著者らは、国立科学財団を通じて、材料研究科学工学センターの一部として資金を供給ジョンズホプキンス、少なくとも表面分析実験室の使用を認めます。 LEDはIGERT研修生と国立科学財団大学院のフェローです。この研究は、部分的にNIHの助成金U54CA143868によってサポートされていました。

1。マイクロパターンスタンプ作製のための標準的なフォトリソグラフィー<ol><li>エタノールで新しいシリコンウエハをリンスし、空気の流れで水分を拭き取ります。ウェハを処理し、全体のプロセスの間に表面欠陥を防止するために鉗子を使用してください。 </li><li> SU - 2025ネガ型フォトレジストを塗布し、カバーウエハの表面を回転させるウエハを転送する。フォトレジストとウェーハの少なくとも80％をカバーしています。 3000rpmの時に30秒間続いて600rpmで10秒間スピンコート、。フォトレジストの感光性のために、前方にこの点から、部屋の照明をオフにしてください。 </li><li> 3分間95℃で&quot;ソフトベーク&quot;のためにホットプレートにコーティングされたシリコンウェハをフォトレジスト転送する。ホットプレートから外し、1分を冷却することができます。 </li><li>フォトレジストで覆われたシリコンウェハの上に所望のパターンを持つプレハブマスクを置き、20秒間紫外線（UV）照射（350〜450 nm）にさらす。 </li><li> 110&quot;ハードベーク&quot;のためのホットプレートに転送シリコンウエハ℃で6分間。 </li><li>ライトの電源を入れ、ホットプレートからウェハを取り外す。明確なパターンは、この時点で表示されるはずです。 </li><li>慎重にSU - 8フォトレジストの現像液でシリコンウエハをリンス。現像液の3洗浄した後、エタノールですすいでください。いずれかの白い残留物が存在する場合は、フォトレジスト現像液でリンス繰り返す、または単に水没ウエハを現像液で2分間とすすぎエタノールを進めます。水と空気乾燥で洗浄する。 </li><li>午前10時01分重量比で混合ポリジメチルシロキサン（PDMS）エラストマー溶液と硬化剤。気泡を除去するために5分間900rpmで遠心する。 </li><li>場所は、ペトリ皿の中でウェーハをパターニングしてシリコンウエハ上にPDMSを注ぐ。泡が消えるまで泡がカップル分間desicatorと真空の場所は、現在がある場合。 </li><li>補完的なエラストマーのスタンプを形成するために室温（RT）で一晩硬化する。 PDMSは、完全に30分間60℃のオーブンで行われる12時間、後硬化されていない場合。 </li><li>慎重にシリコンウエハからPDMSを削除します。希望のサイズにスタンプをカットするためにかみそりのエッジを使用してください。 15分間エタノールで超音波洗浄します。ウェーハは、新しいエラストマーのスタンプを作成するために複数回利用することができます。 </li></ol> 2。 HAのマイクロパターニング<ol><li> 5分間のプラズマ清浄なガラススライド。 5分間チャンバーと真空中にすべてのスライドを置きます。その後、酸素の低流量でチャンバーを入力することができます。 5分間のプラズマクリーナーを入れます。鉗子を用いてシャーレにプラズマクリーナーと場所から削除します。 </li><li>プラズマ洗浄の間に、15分間エタノールでPDMSスタンプを超音波で分解する。 </li><li> 15 mLの遠心管の95％v / vエタノールで3 - アミノプロピルトリメトキシシラン（APTMS）の新鮮な3パーセントv / v溶液を準備します。シラノールを形成するために室温で5分間反応することができます。 </li><li>パターンアップスピンコーターチャックとカバーの上に置いてPDMSスタンプは、APTMS液で表面をパターン化。 30秒間3500rpmでSpincoat。 PDMSスタンプの唯一の側面は、切手の表面に触れないでください。 </li><li>パターン化された側の一方の端に下向きにセットのスタンプを、それが1分間、ガラス表面に接触して完全になるように静かにPDMSを押すと、GLIDE：プラズマへ転送APTMSソリューションは、ガラス面を掃除した。 </li><li> PDMSは優しくスタンプと削除、およびパターン化されたスライドガラスは、30分間室温でインキュベートすることができます。エタノールと空気乾燥でパターン化表面を洗浄します。過剰APTMSを削除するには、15分間PDMSスタンプを超音波処理してください。 </li><li> 115℃で1時間オーブンでまたはホットプレート上に熱表面℃のエタノールでリンスし、空気で乾燥させます。 </li><li>トルエンの[メトキシ（ポリエチレンオキシ）プロピル]トリメトキシシラン - 新鮮なポリエチレングリコール（PEG） - シラン20パーセントV / V 2の溶液を調製します。これは、パターンを囲む非接着領域として機能します。 </li><li> 75℃で45分間、PEG -シラン溶液中でガラスシャーレのインキュベートに転送パターン化されたスライドガラスをホットプレート上に° C。トルエン、水、および空気と乾燥ですすいでください。 </li><li>生物学的安全キャビネット内の紫外線殺菌照射を使用して1時間滅菌する。無菌性を維持するために前方にこの時点から、生物学的安全キャビネットに進みます。 </li><li>水性滅菌HAソリューションを準備。 1 - エチル-3 - （3 - ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（EDC）の10mMの N -ヒドロキシスクシンイミドの5mMの 50μg/ mLのフルオレセイン標識HA </li><li>無菌状態でパターニングされたガラス基板にHAソリューションを適用し、光から保護。パターニングされた基板は、16〜24時間静にする必要があります。 </li><li> HAソリューションをオフ吸引、で洗浄し、リン酸緩衝生理食塩水を（PBS）、及び1時間PBSで（BSA）の1％ウシ血清アルブミンとの表面を覆う。表面は細胞培養の準備ができています。 </li></ol> 3。 HAマイクロパターン表面上における細胞培養<ol><li>製造業者の指示に従って、MDA - MB - 231ヒト乳癌細胞とLS174T大腸癌細胞を展開。 </li><li> 0.4 × 10の間に密度のがん細胞のシード単細胞懸濁液<sup18.75センチメートル2ガラスの表面積当たりとHA固定化表面へ&gt; 6癌細胞。 5％CO 2で維持雰囲気で加湿インキュベーター（37℃）でインキュベートする。細胞接着は、24時間以内に発生する必要がありますし、倒立光学顕微鏡を用いて観察することができます。 </li><li>細胞培養表面は、標準的なインキュベータの条件で5日間まで維持することができます。一日おきにメディアを変更します。細胞の形態と成長は、倒立光学顕微鏡を用いて観察することができます。追加の細胞アッセイは、HAの表面への応答を分析するために適用することができます。 </li></ol> 4。代表的な結果： 共有結合APTMSパターニングされたガラススライドにHAを固定するために使用されるカルボジイミド化学を図1Aに示されています。 EDCは、アミン反応性中間体を形成するために、HAのカルボキシル基と反応して長さゼロの架橋剤です。この中間体が加水分解を受けやすいとして、NHSは、カルボジイミド反応効率を高めるために追加されます。 HAソリューションはAPTMS微細パターン、HAの中間とATPMSの第一級アミンとの間の安定したアミド結合の形態と相互作用として。 HAパターン表面の例は、HAのパターン化された固定化を示す蛍光顕微鏡とImageJの蛍光強度の解析を用いて可視化（ 図1B - C）が表示されます。 HAマイクロパターン表面はexpgenous HAと癌細胞の相互作用の研究を可能にします。 MDA - MB - 231ヒト乳癌とLS174Tヒト大腸癌細胞株の両方が優先的にHAマイクロパターン領域（ 図2）に従っている。走査型電子顕微鏡を用いた高分解能イメージングは、HA固定化表面（ 図3）による培養細胞の相互作用を分析するために使用することができます。 <img src="/files/ftp_upload/2413/2413fig1.jpg" alt="図1" /> 図1 HAマイクロパターン表面のHA機能面の開発を記述する（）回路図、フルオレセインの（B）蛍光画像（緑）で標識されたHAマイクロパターン化表面。離散的なHAのパターンを示すImageJのソフトウェアを使用して（C）3Dピクセルの分布図。スケールバー=100μmの。エルゼビアから許可を得て9日から変更。 <img src="/files/ftp_upload/2413/2413fig2.jpg" alt="図2" /> HAマイクロパターン表面上に図2。癌細胞接着。コロン（）と乳房（B）癌が優先的に文化の24時間とHAのパッチに付着両方。エルゼビアから許可を得て9日から変更。 <img src="/files/ftp_upload/2413/2413fig3.jpg" alt="図3" /> HAと図3。癌細胞の相互作用。 （A）大腸癌細胞の低倍率（左）と高倍率（右、左の上の正方形の）に示すように、HAの表面上に（）培養の電子顕微鏡像を走査し、乳癌細胞の（B）に示すように、HA表面上で培養低倍率（左）と高倍率（右、左の上の正方形の）。

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	<li>Toole, B. P., Wight, T. N., Tammi, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan-cell+interactions+in+cancer+and+vascular+disease.">Hyaluronan-cell interactions in cancer and vascular disease.</a> Journal of Biological Chemistry. 277, 4593-4596 (2002).</li><li>Hamilton, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hyaluronan+Receptors+CD44+and+Rhamm+(CD168)+Form+Complexes+with+ERK1,2+That+Sustain+High+Basal+Motility+in+Breast+Cancer+Cells.">The Hyaluronan Receptors CD44 and Rhamm (CD168) Form Complexes with ERK1,2 That Sustain High Basal Motility in Breast Cancer Cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 16667-16680 (2007).</li><li>G&#246;tte, M., Yip, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparanase,+Hyaluronan,+and+CD44+in+Cancers:+A+Breast+Carcinoma+Perspective.">Heparanase, Hyaluronan, and CD44 in Cancers: A Breast Carcinoma Perspective.</a> Cancer Research. 66, 10233-10237 (2006).</li><li>Lord, M. S., Pasqui, D., Barbucci, R., Milthorpe, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+adsorption+on+derivatives+of+hyaluronic+acid+and+subsequent+cellular+response.">Protein adsorption on derivatives of hyaluronic acid and subsequent cellular response.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part A 91, 635-646 (2009).</li><li>Barbucci, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+hyaluronic+acid+by+sulphate+groups+insertion+to+obtain+a+heparin-like+molecule.">Modification of hyaluronic acid by sulphate groups insertion to obtain a heparin-like molecule.</a> Gazz. Chim. Ital. 125, 169-180 (1995).</li><li>Morra, M., Cassinelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-fouling+properties+of+polysaccharide-coated+surfaces.">Non-fouling properties of polysaccharide-coated surfaces.</a> Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 10, 1107-1124 (1999).</li><li>Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-by-layer+deposition+of+hyaluronic+acid+and+poly-L-lysine+for+patterned+cell+co-cultures.">Layer-by-layer deposition of hyaluronic acid and poly-L-lysine for patterned cell co-cultures.</a> Biomaterials. 25, 3583-3592 (2004).</li><li>Ibrahim, S., Joddar, B., Craps, M., Ramamurthi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+surface-tethered+model+to+assess+size-specific+effects+of+hyaluronan+(HA)+on+endothelial+cells.">A surface-tethered model to assess size-specific effects of hyaluronan (HA) on endothelial cells.</a> Biomaterials. 28, 825-835 (2007).</li><li>Dickinson, L. E., Ho, C. C., Wang, G. M., Stebe, K. J., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+surfaces+for+high-resolution+analysis+of+cancer+cell+interactions+on+exogenous+hyaluronic+acid.">Functional surfaces for high-resolution analysis of cancer cell interactions on exogenous hyaluronic acid.</a> Biomaterials. 31, 5472-5478 (2010).</li><li>Gao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan+oligosaccharides+promote+excisional+wound+healing+through+enhanced+angiogenesis.">Hyaluronan oligosaccharides promote excisional wound healing through enhanced angiogenesis.</a> Matrix Biology. 29, 107-116 (2010).</li><li>Slevin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan-mediated+angiogenesis+in+vascular+disease:+Uncovering+RHAMM+and+CD44+receptor+signaling+pathways.">Hyaluronan-mediated angiogenesis in vascular disease: Uncovering RHAMM and CD44 receptor signaling pathways.</a> Matrix Biology. 26, 58-68 (2007).</li></ol>

許可を得て複製したビデオの概略図;著作権ワイリー- VCH出版社＆Co KGaA社。ディッキンソンLE、マラヤS、生体材料を使用して、胚性幹細胞の分化のニッチを再構築Gerecht S.。 Macromol。バイオサイエンス。 2010; 10月21日。 [印刷の前にトップ|]。

提示HAの微細方法は、外因性HAと細胞の相互作用の研究が可能になります。 HAは、癌の進行1に重要な役割を果たすことが知られているしかし、二次元のHAパターニング表面上での癌細胞の相互作用を調査する限られた研究が行われている。外因性HAの微細パターンで制御可能研究は癌細胞の接着、成長、および移行の高解像度可視化を可能にし、癌のさらなる基礎を解明することがで?...

<table><tbody><tr><td>SU-2025 photoresist</td><td>MicroChem Corp.</td><td>Y111069</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 developer</td><td>MicroChem Corp.</td><td>Y020100</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778</td><td></td></tr><tr><td>2- [methoxy(polyethyleneoxy) propyl] trimethoxysilane (Peg-silane)</td><td>Gelest Inc.</td><td>SIM6492.7</td><td></td></tr><tr><td>1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>N-hydroxysuccinimide (NHS)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>24500</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein labeled hyaluronic acid (FL-HA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1177</td><td>Reconstitute with 10ml of DI water </td></tr><tr><td>MDA-MB-231 breast carcinoma cells</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>LS174t colon carcinoma cells</td><td>ATCC</td><td>Cl-188</td><td></td></tr></tbody></table>

micropatterned surfaces to study hyaluronic acid interactions with cancer cells

癌の浸潤や進行は、腫瘍の微小環境内での増殖因子/サイトカインや細胞外マトリックス（ECM）成分による複雑な規制下にある運動性細胞の表現型を伴います。ヒアルロン酸（HA）は、強化の侵入、増殖、および血管新生1で腫瘍の進行を容易にするために確認されている間質ECMコンポーネントです。その細胞表面の受容体CD44とHAの相互作用は、それによって転移拡散2-3増加、腫瘍細胞の増殖、生存、および移行を促進するシグナル伝達事象を誘導する。 HAは、D -グルクロン酸とDN -アセチルグルコサミンの繰り返し単位から構成される陰イオン性、nonsulfatedグリコサミノグリカンである。 、二糖繰り返し単位のカルボキシル及びヒドロキシル基の存在のためにネイティブHAの大部分は親水性とphotoreative固定化4-5硫酸基を導入する化学修飾の影響を受けやすいです。表面にHAの固定化を含むこれまでの研究では6-7表面上に細胞接着を制御するために、HAのbioresistant挙動とその硫酸化誘導体を利用する。これらの研究では細胞接着には、優先的に非HA模様の領域で発生します。 外因性のHAと細胞間相互作用を分析するために、我々は、制御の研究とHAと癌細胞の相互作用の高解像度可視化を可能にするパターン化された官能化された表面を開発しました。我々は、ガラスの表面にHAの離散パターン領域を定義するためにマイクロコンタクトプリンティング（UCP）を利用。 HAを固定化するカルボジイミドリンク化学を適用する&quot;テザリング&quot;のアプローチは8を使用しました。ガラスの表面は、マイクロコンタクトをアミノシランで印刷し、パターン化された配列にHA固定化を有効にするEDCとNHSの最適比率のHA溶液と反応させた。 MCPを搭載したカルボジイミド化学を組み込むと、in vitroでのアプリケーションに適したサーフェスを作成、定義された領域にHAの固定化を可能にした。両方の結腸癌細胞および乳癌細胞は、暗黙的にHAマイクロパターン表面と相互作用した。癌細胞の接着は、48時間で増殖して24時間以内に起こった。 HAマイクロパターン表面を使用して、我々は癌細胞の接着は、HA受容体CD44を介して起こることを示した。さらに、HA柄の表面は電子顕微鏡（SEM）と癌細胞の接着剤の突起の許容される高解像度の画像をスキャンし、外因性のHA上で癌細胞の運動性を分析するためにHAパターンで拡散との互換性があった。

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Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

外因性ヒアルロン酸（HA）と癌細胞の相互作用の高分解能解析を可能にする斬新なアプローチが説明されています。パターニングされた表面は、カルボジイミド化学とマイクロコンタクトプリンティングを組み合わせることによって作製されています。

癌細胞とヒアルロン酸の相互作用を研究するマイクロパターン表面

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix ...

micropatterned-surfaces-to-study-hyaluronic-acid-interactions-with

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.0K ビュー.  Johns Hopkins University. 外因性ヒアルロン酸（HA）と癌細胞の相互作用の高分解能解析を可能にする斬新なアプローチが説明されています。パターニングされた表面は、カルボジイミド化学とマイクロコンタクトプリンティングを組み合わせることによって作製されています。

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Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated micro-plates. Under these conditions, cells spread and divide in all directions resulting in an inherent variability in cell shape, morphology and behavior. The high cell-to-cell variance of the overall population impedes the success of HCA, especially for drug development. The ability of micropatterns to normalize the shape and internal polarity of every individual cell provides a tremendous opportunity for solving this critical bottleneck 1-2.
To facilitate access and use of the micropatterning technology, CYTOO has developed a range of ready to use micropatterns, available in coverslip and microwell formats. In this video article, we provide detailed protocols of all the procedures from cell seeding on CYTOOchip micropatterns, drug treatment, fixation and staining to automated acquisition, automated image processing and final data analysis. With this example, we illustrate how micropatterns can facilitate cell-based assays. Alterations of the cell cytoskeleton are difficult to quantify in cells cultured on homogenous substrates, but culturing cells on micropatterns results in a reproducible organization of the actin meshwork due to systematic positioning of the cell adhesion contacts in every cell. Such normalization of the intracellular architecture allows quantification of even small effects on the actin cytoskeleton as demonstrated in these set of protocols using blebbistatin, an inhibitor of the actin-myosin interaction.

Adhesive micropatterns that normalize cellular architecture can be used to increase sensitivity in the detection of drug effects, improve reproducibility and simplify automated image acquisition and analysis. Such technology will benefit drug/siRNA screening assays, performed on conventional cell culture supports and consequently suffering from excessive cell-to-cell variability.

マイクロパターン細胞を用いた薬物の効果の改善可視化と定量分析

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated ...

生物工学

Characterization of Cell Membrane Extensions and Studying Their Roles in Cancer Cell Adhesion Dynamics

The cell membrane&#39;s extension repertoire modulates various malignant behaviors of cancer cells, including their adhesive and migratory potentials. The ability to accurately classify and quantify cell extensions and measure the effect on a cell&#39;s adhesive capacity is critical to determining how cell-signaling events impact cancer cell behavior and aggressiveness. Here, we describe the in vitro design and use of a cell extension quantification method in conjunction with an adhesion capacity assay in an established in vitro model for adrenocortical carcinoma (ACC). Specifically, we test the effects of DKK3, a putative tumor suppressor and a pro-differentiation factor, on the membrane extension phenotype of the ACC cell line, SW-13. We propose these assays to provide relatively simple, reliable, and easily interpretable metrics to measures these characteristics under various experimental conditions.

This study demonstrates the utility and ease of quantitative cell membrane extension measurement and its correlation to adhesive capacity of cells. As a representative example, we show here that Dickkopf-related protein 3 (DKK3) promotes increased lobopodia formation and cell adhesiveness in adrenocortical carcinoma cells in vitro.

細胞膜の拡張機能と癌細胞の接着の役割を勉強のキャラクタリゼーション

The cell membrane&#39;s extension repertoire modulates various malignant behaviors of cancer cells, including their adhesive and migratory potentials. The ...

がん研究

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array (HMCA)-based Plates

Cancer metastasis is known to cause 90% of cancer lethality. Metastasis is a multistage process which initiates with the penetration/invasion of tumor cells into neighboring tissue. Thus, invasion is a crucial step in metastasis, making the invasion process research and development of anti-metastatic drugs, highly significant. To address this demand, there is a need to develop 3D in vitro models which imitate the architecture of solid tumors and their microenvironment most closely to in vivo state on one hand, but at the same time be reproducible, robust and suitable for high yield and high content measurements. Currently, most invasion assays lean on sophisticated microfluidic technologies which are adequate for research but not for high volume drug screening. Other assays using plate-based devices with isolated individual spheroids in each well are material consuming and have low sample size per condition. The goal of the current protocol is to provide a simple and reproducible biomimetic 3D cell-based system for the analysis of invasion capacity in large populations of tumor spheroids. We developed a 3D model for invasion assay based on HMCA imaging plate for the research of tumor invasion and anti-metastatic drug discovery. This device enables the production of numerous uniform spheroids per well (high sample size per condition) surrounded by ECM components, while continuously and simultaneously observing and measuring the spheroids at single-element resolution for medium throughput screening of anti-metastatic drugs. This platform is presented here by the production of HeLa and MCF7 spheroids for exemplifying single cell and collective invasion. We compare the influence of the ECM component hyaluronic acid (HA) on the invasive capacity of collagen surrounding HeLa spheroids. Finally, we introduce Fisetin (invasion inhibitor) to HeLa spheroids and nitric oxide (NO) (invasion activator) to MCF7 spheroids. The results are analyzed by in-house software which enables semi-automatic, simple and fast analysis which facilitates multi-parameter examination.

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array HMCA-based Plates

A HMCA-based imaging plate is presented for invasion assay performance. This plate facilitates the formation of three-dimensional (3D) tumor spheroids and the measurement of cancer cell invasion into the extracellular matrix (ECM). The invasion assay quantification is achieved by semi-automatic analysis.

がん細胞の浸潤と転移防止薬剤のスクリーニングのハイドロゲル マイクロチャンバー アレイを用いた (HMCA) の解析-ベース プレート

Cancer metastasis is known to cause 90% of cancer lethality. Metastasis is a multistage process which initiates with the penetration/invasion of tumor ...

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological studies. In the past years, it has become increasingly clear that living cells respond, not only to the biochemical nature of the molecules presented to them but also to the way these molecules are presented. Creating protein micro-patterns is therefore now standard in many biology laboratories; nano-patterns are also more accessible. However, in the context of cell-cell interactions, there is a need to pattern not only proteins but also lipid bilayers. Such dual proteo-lipidic patterning has so far not been easily accessible. We offer a facile technique to create protein nano-dots supported on glass and propose a method to backfill the inter-dot space with a supported lipid bilayer (SLB). From photo-bleaching of tracer fluorescent lipids included in the SLB, we demonstrate that the bilayer exhibits considerable in-plane fluidity. Functionalizing the protein dots with fluorescent groups allows us to image them and to show that they are ordered in a regular hexagonal lattice. The typical dot size is about 800 nm and the spacing demonstrated here is 2 microns. These substrates are expected to serve as useful platforms for cell adhesion, migration and mechano-sensing studies.

We present a protocol to functionalize glass with nanometric protein patches surrounded by a fluid lipid bilayer. These substrates are compatible with advanced optical microscopy and are expected to serve as platform for cell adhesion and migration studies.

サポートされている脂質二重層中のリガンドナノクラスター配列

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of methodological options for addressing molecular interactions in cells have been developed, but most of these methods suffer from being rather indirect and therefore hardly quantitative. On the contrary, a few high-end quantitative approaches were introduced, which however are difficult to extend to high throughput. To combine high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information, we recently developed a new concept for identifying protein-protein interactions (Schwarzenbacher et al., 2008). Here, we describe a detailed protocol for the design and the construction of this system which allows for analyzing interactions between a fluorophore-labeled protein ("prey") and a membrane protein ("bait") in-vivo. Cells are plated on micropatterned surfaces functionalized with antibodies against the bait exoplasmic domain. Bait-prey interactions are assayed via the redistribution of the fluorescent prey. The method is characterized by high sensitivity down to the level of single molecules, the capability to detect weak interactions, and high throughput capability, making it applicable as screening tool.

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

This video shows experiments with subsequent analysis of protein-protein interactions by the use of micro-patterned surfaces. The approach offers the possibility to detect protein interactions in living cells and combines high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information.

マイクロパターン化表面でのタンパク質間相互作用の in vivo検出

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

生物学

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly controlled, high-throughput engineered system for measuring the impact of arrayed biochemical signals on cell differentiation. Recent efforts using cell microarrays have demonstrated their utility for combinatorial studies in which many microenvironmental factors are presented in parallel. However, these efforts have focused primarily on investigating the effects of biochemical cues on cell responses. Here, we present a cell microarray platform with tunable material properties for evaluating both cell differentiation by immunofluorescence and biomechanical cell&#8211;substrate interactions by traction force microscopy. To do so, we have developed two different formats utilizing polyacrylamide hydrogels of varying Young&#39;s modulus fabricated on either microscope slides or glass-bottom Petri dishes. We provide best practices and troubleshooting for the fabrication of microarrays on these hydrogel substrates, the subsequent cell culture on microarrays, and the acquisition of data. This platform is well-suited for use in investigations of biological processes for which both biochemical (e.g., extracellular matrix composition) and biophysical (e.g., substrate stiffness) cues may play significant, intersecting roles.

Cell differentiation is regulated by a host of microenvironmental factors, including both matrix composition and substrate material properties. We describe here a technique utilizing cell microarrays in conjunction with traction force microscopy to evaluate both cell differentiation and biomechanical cell&#8211;substrate interactions as a function of microenvironmental context.

細胞の分化やトラクション軍の相関的分析のためのハイスループット細胞マイクロアレイプラットフォーム

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Dendrimer-based Uneven Nanopatterns to Locally Control Surface Adhesiveness: A Method to Direct Chondrogenic Differentiation

Cellular adhesion and differentiation is conditioned by the nanoscale disposition of the extracellular matrix (ECM) components, with local concentrations having a major effect. Here we present a method to obtain large-scale uneven nanopatterns of arginine-glycine-aspartic acid (RGD)-functionalized dendrimers that permit the nanoscale control of local RGD surface density. Nanopatterns are formed by surface adsorption of dendrimers from solutions at different initial concentrations and are characterized by water contact angle (CA), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS), and scanning probe microscopy techniques such as scanning tunneling microscopy (STM) and atomic force microscopy (AFM). The local surface density of RGD is measured using AFM images by means of probability contour maps of minimum interparticle distances and then correlated with cell adhesion response and differentiation. The nanopatterning method presented here is a simple procedure that can be scaled up in a straightforward manner to large surface areas. It is thus fully compatible with cell culture protocols and can be applied to other ligands that exert concentration-dependent effects on cells.

A method to obtain dendrimer-based uneven nanopatterns that permit the nanoscale control of local arginine-glycine-aspartic acid (RGD) surface density is described and applied for the study of cell adhesion and chondrogenic differentiation.

ローカル制御表面密着性にデンドリマーを用いた不均一な Nanopatterns: 軟骨細胞分化を指示する方法

Cellular adhesion and differentiation is conditioned by the nanoscale disposition of the extracellular matrix (ECM) components, with local concentrations ...

Evaluation of the Interplay Between the Complement Protein C1q and Hyaluronic Acid in Promoting Cell Adhesion

It has been increasingly demonstrated that the tumor microenvironment plays an active role in neoplasia growth and metastasis. Through different pathways, tumor cells can efficiently recruit stromal, immune and endothelial cells by secreting stimulatory factors, chemokines and cytokines. In turn, these cells can alter the signaling properties of the microenvironment by releasing growth-promoting signals, metabolites and extracellular matrix components to sustain high proliferation and metastatic competence. In this context, we identify that the complement component C1q, highly expressed locally by a range of human malignant tumors, upon interacting with the extracellular matrix hyaluronic acid, strongly affects the behavior of primary cells isolated from human tumor specimens. Here, we describe&#160;a method to test how C1q bound to hyaluronic acid (HA) impacts tumor cell adhesion, underlying the fact that the biological properties of key components of the extracellular matrix (in this case HA) can be shaped by bioactive signals toward tumor progression.

The complement component C1q is a pro-inflammatory molecule highly expressed in the tissue microenvironment that can interact with the extracellular matrix. Here, we describe&#160;a method to test how C1q bound to hyaluronic acid impacts cell adhesion.

細胞接着促進における補体タンパク質C1qとヒアルロン酸間の相互作用の評価

It has been increasingly demonstrated that the tumor microenvironment plays an active role in neoplasia growth and metastasis. Through different pathways, ...

免疫・感染学

Control of Cell Adhesion using Hydrogel Patterning Techniques for Applications in Traction Force Microscopy

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat soft substrates that deform under cell traction (2D-TFM). TFM relies on the use of linear elastic materials, such as polydimethylsiloxane (PDMS) or polyacrylamide (PA). For 2D-TFM on PA, the difficulty in achieving high throughput results mainly from the large variability of cell shapes and tractions, calling for standardization. We present a protocol to rapidly and efficiently fabricate micropatterned PA hydrogels for 2D-TFM studies. The micropatterns are first created by maskless photolithography using near-UV light where extracellular matrix proteins bind only to the micropatterned regions, while the rest of the surface remains non-adhesive for cells. The micropatterning of extracellular matrix proteins is due to the presence of active aldehyde groups, resulting in adhesive regions of different shapes to accommodate either single cells or groups of cells. For TFM measurements, we use PA hydrogels of different elasticity by varying the amounts of acrylamide and bis-acrylamide and tracking the displacement of embedded fluorescent beads to reconstruct cell traction fields with regularized Fourier Transform Traction Cytometry (FTTC).
To further achieve precise recording of cell forces, we describe the use of a controlled dose of patterned light to release cell tractions in defined regions for single cells or groups of cells. We call this method local UV illumination traction force microscopy (LUVI-TFM). With enzymatic treatment, all cells are detached from the sample simultaneously, whereas with LUVI-TFM traction forces of cells in different regions of the sample can be recorded in sequence. We demonstrate the applicability of this protocol (i) to study cell traction forces as a function of controlled adhesion to the substrate, and (ii) to achieve a greater number of experimental observations from the same sample.

Near-UV lithography and traction force microscopy are combined to measure cellular forces on micropatterned hydrogels. The targeted light-induced release of single cells enables a high number of measurements on the same sample.

牽引力顕微鏡における応用のためのハイドロゲルパターン法を用いた細胞接着制御

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat ...

Pattern Generation for Micropattern Traction Microscopy

Micropattern traction microscopy allows control of the shape of single cells and cell clusters. Furthermore, the ability to pattern at the micrometer length scale allows the use of these patterned contact zones for the measurement of traction forces, as each micropatterned dot allows for the formation of a single focal adhesion that then deforms the soft, underlying hydrogel. This approach has been used for a wide range of cell types, including endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts, platelets, and epithelial cells. 
This review describes the evolution of techniques that allow the printing of extracellular matrix proteins onto polyacrylamide hydrogels in a regular array of dots of prespecified size and spacing. As micrometer-scale patterns are difficult to directly print onto soft substrates, patterns are first generated on rigid glass coverslips that are then used to transfer the pattern to the hydrogel during gelation. First, the original microcontact printing approach to generate arrays of small dots on the coverslip is described. A second step that removes most of the pattern to leave islands of small dots is required to control the shapes of cells and cell clusters on such arrays of patterned dots. 
Next, an evolution of this approach that allows for the generation of islands of dots using a single subtractive patterning step is described. This approach is greatly simplified for the user but has the disadvantage of a decreased lifetime for the master mold needed to make the patterns. Finally, the computational approaches that have been developed for the analysis of images of displaced dots and subsequent cell-generated traction fields are described, and updated versions of these analysis packages are provided.

We describe improvements to a standard method for measuring cellular traction forces, based on microcontact printing with a single subtractive patterning step of dot arrays of extracellular matrix proteins on soft hydrogels. This method allows for simpler and more consistent fabrication of island patterns, essential for controlling cell cluster shape.

マイクロパターントラクション顕微鏡のパターン生成

Micropattern traction microscopy allows control of the shape of single cells and cell clusters. Furthermore, the ability to pattern at the micrometer ...

癌細胞とヒアルロン酸の相互作用を研究するマイクロパターン表面

要約

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マイクロパターン細胞を用いた薬物の効果の改善可視化と定量分析

細胞膜の拡張機能と癌細胞の接着の役割を勉強のキャラクタリゼーション

がん細胞の浸潤と転移防止薬剤のスクリーニングのハイドロゲルマイクロチャンバーアレイを用いた (HMCA) の解析-ベースプレート

サポートされている脂質二重層中のリガンドナノクラスター配列

マイクロパターン化表面でのタンパク質間相互作用の in vivo検出

細胞の分化やトラクション軍の相関的分析のためのハイスループット細胞マイクロアレイプラットフォーム

ローカル制御表面密着性にデンドリマーを用いた不均一な Nanopatterns: 軟骨細胞分化を指示する方法

細胞接着促進における補体タンパク質C1qとヒアルロン酸間の相互作用の評価

牽引力顕微鏡における応用のためのハイドロゲルパターン法を用いた細胞接着制御

マイクロパターントラクション顕微鏡のパターン生成

癌細胞とヒアルロン酸の相互作用を研究するマイクロパターン表面

要約

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マイクロパターン細胞を用いた薬物の効果の改善可視化と定量分析

細胞膜の拡張機能と癌細胞の接着の役割を勉強のキャラクタリゼーション

がん細胞の浸潤と転移防止薬剤のスクリーニングのハイドロゲル マイクロチャンバー アレイを用いた (HMCA) の解析-ベース プレート

サポートされている脂質二重層中のリガンドナノクラスター配列

マイクロパターン化表面でのタンパク質間相互作用の in vivo検出

細胞の分化やトラクション軍の相関的分析のためのハイスループット細胞マイクロアレイプラットフォーム

ローカル制御表面密着性にデンドリマーを用いた不均一な Nanopatterns: 軟骨細胞分化を指示する方法

細胞接着促進における補体タンパク質C1qとヒアルロン酸間の相互作用の評価

牽引力顕微鏡における応用のためのハイドロゲルパターン法を用いた細胞接着制御

マイクロパターントラクション顕微鏡のパターン生成

がん細胞の浸潤と転移防止薬剤のスクリーニングのハイドロゲルマイクロチャンバーアレイを用いた (HMCA) の解析-ベースプレート