これは、小腸がさまざまな物理的性質の材料をどのように扱い、それらの物質を空間にどのように分配するかを研究するプロトコルです。これは、腸の機械感受性の研究における補完的なツールです。このプロトコルの主な利点は、異なる物理的特性を持つ材料または混合物の研究に使用できること、および分解能により、短い腸セグメントにわたる局所的な通過を解決できることです。
この手法は、腸の機械感受性の理解を深めます。これは、小腸が管腔内内容物から受け取る機械的手がかりに基づいてどのように通過決定を行うかを理解するのに役立ちます。まず、厚さ18ゲージ、長さ50ミリメートルの栄養チューブを1ミリリットルのシリンジに取り付け、200マイクロリットルのRITC溶液またはマイクロスフェア溶液を吸引して、経管栄養を準備します。
次に、片手拘束技術を使用して絶食した動物を手動で拘束し、次にマウスの口と食道から胃に入るまで栄養チューブを静かに挿入します。挿入したら、シリンジの内容物をゆっくりと胃の中に排出し、マウスからチューブを慎重に取り外します。経管栄養の後、マウスをケージに戻します。
解剖を開始する前に、in vivoイメージング機器の電源を入れて、目的の温度に到達します。安楽死後、マウスを解剖ステージの仰臥位に置き、その4つの付属肢をステージに固定して腹部にアクセスします。次に、腹部の表面を70%エタノールで濡らします。
次に、微小解剖鉗子を使用して皮膚を引っ張り、肛門の1センチ上の鋭利な外科用ハサミを使用して横切開を行います。腹腔を露出させるには、胸郭まで腹部を垂直に切開し続けます。腸を優しく扱い、操作する前に腹腔内での向きを理解してください。
胃食道接合部への近位を切断し、胃を食道から分離し、反対方向にゆっくりと引っ張って結腸、盲腸、小腸を静かに解きます。マイクロ解剖はさみを使用して、腸間膜の腸への付着を分離します。その後、鉗子を使用して、解剖した腸を測定シートに移します。
胃を0ミリメートルに置き、定規に沿って腸を200ミリメートルまで配置してから、マイクロ解剖ハサミで腸を200ミリメートルで切断し、腸の位置合わせのこの手順を繰り返します。組織が定規に配置されたら、盲腸を組織と平行に配置しますが、直接接触しないようにします。解剖した組織を含む測定シートを暗い領域に置いて、画像化する時間になるまで蛍光を保存できるようにします。
ex vivoイメージングを開始するには、イメージングソフトウェアを開きます。ログインして撮像装置を初期化し、画像取得の準備をします。RITC経管栄養の場合は、励起を535ナノメートル、放射を600ナノメートルに設定します。
一方、緑色のミクロスフェアビーズの場合は、[励起]を465ナノメートル、[発光]を520ナノメートルに設定します。次に、露出を自動に設定し、視野を選択します。輸送中に腸がずれていないことを確認した後、測定シートを視野内の機器に配置します。
機器のドアをしっかりと閉め、[スナップショット]を選択して視野を撮影します。収集した画像を分析のためにフラッシュドライブに保存します。次に、蛍光画像と写真画像の個々のキャプチャを保存します。
写真と蛍光のオーバーレイは、胃腸管内の蛍光物質の位置を示します。蛍光灯と写真の画像ファイルを画像編集ソフトウェアで開いて分析します。両方の画像のピクセルサイズを調整して正確なサイズにし、写真ファイルを閉じます。
蛍光画像の場合は、消しゴムツールを使用して背景を削除し、透明にします。新しいレイヤーを作成します。レイヤーの黒の塗りつぶしを選択し、レイヤーをドラッグして蛍光画像のあるレイヤーの下に置き、完全に黒い背景を作成します。
黒い背景に蛍光シグナルのみを含む新しい蛍光画像を新しいTIFファイルとして保存します。ImageJで新しい蛍光画像と写真画像を開きます。各画像を 30 ビット イメージに変換するには、[イメージ]、[種類]、[30 ビット] の順に選択します。
両方の結合画像を作成するには、「画像」を選択してから、「カラー」と「チャンネルを結合」を選択します。開いたダイアログボックスで、灰色チャンネルの写真ファイルと蛍光ファイルを選択します 任意の色チャンネルの下.結合された画像のスケールをオフにするには、[分析]、[スケールの設定]、[クリックしてスケールの削除]の順に選択します。
ImageJ の長方形ツールを選択します。小腸の一部の周りに長方形を描きながら、この関心領域の幅に細心の注意を払います, すべての関心領域間で一定に保たれる必要があるため.「画像」、「複製」の順に選択して、対象領域を複製し、色付きのチャンネルに対応するチャンネルのみを選択します。
ここでも、長方形ツールを使用して、新しい画像全体に関心領域を描画し、分析を選択してからプロファイルをプロットして蛍光プロファイルを取得します。値のリストを開き、スプレッドシートソフトウェアにコピーします。関心領域の描画から、小腸の各セクションの蛍光プロファイルの取得までの手順を繰り返します(別の定規の行で前述したとおり)。
スプレッドシートソフトウェアで、各平均強度値に、前の手順で作成した関心領域の長方形の一定の幅を掛けます。これにより、各ポイントの小腸に沿った実際の強度値が得られます。ここに示されているのは、小腸の長さに沿った平均蛍光トレースです。
蛍光物質の分布は、管腔内内容物の材料特性によって異なります。同じ生データセットのソートに使用されるビンの数を増やすと、ビンの数が少ないと解決できない詳細なトレース機能が表示されます。ビンが小さいほど、測定の不確実性が低下し、空間分解能が向上し、小腸の運動性の分布成分をよりよく反映します。
幾何学的中心は、管腔内内容物の空間分布を完全に特徴付けることができない。幾何学的中心測定のこの制限は、液体とより大きなビーズの比較で明らかです。大きなビーズの蛍光トレースはより分布していますが、ビニングの粒度に関係なく、液体の蛍光トレースと同様のポイントまで平均化されるため、幾何学的中心のみに焦点を当てることの限界が浮き彫りになります。
小腸収縮の分布性を説明するために、パワースペクトル分析が本研究に組み込まれました。パワースペクトルをプロットすると、ビンサイズが小さくなるにつれて、大きなビーズスペクトルでは有意に支配的な周波数を観測できますが、小さなビーズのスペクトルでは観察できないことがわかります。これらの追加の支配的な周波数のすべてではありませんが、一部が液体スペクトルに存在します。
このプロトコルの最もデリケートなステップは、経管栄養と解剖です。これらは、実験目的でこの手法を実行する前に、実験者によって標準化されるべきである。動物を犠牲にする必要があるので、これは最終実験です。
可能であれば、この実験の前に他の非終末実験を実行して、動物モデルを最大限に活用してください。私たちのグループは最近、この技術を使用して、腸が上皮機械受容器を使用して、指と同じようにより細かい物理的特性を感知する腸タッチセットの発見をサポートしています。
