このプロトコルは、どのような形状の忠実度の高いタンパク質マイクロパターン、特に細胞クラスターの研究のための孤立した島のパターンの一貫した作成を可能にする。この技術は、任意の形状とサイズの孤立島のマイクロパターンを1つのステップで作成するために使用できますが、以前はそのようなパターンを作るには2つの別々のステップが必要でした。まず、製造元の説明書に記載されているように、PDMSを正しい硬化剤対塩基比で混合することから始めます。
室温および圧力で15分間インキュベートし、次いで混合物を真空下で15分間脱気する。PDMSをマスターモールドに注ぎ、摂氏37度に設定したインキュベーターに移して一晩硬化させます。マスターモールドをインキュベーターから取り外し、室温まで冷却します。
マスターモールドが冷却されている間、25ミリメートルのカバースリップをエタノール中で10分間超音波処理します。準備する切手の数だけカバースリップを使用してください。カバースリップをDI水で十分にすすぎ、ろ過されたエアガンを使用して乾燥させます。
カバースリップをプラズマで1分間処理し、プラズマクリーナーを高真空下で処理します。カバースリップがチャンバー内で移動するのを防ぐために、処理後にゆっくりと真空を解除します。直射日光や頭上の照明のない部屋で、各カバースリップを100マイクロリットルの蛍光標識タンパク質溶液でコーティングします。
光からさらに保護するためにサンプルを覆い、室温で20分間インキュベートします。各カバースリップをDI水で十分にすすいでください。各カバースリップの側面をペーパータオルまたは同様の吸収材に軽く叩いて、表面から余分な水分を取り除きます。
カバースリップを少なくとも30分間暗闇の中で覆い隠したままにして、完全に乾かします。タンパク質コーティングされたカバースリップが乾いたら、メスまたは鋭い刃で切断して、PDMSスタンプをマスターモールドから取り外します。PDMSスタンプをプラズマで高真空下で2分間処理します。
ヒュームフードの下に蓋をした容器にスタンプを入れ、各スタンプを100%エタノールで希釈した10%3-APTMSの薄層でコーティングします。容器をスタンプで覆い、室温で5分間インキュベートする。両面の各スタンプをDI水で十分にすすいでください。
スタンプを清潔な容器に入れ、DI水で調製した2.5%グルタルアルデヒドでコーティングします。スタンプを覆い、室温で30分間インキュベートします。スタンプをDI水で十分にすすいでください。
前述のように表面から余分な水分を取り除き、スタンプを30分間乾燥させます。30分経過してもタンパク質コーティングされたカバースリップまたはスタンプが完全に乾燥しない場合は、ろ過されたエアガンを使用して完全に乾燥させます。スタンプのパターン側をカバースリップに押し込み、完全に接触するのに十分な圧力をかけます。
15分間邪魔されずに放置してください。次に、PDMSスタンプをカバースリップから慎重に剥がします。適切なフィルターを備えた蛍光顕微鏡を使用して、パターン化されたカバースリップの忠実度を確認します。
パターン化されたカバースリップはすぐに使用するか、さらに使用するまで直接光から遠ざけて保管してください。PAAヒドロゲル前駆体を調製する前に、アクリル酸NHSエステルを冷蔵庫から取り出して、開放される前に室温に達する。交換可能なカバースリップ皿セットを70%エタノールで滅菌して準備し、使用前にバイオセーフティキャビネット内のUV光の下で少なくとも30分間インキュベートする。
ヒュームフードの下で、DI水中で調製した1.25ミリリットルの40%アクリルアミドを15ミリリットルの円錐管に加える。同じチューブに、DI水中で調製した175マイクロリットルのビスアクリルアミド溶液を加える。次に、500マイクロリットルの10X PBSを加え、続いて2.915ミリリットルのDI水を加える。
この前駆体の969マイクロリットルを1.5ミリリットルの微量遠心チューブにピペットし、残りを摂氏4度で最大2週間保存します。新鮮な微量遠心チューブで50〜100ミリグラムのAPSを測定し、DI水で1ミリリットルあたり100ミリグラムに希釈します。フード内のNHSエステルを開き、微量遠心チューブで最大3ミリグラムのNHSを慎重に測定します。
NHSエステルを1倍PBSで1ミリリットルあたり1ミリグラムに希釈する。ヒュームフードの下で、2マイクロリットルのTEMEDを、PAA前駆体の969マイクロリットルアリコートを含むマイクロ遠心管に加える。1モルのHCLを15マイクロリットル加えて、ヒドロゲル溶液のpHを低下させ、NHSエステルの加水分解を避ける。
10マイクロリットルのNHSエステル溶液をチューブに加える。バイオセーフティキャビネットで次の手順を実行します。3-APTMSとグルタルアルデヒド処理された側面を上にしてセットされたカバースリップ皿の中央部に30ミリメートルのカバースリップを慎重に置き、プラスチックリングを上にねじ込みます。
パターン化されたカバースリップを最小限の光露光でセットアップして、次のステップに備えます。5マイクロリットルのAPS溶液をPAA前駆体アリコートチューブにピペットし、次いで反転させて混合する。直ちにこの溶液35マイクロリットルを30ミリメートルのカバースリップ上にピペットする。
パターン化されたカバースリップを、タンパク質側を下にして溶液の上に置きます。ヒドロゲル中に気泡を生じさせないように注意してください。ヒドロゲルを光から保護し、90分間重合させる。
ヒドロゲルが重合したら、カミソリの刃またはメスを使用して上部カバースリップを取り外し、一度取り外したカバースリップがゲルから落ちたり滑り落ちたりしないようにして、ゲル表面のパターンを台無しにしないようにします。ヒドロゲル中の残りのNHSエステルを不動態化するために、2ミリリットルの滅菌PBSをゲルに加え、摂氏37度で45分間インキュベートする。直ちに実験用のゲルを準備するか、さらに使用するまで摂氏4度の滅菌PBSに一晩保存してください。
ヒドロゲルを蛍光フィブロネクチンで間接的にパターン化して、クラスター内の細胞牽引力を視覚化および測定し、所定のサイズおよび形状の島パターンを作成した。パターンの品質は、PDMSスタンプが鋳造されたマスターモールドの忠実度に直接関係していました。この方法は、所定の形状の孤立した、明確に定義された島パターンを作製することができる。
フィブロネクチン接着ドットは、島の所望の領域内にのみ存在していた。これらの孤立した島状の接着ドットは、さらに、クラスター形状のより良好な制御を可能にした。PDMSスタンプを2つの小さな3-APTMSでコーティングすると、除去方法の有効性が制限され、多すぎるとスタンプ表面にオレンジ色の残留物が作成されるため、非常に重要です。
ここで作成されたパターンは、個々の細胞とクラスターの両方における細胞牽引力を決定するために使用でき、機械的恒常性を維持する能力についての洞察を与える。
