著者らは、DNP - Cellobioside基板を提供するための博士スティーブウィザースと弘明陳に感謝したいと思います。

このプロトコルを開始する前に、384ウェルプレートフォーマットで保存されているメタゲノムライブラリーが必要になります。私たちの研究では、ファージT1 -耐性TransforMax EPI300 - T1 R E.との組み合わせでPCC1コピー制御フォスミドベクターを使用ライブラリのホストおよび-80 ° C 11時に私たちのプレート格納されているとして大腸菌細胞。 1。メタゲノムライブラリーのプレートの複製<ol><li> 37あなたのライブラリが含まれている霜取りプレート℃で約20分、またはまで、全てのウェルが解凍されています。 </li><li> 15分間ロボットを殺菌するqPix2にUV光殺菌機能を使用してください。 </li><li> 500mLに試薬瓶に100ug/mLで12.5ug/mLとアラビノースの最終濃度でクロラムフェニコールを含むLB培養液を準備します。各プレートは、約20mlの使用に加え、デッドボリュームを可能にするために追加の50mLのを行います。 </li><li>滅菌チューブを介してマニホールドに接続されたメディアのボトルを持つあたりは、メーカーの指示としてqFill3を設定します。メディアの適切な量のためにそれをプログラムし、各ウェルに45uLボリュームを埋めるように設定します。 </li><li>メディアが多様体の各端子からの表示されるまで、ロボットのパージ機能を使用してチューブとマニホールドから空気をパージします。 </li><li> qFill3を使用してLB培地でプレートの希望番号を記入してください。各プレートには、埋めるために約20秒かかります。 </li><li> qPix2ロボットの適切な領域にライブラリのプレートと、新鮮なプレートをロードします。リアお風呂で2％Micro90、途中風呂に蒸留水をオートクレーブ、フロントバスで80％エタノール、適切な試薬で洗浄槽を埋める。 </li><li> qPix2の&quot;複製&quot;プログラムを使用してください。ソフトウェアでは、ソースプレートとデスティネーションプレートの適切な頭部、数と種類を選択します。また、各槽内で通常のレプリケーション、6サイクルの間にきれいに頭をセットアップするだけで十分です。マシンの能力は、一度に10枚であり、そしてそれは、384ピンのヘッド（または96ピンの頭を持つ約50分）で、それらすべてを複製するために約15分かかります。 注：&quot;ソースを混ぜ&quot;または&quot;宛先を混ぜ&quot;するオプションがあります。それは、問題が以前にそれらを使用して私たちのロボットで発生しているとして、これらのオプションを使用しないことをお勧めします。 </li><li>プレートが複製されると、湿度のボックスで24時間、37℃でプレートを成長させる。我々はアラビノースの添加によりフォスミドの高いコピー数を誘導されているため、クローンは、非誘導のクローンよりも遅く成長する傾向がある。 -80℃にライブラリのプレートを返す 注：湿度のボックスのインキュベーションは、メディアの蒸発を保証するには、すべてのウェルのために均一な環境を維持し、プレートの端にある井戸では発生しません。 </li><li>まず水（〜50ml）にしてから、80％エタノール（〜50ml）でそれをパージすることによってqFill3ロボットを清掃してください。コンポーネントを分解し、アルミ箔に包まれたボトル、蓋、とチューブを洗浄し、オートクレーブ。 </li></ol> 2。 E.の成長の測定大腸菌のクローン<ol><li> 37℃のインキュベータからプレートを取り外します。最大25枚の最大、RapidStakで提供される雑誌の荷台の上に取り出して、ふたを取っておく、と場所のプレート。 注：スタックの一番下にあるプレートが読み出される最初のものになる。ソフトウェアは、これを記録しないように、プレートの順番を追跡することを確認してください。 </li><li>迅速なStakから1つのマガジンを削除する、それが空であることを確認し、そして読まれるプレートのスタックにプッシュする。ハンドルでそれをつかみ、そしてプレートはすべてのマガジンにロードする必要があります。 RapidStakにマガジンをロードする。 注：雑誌にはプレートのA1ウェルが行く必要がありますどの角示す隅にある小さなネジを持っている。マガジンは、正しい向きでのみRapidStakにマウントされます。 </li><li>マシンに接続されたコンピュータ上でSkanIt REプログラムを開きます。 &quot;新しいセッション&quot;を選択し、適当な名前。プレートの種類として&quot;コーニングフラットボトム384ウェルプレート&quot;を選択します。 </li><li> &quot;プレートのレイアウト&quot;領域で、&quot;ウィザード&quot;ボタンを選択して、お皿に384の未知数を追加するには、それを選択します。 </li><li> &quot;プロトコル&quot;領域で、&quot;まあループ&quot;オプションを選択して、384ウェルのために入力してください。 &quot;まあループ&quot;のアイコンが画面の左側に流れ、ツリーに表示されます。アイコンを選択し、&quot;測光&quot;を追加する]をクリックします。 600nmの時に読み込むように設定します。 </li><li>一意の名前を使用してプロトコルを保存し、SkanIt REのプログラムを閉じます。 </li><li>コンピュータ上で、PolaraRSプログラムを開きます。 </li><li>メインページにRapidStakデバイスに接続されている測定器の一覧表があるでしょう。 VarioSkanは、この表の左側に配置する必要があります。 VarioSkan見出しの下に、2つのリンクが存在します。&quot;RunSession&quot;と&quot;インキュベート&quot;。 &quot;RunSession&quot;オプションをクリックします。 </li><li>新しいウィンドウ、アッセイウィンドウは、中央のフローチャートで表示されます。 &quot;RunSession&quot;の項目を（それが唯一の項目の存在するはず）を選択します。画面の右側のドロップダウンメニューで表示されます。このメニューで実行して保存されてSkanItのREの名前を見つける。 注：このメニューには合理的な順序付けはないようである。それは、アルファベット順ではない、または日付によって追加、またはコンピュータ上のプロトコルが保存されている場所に関連する。これは苦痛であるあなた自身を見つける前に、すべてのプロトコルを、目を通す必要があることを意味します。 </li><li>あなたのプロトコルを選択したら、右上隅の&quot;このアッセイを実行する&quot;をクリックします。 </li><li>ボックスは、ソースとして使用するマガジンを示すためにあなたを求める、ポップアップ表示されます、とどの雑誌は空です。画面上のボックスの下部にはフロントマガジンに対応しています。 [オプション：それはそれに要する時間の量の見積もりを決定するためにロードされたプレートの番号を入力するよう求めた。この見積もりは、通常の方法オフになっています。] </li><li> RapidStakとVarioSkan両方の電源がオンになっていることを確認し、&quot;OK&quot;を押します。 </li><li> RapidStakは、自動的に板の連続測定を可能にする、プレートリーダーにプレートをロードします。 25プレートを読み取るには、約50分かかります。 注：これはマシンの適切な配置を確保するためにVarioSkanに最初のプレートの負荷を監視することをお勧めします。 RapidStakはプレートリーダーを正しくロー​​ドされない場合は、PolaraRSウィンドウの右上隅にある&quot;一時停止このアッセイ&quot;ボタンを使用してください。 </li><li> VarioSkanはすべてのプレートを読んで完了すると、フルマガジンを削除し、雑誌の荷台の上に置きます。プラットフォームの外側の長方形を持ち上げ、そして雑誌では真ん中の山に立っているプレートを残し、オフにスライドするはずです。適切なプレートにふたを取り付けます。 </li></ol> 3。各プレートにアッセイミックスの加算<ol><li> pH5.5で50mmの酢酸カリウム緩衝液中で溶解ミックスの既成の10倍の株式（10％トリトンX - 100、100mMのRIS、10mMのEDTA）を用いてアッセイミックスを調製する。基板が完全に溶解することを確認し、DMSOに75mg/mL DNP - cellobioside基板までの株式を準備します。アッセイミックスに0.1mg/mLの最終濃度にDNP - cellobioside原液を追加。各プレートには、溶液約20mlのを使用し、加えてデッドボリュームを可能にするために追加の50mLのを行います。 注：DNP - Cellobiosideの溶解度を増加させるので、DMSOに溶解し、水に容易に溶解しない。最終的なアッセイ溶液中のDMSOの存在は、観察可能な効果はありません。 </li><li>滅菌チューブを介してマニホールドに接続されたメディアのボトルを持つあたりは、メーカーの指示としてqFill3を設定します。メディアの適切な量のためにそれをプログラムし、各ウェルに45uLボリュームを埋めるように設定します。 </li><li>メディアが多様体の各端子からの表示されるまで、ロボットのパージ機能を使用してチューブとマニホールドから空気をパージします。 </li><li> qFill3を使用して、各プレートにアッセイミックスを追加。各プレートには、埋めるために約20秒かかります。 </li><li>アッセイミックスが追加されると、37℃でプレートをインキュベート° Cを湿度のボックスに12〜16時間のために。 注意：プレートのインキュベーションを超えるアッセイミックスが追加されるとは、内部の井戸のために見られるよりも高い吸光度をもたらす、プレートの外側のウェル中で蒸発の原因となります。これは、湿度チャンバ内でプレートをインキュベートすることによって相殺することができます。 </li></ol> 4。アッセイしたクローンの読書吸光度<ol><li> 37℃のインキュベータからプレートを取り外します。最大25枚の最大、RapidStakで提供される雑誌の荷台の上に取り出して、ふたを取っておく、と場所のプレート。 注：スタックの一番下にあるプレートが読み出される最初のものになる。ソフトウェアは、これを記録しないように、プレートの順番を追跡することを確認してください。 </li><li>迅速なStakから1つのマガジンを削除する、それが空であることを確認し、そして読まれるプレートのスタックにプッシュする。ハンドルでそれをつかみ、そしてプレートはすべてのマガジンにロードする必要があります。 RapidStakにマガジンをロードする。 注：雑誌にはプレートのA1ウェルが行く必要がありますどの角示す隅にある小さなネジを持っている。マガジンは、正しい向きでのみRapidStakにマウントされます。 </li><li>マシンに接続されたコンピュータ上でSkanIt REプログラムを開きます。 &quot;新しいセッション&quot;を選択し、適当な名前。プレートの種類として&quot;コーニングフラットボトム384ウェルプレート&quot;を選択します。 </li><li> &quot;プレートのレイアウト&quot;領域で、&quot;ウィザード&quot;ボタンを選択して、お皿に384の未知数を追加するには、それを選択します。 </li><li> &quot;プロトコル&quot;領域で、&quot;まあループ&quot;オプションを選択して、384ウェルのために入力してください。 &quot;まあループ&quot;のアイコンが画面の左側に流れ、ツリーに表示されます。アイコンを選択し、&quot;測光&quot;を追加する]をクリックします。 400nmの時に読み込むように設定します。 </li><li>一意の名前を使用してプロトコルを保存し、SkanIt REのプログラムを閉じます。 </li><li>コンピュータ上で、PolaraRSプログラムを開きます。 </li><li>メインページにRapidStakデバイスに接続されている測定器の一覧表があるでしょう。 VarioSkanは、この表の左側に配置する必要があります。 VarioSkan見出しの下に、2つのリンクが存在します。&quot;RunSession&quot;と&quot;IncubateはRunSession&quot;オプション&quot;。をクリックして&quot;。 </li><li>新しいウィンドウ、アッセイウィンドウは、中央のフローチャートで表示されます。 &quot;RunSession&quot;の項目を（それが唯一の項目の存在するはず）を選択します。画面の右側にあるドロップダウンメニューが表示されます。このメニューで実行して保存されてSkanItのREの名前を見つける。 </li><li>あなたのプロトコルを選択したら、右上隅の&quot;このアッセイを実行する&quot;をクリックします。 </li><li>ボックスは、ソースとして使用するマガジンを示すためにあなたを求める、ポップアップ表示されます、とどの雑誌は空です。画面上のボックスの下部にはフロントマガジンに対応しています。 [オプション：それはそれに要する時間の量の見積もりを決定するためにロードされたプレートの番号を入力するよう求めた。この見積もりは、通常の方法オフになっています。] </li><li> RapidStakとVarioSkan両方の電源がオンになっていることを確認し、&quot;OK&quot;を押します</li><li> RapidStakは、自動的に板の連続測定を可能にする、プレートリーダーにプレートをロードします。 注：これはマシンの適切な配置を確保するためにVarioSkanに最初のプレートの負荷を監視することをお勧めします。 RapidStakはプレートリーダーを正しくロー​​ドされない場合は、PolaraRSウィンドウの右上隅にある&quot;一時停止このアッセイ&quot;ボタンを使用してください。 </li><li> VarioSkanはすべてのプレートを読んで完了すると、フルマガジンを削除し、雑誌の荷台の上に置きます。プラットフォームの外側の長方形を持ち上げ、そして雑誌では真ん中の山に立っているプレートを残し、オフにスライドするはずです。プレートは、ラボの手続きに従って廃棄することができます。 </li><li>吸光度、オープンSkanItのREのソフトウェアを、エクスポートして、&quot;既存のファイルを開く&quot;を選択する。 </li><li>あなたのセッションを保存したディレクトリを選択するには、リストを展開すると、タイトルの見出しの下にプレートの数に応じて、&quot;コンテナN&quot;に&quot;コンテナ1&quot;というラベルのオプションになる&quot;+&quot;アイコンを押してください。最初に分析するプレートを選択します。 </li><li>ページの上部にあるメニューバーで、&quot;データ処理&gt;レポート/エクスポート&quot;を選択します。 </li><li>輸出のために必要なオプションを選択します。 注：私は一般的に&quot;プレートのレイアウト&quot;と輸出のための&quot;光度&quot;のデータを選択します。 </li><li> &quot;[レポートの表示&quot;をクリックし、&quot;ファイル&gt;保存&quot;。目的のディレクトリを選択します。出力形式はMicrosoft Excelのスプレッドシートです。 </li></ol> 5。代表的な結果陽性クローンを含む単一の384ウェルプレートから吸光度の例を図2に示されています。ポジティブクローンは、セルラーゼ活性を発現していないものより吸光度の顕著な増加を示しています。アッセイ時間の違い、ウェルプレート上の場所、またはDNPの濃度は、（非溶解DNPを除外することによって導入されるかもしれない）の絶対吸光度に影響を与える可能性があります。このようなプレートの平均値または列の平均以上の吸光度の差として相対的な吸光度測定値は、、セルラーゼ陽性クローンを同定するのより堅牢な方法です。 ライブラリのプレートからポジティブクローンの同定に続いて、それは二次スクリーニングのための新たなプレートにすべての陽性クローンを複製することをお勧めします。これはよく場所やプレートの変動に起因する影響を排除し、陽性クローンの間でより多くの直接比較が可能になります。 <img src="/files/ftp_upload/2461/2461fig1.jpg" alt="図1" /> E.にクローン化されたメタゲノムライブラリーのためのハイスループットアッセイの図1。フローチャート大腸菌と-80℃で保存<img src="/files/ftp_upload/2461/2461fig2.jpg" alt="図2" /> 陽性クローンを含むもの384ウェルプレートから図2。吸光度から。セルラーゼ陽性クローンが負のクローン以上の有意な増加吸光度によって識別することができます。

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	<li>Rubin, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomics+of+cellulosic+biofuels.">Genomics of cellulosic biofuels.</a> Nature. 454, 841-845 (2008).</li><li>Voget, S., Steele, H. L., Streit, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+metagenome+derived+halotolerant+cellulase.">Characterization of a metagenome derived halotolerant cellulase.</a> J. Biotechnol. 126, 26-36 (2006).</li><li>Duan, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+partial+characterization+of+novel+genes+encoding+acidic+cellulases+from+metagenomes+of+buffalo+rumens.">Isolation and partial characterization of novel genes encoding acidic cellulases from metagenomes of buffalo rumens.</a> J. Appl. Microbiol. 107, 245-256 (2009).</li><li>Zhang, Y. H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outlook+for+cellulase+improvement:+Screening+and+selection+strategies.">Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies.</a> Biotech. Advances. 24, 452-481 (2006).</li><li>Teather, R. M., Wood, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+congo+red-polysaccharide+interactions+in+enumeration+and+characterization+of+cellulolytic+bacteria+from+the+bovine+rumen.">Use of congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen.</a> Appl. And Environ. Microbiol. 43, 777-780 (1982).</li><li>Sharrock, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulase+assay+methods:+a+review.">Cellulase assay methods: a review.</a> J. Biochem and Biophys Methods. 17, 81-106 (1988).</li><li>Kasana, R. C., Salwan, R., Dhar, H., Dutt, S., Gulati, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+easy+method+for+detection+of+microbial+cellulases+on+agar+plates+using+Gram's+Iodine.">A rapid and easy method for detection of microbial cellulases on agar plates using Gram's Iodine.</a> Curr. Microbiology. 57, 503-507 (2008).</li><li>Huang, J. S., Tang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+assay+for+cellulase+and+dextranase.">Sensitive assay for cellulase and dextranase.</a> Anal. Biochem. 73, 369-377 (1976).</li><li>Tull, D., Withers, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cellulases+and+xylanases:+A+detailed+kinetic+study+of+the+exo-beta-1,4-glycanase+from+Cellulomonas+fimi.">Mechanisms of cellulases and xylanases: A detailed kinetic study of the exo-beta-1,4-glycanase from Cellulomonas fimi.</a> Biochemistry. 33, 6363-6370 (1994).</li><li>Martinez, A., Bradley, A. S., Waldbauer, J. R., Summons, R. E., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteorhodopsin+photosystem+gene+expression+enables+photophosphorylation+in+a+heterologous+host.">Proteorhodopsin photosystem gene expression enables photophosphorylation in a heterologous host.</a> PNAS. 104, 5590-5595 (2007).</li><li>Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+Insert+Environmental+Genomic+Library+Production.">Large Insert Environmental Genomic Library Production.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Martinez, A., Tyson, G. W., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+known+and+novel+phosphonate+utilization+pathways+in+marine+bacteria+revealed+by+functional+screening+and+metagenomic+analyses.">Widespread known and novel phosphonate utilization pathways in marine bacteria revealed by functional screening and metagenomic analyses.</a> Environ Microbiol. 12, 222-238 (2010).</li><li>Wild, J., Hradecna, Z., Szybalski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditionally+amplifiable+BACs:+Switching+from+single-copy+to+high-copy+vectors+and+genomic+clones.">Conditionally amplifiable BACs: Switching from single-copy to high-copy vectors and genomic clones.</a> Genome Research. 12, 1434-1444 (2002).</li><li>Johnson, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sacchirification+of+complex+cellulosic+substrates+by+the+cellulase+system+from+Clostridium+thermocellum.">Sacchirification of complex cellulosic substrates by the cellulase system from Clostridium thermocellum.</a> Appl Environ Microbiology. 43, 1125-1132 (1982).</li><li>Stutzenberger, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulase+Production+by+Thermomonospora+curvata+isolated+from+municipal+solid+waste+compost.">Cellulase Production by Thermomonospora curvata isolated from municipal solid waste compost.</a> Appl Environ Microbiol. 22, 147-152 (1971).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

E.で表される大規模な挿入のゲノムDNAのメタゲノムライブラリーからのセルロース分解活性の迅速な検出のためのハイスループットスクリーニング大腸菌は、このプロトコルで説明されています。このメソッドは、一般的に文献で使用されるCMC /コンゴーレッドアッセイよりも優れています。それは解決策に基づいており、定量分析を可能にするプレートリーダーからの吸光度?...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>qPix2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genetix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>With 384-pin gridding head</td>
</tr>
<tr>
<td>qFill3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genetix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>With 384-well manifold</td>
</tr>
<tr>
<td>Varioskan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RapidStak</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Connected to Varioskan</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro90 Detergent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cole-Parmer</td>
<td>18100-00</td>
<td>Diluted to 2% in water</td>
</tr>
<tr>
<td>Ethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Major Lab Supplier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Diluted to 80% in water</td>
</tr>
<tr>
<td>Chloramphenicol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C0378</td>
<td>12.5mg/mL in ethanol</td>
</tr>
<tr>
<td>LB broth, Miller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP1426-2</td>
<td>25g/L, autoclaved</td>
</tr>
<tr>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>384-well flat bottom plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>3680</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-(+)-Arabinose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A3256</td>
<td>100mg/mL in water</td>
</tr>
<tr>
<td>Potassium Acetate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>P171</td>
<td>50mM in water, autoclaved, adjusted to pH 5.5 with HCl</td>
</tr>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trizma hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T3253</td>
<td>In TE buffer solution, 100mM</td>
</tr>
<tr>
<td>EDTA disodium salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>E5134</td>
<td>In TE buffer solution, 10mM</td>
</tr>
<tr>
<td>2,4-dinitrophenyl cellobioside</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Provided by Dr. Steve Withers, UBC</td>
</tr>
<tr>
<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D8418</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

a high throughput screen for biomining cellulase activity from metagenomic libraries

セルロース、地球上の有機炭素の最も豊富な源は、バイオ燃料生産の1の増加を重視した幅広い産業用途を持っています。セルロースを変更したり、劣化させる化学的方法は、通常、強酸と高温を必要とする。このように、酵素法は、生物変換プロセスで顕著になっている。細菌および真菌分離株からのアクティブなセルラーゼの識別がやや効果があった一方で、自然界における微生物の大半は、実験室培養をレジスト。また、メタゲノム、スクリーニングの手法として知られている環境のゲノムは、新たな生物変換酵素の検索で栽培ギャップを埋めることに大きな期待を持っている。土壌2、水牛ルーメン3とコンゴレッド色素（Teatherとウッド5の方法に基づいて）で染色されたカルボキシメチルセルロース（CMC）寒天プレートを使用してシロアリ後肢腸4など様々なメタゲノムスクリーニングのアプローチが成功した環境からの新規セルラーゼを回復した。しかし、CMCメソッドは、スループットに制限され、定量的ではなく、ノイズ比6に低信号が現れます。他の方法は、7,8の報告が、それぞれが大規模な挿入のゲノムライブラリーのハイスループットスクリーニングのための望ましくない寒天プレートベースのアッセイを、使用されています。ここでは、ソリューションベースの発色ジニトロフェノール（DNP）- cellobioside基板9を使用して、セルラーゼ活性のための画面を提示する。私たちの図書館は、コピー数の誘導10を介して分析感度を向上させるフォスミドPCC1コピー制御にクローニングした。方法は、吸光度測定として提供される最終的な読み出しと384ウェルマイクロプレートでのワンポット化学を使用しています。この読み出しは、付属のスタッキングシステムを持つ液体ハンドラとプレートリーダーを使用して一日あたりの100倍、384ウェルプレートまでのスループットと、定量的な敏感と自動化です。

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A High Throughput Screen for Biomining Cellulase Activity from Metagenomic Libraries

このプロトコルは、大腸菌で発現メタゲノムライブラリーからのセルロース分解活性のためのハイスループットスクリーニングを説明します。画面には、ソリューションベースと高度に自動化され、吸光度測定など最終的な読み出しと384ウェルマイクロプレートでのワンポット化学を使用しています。

メタゲノムライブラリからセルラーゼ活性をBiominingためのハイスループットスクリーニング

Cellulose, the most abundant source of organic carbon on the planet, has wide-ranging industrial applications with increasing emphasis on biofuel ...

a-high-throughput-screen-for-biomining-cellulase-activity-from

Research

JoVE Journal

Biology

15.0K ビュー.  University of British Columbia - UBC. このプロトコルは、大腸菌で発現メタゲノムライブラリーからのセルロース分解活性のためのハイスループットスクリーニングを説明します。画面には、ソリューションベースと高度に自動化され、吸光度測定など最終的な読み出しと384ウェルマイクロプレートでのワンポット化学を使用しています。

ビデオ: A High Throughput Screen for Biomining Cellulase Activity from Metagenomic Libraries

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation. Generating a streamlined procedure for creating and screening metagenomic libraries is therefore useful for efficient high-throughput investigations into the genetic and metabolic properties of uncultured microbial assemblages. Here, key protocols are presented on video, which we propose is the most useful format for accurately describing a long process that alternately depends on robotic instrumentation and (human) manual interventions. First, we employed robotics to spot library clones onto high-density macroarray membranes, each of which can contain duplicate colonies from twenty-four 384-well library plates. Automation is essential for this procedure not only for accuracy and speed, but also due to the miniaturization of scale required to fit the large number of library clones into highly dense spatial arrangements. Once generated, we next demonstrated how the macroarray membranes can be screened for genes of interest using modified versions of standard protocols for probe labeling, membrane hybridization, and signal detection. We complemented the visual demonstration of these procedures with detailed written descriptions of the steps involved and the materials required, all of which are available online alongside the video.

メタゲノムライブラリの大規模スクリーン

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

生物学

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

ハイスループット酵母プラスミドの過剰発現の画面

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

における真菌エンドグルカナーゼ活性のハイスループットスクリーニング大腸菌</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA

Whole transcriptome sequencing by mRNA-Seq is now used extensively to perform global gene expression, mutation, allele-specific expression and other genome-wide analyses. mRNA-Seq even opens the gate for gene expression analysis of non-sequenced genomes. mRNA-Seq offers high sensitivity, a large dynamic range and allows measurement of transcript copy numbers in a sample. Illumina&#x2019;s genome analyzer performs sequencing of a large number (&gt; 107) of relatively short sequence reads (&lt; 150 bp).The &quot;paired end&quot; approach, wherein a single long read is sequenced at both its ends, allows for tracking alternate splice junctions, insertions and deletions, and is useful for de novo transcriptome assembly.
One of the major challenges faced by researchers is a limited amount of starting material. For example, in experiments where cells are harvested by laser micro-dissection, available starting total RNA may measure in nanograms. Preparation of mRNA-Seq libraries from such samples have been described1, 2 but involves significant PCR amplification that may introduce bias. Other RNA-Seq library construction procedures with minimal PCR amplification have been published3, 4 but require microgram amounts of starting total RNA.
Here we describe a protocol for the Illumina Genome Analyzer II platform for mRNA-Seq sequencing for library preparation that avoids significant PCR amplification and requires only 10 nanograms of total RNA. While this protocol has been described previously and validated for single-end sequencing5, where it was shown to produce directional libraries without introducing significant amplification bias, here we validate it further for use as a paired end protocol. We selectively amplify polyadenylated messenger RNAs from starting total RNA using the T7 based Eberwine linear amplification method, coined &quot;T7LA&quot; (T7 linear amplification). The amplified poly-A mRNAs are fragmented, reverse transcribed and adapter ligated to produce the final sequencing library. For both single read and paired end runs, sequences are mapped to the human transcriptome6 and normalized so that data from multiple runs can be compared. We report the gene expression measurement in units of transcripts per million (TPM), which is a superior measure to RPKM when comparing samples7.

Here we describe a method for preparation of both single read and paired end Illumina mRNA-Seq sequencing libraries for gene expression analysis based on T7 linear RNA amplification. This protocol requires only 10 nanograms of starting total RNA and generates highly consistent libraries representing whole transcripts.

10ナノグラムのトータルRNAからシングルリードとペアエンドのmRNA - seqのイルミナライブラリ

Whole transcriptome sequencing by mRNA-Seq is now used extensively to perform global gene expression, mutation, allele-specific expression and other ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

ウニ​​接合体のハイスループットマイクロインジェクション

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology due to their considerable degree of genetic conservation with humans. Chemical genetics entails testing the effect that small molecules have on a biological process and is becoming a popular translational research method to identify therapeutic compounds. Zebrafish are specifically appealing to use for chemical genetics because of their ability to produce large clutches of transparent embryos, which are externally fertilized. Furthermore, zebrafish embryos can be easily drug treated by the simple addition of a compound to the embryo media. Using whole-mount in situ hybridization (WISH), mRNA expression can be clearly visualized within zebrafish embryos. Together, using chemical genetics and WISH, the zebrafish becomes a potent whole organism context in which to determine the cellular and physiological effects of small molecules. Innovative advances have been made in technologies that utilize machine-based screening procedures, however for many labs such options are not accessible or remain cost-prohibitive. The protocol described here explains how to execute a manual high-throughput chemical genetic screen that requires basic resources and can be accomplished by a single individual or small team in an efficient period of time. Thus, this protocol provides a feasible strategy that can be implemented by research groups to perform chemical genetics in zebrafish, which can be useful for gaining fundamental insights into developmental processes, disease mechanisms, and to identify novel compounds and signaling pathways that have medically relevant applications.

The zebrafish is an excellent experimental organism to study vertebrate developmental processes and model human disease. Here, we describe a protocol on how to perform a manual high-throughput chemical screen in zebrafish embryos with a whole-mount in situ hybridization (WISH) read-out.

ゼブラフィッシュ胚を用いた高スループットへのアプローチマニュアル小分子スクリーン

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

転写後調節される遺伝子の化学モジュレーターのためのハイスループットスクリーニング

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag分析 - 高スループット、Sc2.0ジェノタイピングのためのリアルタイムPCRアッセイ

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

A Protocol for Functional Assessment of Whole-Protein Saturation Mutagenesis Libraries Utilizing High-Throughput Sequencing

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel sequencing technology have opened up the possibility of assessing the functional or fitness effects of large numbers of mutations simultaneously. Here, we present a protocol for experimentally determining the effects of all possible single amino acid mutations in a protein of interest utilizing high-throughput sequencing technology, using the 263 amino acid antibiotic resistance enzyme TEM-1 &#946;-lactamase as an example. In this approach, a whole-protein saturation mutagenesis library is constructed by site-directed mutagenic PCR, randomizing each position individually to all possible amino acids. The library is then transformed into bacteria, and selected for the ability to confer resistance to &#946;-lactam antibiotics. The fitness effect of each mutation is then determined by deep sequencing of the library before and after selection. Importantly, this protocol introduces methods which maximize sequencing read depth and permit the simultaneous selection of the entire mutation library, by mixing adjacent positions into groups of length accommodated by high-throughput sequencing read length and utilizing orthogonal primers to barcode each group. Representative results using this protocol are provided by assessing the fitness effects of all single amino acid mutations in TEM-1 at a clinically relevant dosage of ampicillin. The method should be easily extendable to other proteins for which a high-throughput selection assay is in place.

We present a protocol for the functional assessment of comprehensive single-site saturation mutagenesis libraries of proteins utilizing high-throughput sequencing. Importantly, this approach uses orthogonal primer pairs to multiplex library construction and sequencing. Representative results using TEM-1 &#946;-lactamase selected at a clinically relevant dosage of ampicillin are provided.

ハイスループットシーケンシングを利用し全体プロテイン飽和突然変異誘発ライブラリの機能評価のためのプロトコル

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel ...

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, microbiome modification is designed to concentrate genomic DNA of a target foodborne pathogen contaminant to facilitate the detection and subtyping of the pathogen in a single workflow. Here, we explain and demonstrate the sample preparation steps for the quasi-metagenomics analysis of Salmonella enterica from representative food and environmental samples including alfalfa sprouts, ground black pepper, ground beef, chicken breast and environmental swabs. Samples are first subjected to the culture enrichment of Salmonella for a shortened and adjustable duration (4&#8211;24 h). Salmonella cells are then selectively captured from the enrichment culture by immunomagnetic separation (IMS). Finally, multiple displacement amplification (MDA) is performed to amplify DNA from IMS-captured cells. The DNA output of this protocol can be sequenced by high throughput sequencing platforms. An optional quantitative PCR analysis can be performed to replace sequencing for Salmonella detection or assess the concentration of Salmonella DNA before sequencing.

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Here, we present a protocol to prepare DNA samples from food and environmental microbiomes for concerted detection and subtyping of Salmonella through quasimetagenomic sequencing. The combined use of culture enrichment, immunomagnetic separation (IMS), and multiple displacement amplification (MDA) allows effective concentration of Salmonella genomic DNA from food and environmental samples.&#160;