li><li>Shenoy, S. K., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+roles+of+beta-arrestins+in+the+regulation+of+seven-membrane-spanning+receptor+trafficking+and+signalling.">Multifaceted roles of beta-arrestins in the regulation of seven-membrane-spanning receptor trafficking and signalling.</a> Biochem J. 375, 503-515 (2003).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-arrest	or.">Beta-arrest	or.</a> Nature. 383, 447-450 (1996).</li><li>Serhan, C. N., Haeggstrom, J. Z., Leslie, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+mediator+networks+in+cell+signaling:+update+and+impact+of+cytokines.">Lipid mediator networks in cell signaling: update and impact of cytokines.</a> Faseb J. 10, 1147-1158 (1996).</li><li>Tager, A. M., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLT1+and+BLT2:+the+leukotriene+B(4)+receptors.">BLT1 and BLT2: the leukotriene B(4) receptors.</a> Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 69, 123-134 (2003).</li><li>Toda, A., Yokomizo, T., Shimizu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukotriene+B4+receptors.">Leukotriene B4 receptors.</a> Prostaglandins Other Lipid Mediat. 68-69, 575-585 (2002).</li><li>Haribabu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+disruption+of+the+leukotriene+B(4)+receptor+in+mice+reveals+its+role+in+inflammation+and+platelet-activating+factor-induced+anaphylaxis.">Targeted disruption of the leukotriene B(4) receptor in mice reveals its role in inflammation and platelet-activating factor-induced anaphylaxis.</a> J Exp Med. 192, 433-438 (2000).</li><li>Subbarao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+leukotriene+B4+receptors+in+the+development+of+atherosclerosis:+potential+mechanisms.">Role of leukotriene B4 receptors in the development of atherosclerosis: potential mechanisms.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24, 369-375 (2004).</li><li>Jala, V. R., Haribabu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukotrienes+and+atherosclerosis:+new+roles+for+old+mediators.">Leukotrienes and atherosclerosis: new roles for old mediators.</a> Trends Immunol. 25, 315-322 (2004).</li><li>Heller, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+atherogenesis+in+BLT1-deficient+mice+reveals+a+role+for+LTB4+and+BLT1+in+smooth+muscle+cell+recruitment.">Inhibition of atherogenesis in BLT1-deficient mice reveals a role for LTB4 and BLT1 in smooth muscle cell recruitment.</a> Circulation. 112, 578-586 (2005).</li><li>Miyahara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+leukotriene+B4+receptor+1+in+allergen-induced+airway+hyperresponsiveness.">Requirement for leukotriene B4 receptor 1 in allergen-induced airway hyperresponsiveness.</a> Am J Respir Crit Care Med. 172, 161-167 (2005).</li><li>Terawaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+leukotriene+B4+receptor+1+confers+resistance+to+airway+hyperresponsiveness+and+Th2-type+immune+responses.">Absence of leukotriene B4 receptor 1 confers resistance to airway hyperresponsiveness and Th2-type immune responses.</a> J Immunol. 175, 4217-4225 (2005).</li><li>Shao, W. H., Del Prete, A., Bock, C. B., Haribabu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+disruption+of+leukotriene+B4+receptors+BLT1+and+BLT2:+a+critical+role+for+BLT1+in+collagen-induced+arthritis+in+mice.">Targeted disruption of leukotriene B4 receptors BLT1 and BLT2: a critical role for BLT1 in collagen-induced arthritis in mice.</a> J Immunol. 176, 6254-6261 (2006).</li><li>Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+requirement+for+the+leukotriene+B4+receptor+BLT1+for+neutrophil+recruitment+in+inflammatory+arthritis.">A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis.</a> J Exp Med. 203, 829-835 (2006).</li><li>Jala, V. R., Shao, W. H., Haribabu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation-independent+beta-arrestin+translocation+and+internalization+of+leukotriene+B4+receptors.">Phosphorylation-independent beta-arrestin translocation and internalization of leukotriene B4 receptors.</a> J Biol Chem. 280, 4880-4887 (2005).</li><li>Jala, V. R., Haribabu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+analysis+of+G+protein-coupled+receptor+signaling+in+live+cells.">Real-time analysis of G protein-coupled receptor signaling in live cells.</a> Methods Mol Biol. 332, 159-165 (2006).</li><li>Del Prete, A., A, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+dendritic+cell+migration+and+adaptive+immune+response+by+leukotriene+B4+receptors:+a+role+for+LTB4+in+up-regulation+of+CCR7+expression+and+function.">Regulation of dendritic cell migration and adaptive immune response by leukotriene B4 receptors: a role for LTB4 in up-regulation of CCR7 expression and function.</a> Blood. 109, 626-631 (2007).</li><li>Salogni, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activin+A+induces+dendritic+cell+migration+through+the+polarized+release+of+CXC+chemokine+ligands+12+and+14.">Activin A induces dendritic cell migration through the polarized release of CXC chemokine ligands 12 and 14.</a> Blood. 113, 5848-5856 (2009).</li><li>Boudreau, J., Koshy, S., Cummings, D., Wan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+myeloid+dendritic+cells+from+bone+marrow+precursors.">Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors.</a> J Vis Exp. , (2008).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Imagens de células vivas é uma poderosa ferramenta para demonstrar a função e interações de proteínas específicas à medida que ocorrem em tempo real. Os métodos descritos neste manuscrito mostram claramente que a LTB 4 pode induzir a migração rápida de células dendríticas. Estes métodos não só ampliar os aspectos da função LTB 4 a diversos tipos de células, eles permitem que métodos semelhantes para ser aplicado a uma variedade de quimiocinas e outros testes de sua eficácia c...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Cell lines:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rat Basophilic Leukomia Cell line (RBL-2H3) or HEK293 cells.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ATCC</td>
<td>CRL-2256</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Media:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Delbecco's modified Eagle&#x2019;s Medium (DMEM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11995</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phenol red free RPMI or DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11835-030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16000-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-streptomycin (10000 U/mL)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HEPES (1M)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15630</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Others:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>35 mm sterile glass coverslip-bottomed Fluoro dishes (0.17 mm thick) (WillCo-dish)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>FD35-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile Gene Pulser Cuvette (0.4 cm electrode gap) (Bio-Rad)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>16552088</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Instruments/software:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gene Pulser II electroporater </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TE-FM Epi-Fluorescence system attached to Nikon Inverted Microscope Eclipse TE300</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Metamorph Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Universal Imaging</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vertical Micro-pipette puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige International </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micro-Forge M-900</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige International </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hadraulic Micromanipulator MO-188NE</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige International </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coarse Manual Manipulator, MN-188NE</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige International </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>cDNA constructs:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>cDNA of G-Protein coupled receptor tagged with red fluorescence protein at C-terminus (hBLT1-RFP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jala et al 2005</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td> cDNA of cytosolic protein tagged with GFP (&beta;-arrestin1-GFP in present study).</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jala et al 2005</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

real-time imaging of leukotriene b4 mediated cell migration and blt1 interactions with &beta;-arrestin

Receptores acoplados à proteína G (GPCRs) pertencem à família de proteínas transmembrana sete e mediar a transdução de sinais extracelulares de respostas intracelulares. GPCRs controle de diversas funções biológicas, como quimiotaxia, liberação de cálcio intracelular, regulação de genes de uma forma ligante dependente via heterotrimeric G-proteínas 1-2. Ligante de ligação induz uma série de mudanças conformacionais levando à ativação de heterotrimeric G-proteínas que modulam níveis de segundos mensageiros como a adenosina monofosfato cíclico (cAMP), o trifosfato de inositol (IP3) e glicerol diacyl (DG). Concomitante com a ativação da ligação ligante receptor também inicia uma série de eventos para atenuar o receptor de sinalização por meio de seqüestro de dessensibilização, e / ou internalização. O processo de dessensibilização dos GPCRs ocorre através de fosforilação do receptor de quinases da proteína G-receptor (GRKs) e subsequente ligação dos β-arrestinas 3. β-arrestinas são proteínas citosólicas e translocar para a membrana após a ativação GPCR, ligação aos receptores fosforilados (maioria dos casos) há, facilitando a internalização dos receptores 4-6. Leucotrieno B 4 (LTB 4) é uma molécula de lipídio pró-inflamatórias derivadas de ácido araquidônico via e medeia suas ações através de GPCRs, LTB 4 receptor 1 (BLT1; um receptor de alta afinidade) e receptor LTB 4 2 (BLT2; um receptor de baixa afinidade ) 7-9. A LTB via 4-BLT1 foi mostrado para ser crítico em várias doenças inflamatórias, incluindo, artrite, asma e aterosclerose 10-17. O presente artigo descreve as metodologias desenvolvidas para monitorar LTB 4 induzida migração de leucócitos e as interações de BLT1 com β-arrestina e, a translocação do receptor em células vivas usando técnicas de microscopia de imagem 18-19. Derivadas da medula óssea células dendríticas de camundongos C57BL / 6 foram isoladas e cultivadas como descrito anteriormente 20-21. Essas células foram testados em métodos de imagem ao vivo de células para demonstrar LTB 4 migração celular induzida. O BLT1 humano foi marcado com uma proteína fluorescente vermelha (BLT1-RFP) no C-terminal e β-arrestin1 marcados com proteína fluorescente verde (β-arr-GFP) e os plasmídeos transfectados em ambos os Rat basofílico Leukomia (RBL-2H3) linhas celulares 18-19. A cinética de interação entre essas proteínas e localização foram monitorados através de microscopia de vídeo ao vivo da célula. As metodologias no presente trabalho descrevem o uso de técnicas microscópicas para investigar as respostas funcionais do G receptores acoplados à proteína em células vivas. O presente artigo também descreve o uso de Metamorph software para quantificar a intensidade de fluorescência para determinar a cinética do receptor e interações proteína citosólica.

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Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &amp;#946;-arrestin

Este artigo descreve a metodologia para determinar a resposta quimiotática de leucócitos para ligantes específicos e identificar as interações entre os receptores da superfície celular e as proteínas citosólicas usando técnicas de imagem de células vivas.

Em tempo real de imagens de leucotrienos B 4 Migração mediada por células e BLT1 Interações com β-arrestina

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to ...

real-time-imaging-leukotriene-b4-mediated-cell-migration-blt1

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

12.7K visualizações.  University of Louisville. Este artigo descreve a metodologia para determinar a resposta quimiotática de leucócitos para ligantes específicos e identificar as interações entre os receptores da superfície celular e as proteínas citosólicas usando técnicas de imagem de células vivas.