私たちは、写真撮影の補助のための原稿やベティCowgillの重要な読書のためのサンティアゴ·スアレスに感謝します。我々はまた、彼らの重要なフィードバックのための匿名査読に感謝します。この作品は、デラウェア大学の研究基金によってサポートされています。

1。硫酸プロタミンの製造（PS）コートディッシュ<ol><li> 50mlコニカルチューブ中の脱イオン蒸留水（のddH 2 O）50mlに0.5gのPSを添加して硫酸プロタミン（PS）の1％溶液を調製する。 PSの完全な溶解を確実にするために1〜2時間室温でベンチシェーカー上で高速によく振る。この溶液を3（完全に、使用前にゲル状の沈殿物を溶解することを確認する）少なくとも3ヶ月間、4℃で保存することができる。 </li><li> 60ミリメートル×15ミリメートルのポリスチレンペトリ皿のスリーブを取り、ベンチに蓋と底の両方をレイアウト。 </li><li>少なくとも2分間残して、表面を覆うのにちょうど十分な各皿中の1％PS溶液（両方の底部及び蓋を使用することができる）注ぐ。 4℃で保存したときに残ったPS溶液を3ヶ月以内に何回も再利用することができる</li><li>蒸留水（DH 2 O）を満たしたビーカー内の場所、PS-処理皿を。少なくともためのdH 2 Oを実行しているの下にビーカーを残す10分。 </li><li> PSでコーティングされた皿を記憶するために直ちに又は空気乾燥を使用することができる。埃の蓄積を防ぐためにそれらをカバーしています。それらは、1ヶ月3を室温で保存することができる。 </li></ol> 2。ウニ​​配偶子を取得し、マイクロインジェクション用のPSコートディッシュ上で卵を固定する<ol><li>配偶子3（ 図2）を解放するために平滑筋の収縮を誘発するために振盪または0.5％のKClまでの1ミリリットルの体腔内注射によるスポーンウニ。 </li><li>動物は雄である場合、白色精子によって示されるように、1.5mlチューブに動物の表面から精子を採取、乾燥。乾燥した精子は、生物学的機能の著しい損失なし週間4℃で保存することができる。 </li><li>動物が雌である場合、卵黄含量に起因する黄色で示すように、海水の完全gonoporesビーカーに浸漬することにより、その配偶子を集める。卵はgonoporesから解放され、重力によって落ち着くことになります。&lt;/李&gt; <li>このような80ミクロンのナイロンフィルターメッシュを用いた動物の棘などの破片から卵をフィルタリングします。卵を産卵後5-7時間以内に使用された場合、最良の結果が達成される。 </li><li>卵をDejelly： <ol><li>卵の約1ミリリットルのための酸性海水100ミリリットルを用意します。 5.1-5.2のpH 8.0から海水のpHを調整するために0.5 Mクエン酸を使用する。 pHが低すぎる受精を減少し、pHが高すぎる、卵がPSでコーティングしたプレートに付着することはできません。 </li><li>酸性海水に卵（1ミリリットルを超えない）を追加し、卵を10分間氷上で落ち着くことができます。あるいは、ゼリーコートの除去が治療中に卵を穏やかに旋回することによって容易にすることができる。一つは、効果的にdejelly Sを 3〜4分でこのように卵をpurpuratusすることができます。 </li><li>慎重に、酸性の海の水を注ぐ新鮮な海の水を追加して、卵が再び氷上に落ち着くましょう。 Dejellied卵が受精の問題なしに最大6時間氷上で保存することができる</li></ol></李&gt; </ol> 3。卵を行<ol><li>のddH 2 Oで10mlに3-AT 0.84gを溶解することによって、3 -アミノトリアゾール（3-AT、MW = 84.08）の1 Mのストック溶液を調製この溶液を6ヶ月まで4℃で保存することができる。 </li><li>予冷海水50mlに1Mストック溶液50μlを添加することにより、3-ATの1 mMのワーキング溶液を調製する。氷の上で解決策を維持する。 </li><li>卵の穏やかな取扱いのための口のピペット（ 図3）を準備します。 <ol><li>ピペットチップは、手動でガラスのマイクロピペット（100×外径1.09ミリメートル）から引き出されている。直火の上に両手でマイクロピペットを保持する。ガラスは反対方向に、ピペットの端部を引っ張る注意深く、溶融し始めるように</li><li> 1は、パラフィルムで密封シール、プラスチックチューブ（ID 1.14ミリメートル）にピペットを引っ張って接続します。チューブの長さは約50〜70センチメートルにする必要があります。 </li><li>ガラスチューブに、チューブの反対側の端部に無菌濾過P20またはP200先端を挿入するマウスピースとして使用する。 </li><li>先端の直径を調整するためにはさみでガラスマイクロピペットの先端をクリップ。最適な直径は、わずかに卵（80ミクロン）の直径を超えています。 </li></ol></li><li>各PSコートディッシュ（底部または蓋）に1 mMの3-ATの海水の4ミリリットルを注ぐ。 </li><li>口のピペットを取り、口の中でP20/P200チップを入れて、歯で固定します。卵を吸引するために、第一の海水少量の水を吸引する。前の卵をロードする液体の列を持つことにより、1口の分注技術に対して最大の制御を持つことになります。 </li><li>卵の近くにマイクロピペットチップを置き、静かにピペットで卵の数百に吸引除去する。ガラスマイクロピペット内の卵を閉じ込める。 </li><li>行は、直線的に先端を移動させながら、ゆっくりと口のピペットからそれらを吹き付けて皿の上に一直線に卵をdejellied。受精の問題が原因で、Pに発生する可能性があるため、右の注射の前に卵を行3-ATの海水3への露出をrolonged。また、PSのような陽イオン性接着剤は、卵への毒性があることができ、受精の封筒が削除されている場合は特に、長時間これらの試薬に胚を公開することはお勧めできません。 </li><li>ガラスピペットを使用して漕い卵の線近傍の皿に傷を作る。この傷は、必要に応じて溶液の流れを調整するために注射針を破壊することが重要である。代わりに、傷が皿に3-ATの海水を注ぐ前に行うことができます。 </li></ol> 4。ウニ​​受精卵のマイクロインジェクション<ol><li>マイクロインジェクション·ステーションの電源をオンにします。ここでは、FemtoJet噴射システムの使用を記載している。 </li><li>ニードルプラーを用いて射出毛細血管を引き出します。良好な針の例が図4に示されている。注：RNAの注入は、注入キャピラリーRNAアーゼ31の汚染を避けるために前処理されるべきである。 <ol><li>を50mlの円錐内に噴射毛管を配置するチューブと濾過し、メタノール/塩酸（9:1）の50ミリリットルを追加します。よく振って、もはや10時間以上のために一晩放置しない。 </li><li>メタノール/塩酸を捨て、毛細血管が同じチューブ内で濾過し、メタノールで2回すすいでください。 </li><li>できるだけメタノールを排出し、メタノールの完全な除去を確実にするために、一晩キャピラリーを凍結乾燥。 </li></ol></li><li>慎重に針装填ホルダーに針毛細血管をマウントし、microloaderチップを使用して試料溶液の&lt;0.5μlでそれを読み込む。試料溶液は、通常、注入された材料3に応じて、20％グリセロールを含有する。 </li><li>顕微鏡ステージ上で漕い卵の皿を置きます（接眼レンズを通して見たときの卵が垂直配向する必要があります）と卵に焦点を当てています。 </li><li>慎重に針に微量ホルダーにロード針をマウントして、フィールドの真ん中に完全に集中先端を持つように針の位置を調整します。 </li><li>最大圧力FOを適用するには、ボタンを押すR針の清掃。解決策は、針から出てくるはずです。必要に応じて圧力を調整し、射出圧力は、少なくとも約1/3の噴射圧補正圧で、90から360ヘクトパスカルの範囲であるべきである。 </li><li>未受精卵に注入することによって、溶液の流れを調整します。ジョイスティックマイクロマニピュレーターを用いて、未受精卵に注射針の先端を演出します。針落ちを促進するために、このようなねじ回しなどの硬い物体とのステージの穏やかなタッピングによって若干の震えを作る。卵の中に射出成形ボーラス（ 図5）見られるべきである。 </li><li>注入ボーラスが表示されない場合は、少し、卵上記の針の先端を高めるディッシュの傷を見つけて、フィールドの中央に配置されるように調整します。優しく、注射針の先端を破るためにスクラッチマークに針の先端をタップします。注入ボーラスがTの1/5を超えないことを確実にするために、注射や補償の圧力を調整卵（1-2 PM）の彼は、直径。 </li><li>注入ボーラスを校正した後、希釈した精子（1:1,000）または精子の1〜2μLを追加することで卵を受精。卵の行を外れることを防ぐために慎重によく混ぜる。 </li><li>受精エンベロープは（ 図5）目に見えるようになる直後に注射を開始します。ステージコントローラを使用して漕い卵の線に沿って移動し、ジョイスティックマイクロマニピュレーターによって制御針でそれらを突っついによって、できるだけ多くの受精卵を注入する。 </li><li> 10〜15分後に、新たに受精した卵は硬くなり、もはや注入することができません。段階からお皿を取り外し、慎重にプラスチック製パスツールピペットを用いて3-AT海水中に精子を吸引除去する。 </li><li>接合体が乾燥しないようにしてください。すぐにお皿をカバーするために、新鮮な予冷海の水を加える。 15℃で胚を培養する</li></ol>

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著者らは、競合する経済的利益や関心のある他の衝突を宣言していません。

マイクロインジェクションは、DNA、mRNAを、組換えタンパク質、卵、胚、および様々な生物1-7の細胞への機能と関数試薬、染料およびそれらの組み合わせの利得の損失などの様々な治療を提供するための強力な手法です。マイクロインジェクション実験を設計する場合ただし、いくつかの考慮事項が心に留めておくべきである。 これは、送達処置および注入量の?...

効率的で再現性のある治療照射は、研究者のための主要な方法論的課題の一つである。いくつかの方法が一過卵、胚、および細胞への治療ソリューションを提供するために設立されました。これらの方法には、1,2、リポフェクション（膜を用いた治療を含むリポソームの融合による配送）1、微粒子衝撃1（DNAはミクロンに析出（短い電気パルスを用いて、膜内の生成過渡毛穴に基づく）エレクトロポレーションサイズの金属次いで高速で細胞に浸透するのに使用される粒子）、および形質導入（ウイルス導入遺伝子の送達ビヒクルとして使用される）。現時点では、マイクロインジェクション、最小限の試薬を用いた100％の効率で任意のソリューションを提供する利点を保持している唯一の方法である。また、単回注射液は処理の複雑な混合物から構成することができる。この技術は、成功するために使用されているLYなウニ3,4、ゼブラフィッシュ5、マウス6、カエル7、牛8だけでなく、組織培養9の単一細胞などの多数の種から卵や胚をマイクロインジェクション。後で発達段階での単一割球の注射はまた10月12日に実施されている。 マイクロインジェクションの現在の方法は、最初に平本10によって記載された加圧注入法に基づいているが、大きな進歩は、このプロセスの最適化に向けて行われている。優れたマイクロインジェクション技術は、他の場所で11を記載されており、ここで我々は現在、ウニ（Strongylocentrotus purpuratus）新たに受精卵をマイクロインジェクションするために使用され、特定のいずれかの方法を説明します。一世紀以上の場合は、ウニ、貴重な実験モデル15,16となっている。ウニ​​は、進化的に密接に（私たちも含む）脊索動物との分析に関連しているそれらのゲノムは、彼らが人間の17のように、すべての主要な遺伝子ファミリーが含まれていることを明らかにした。それらは、同期を容易に操作することができる透明な胚を現像多数を生成する。モデル生物としてウニを使用して、ウニのコミュニティが受精過程18〜21の我々の理解に貢献してきました、細胞生物学的プロセス22〜24、および遺伝子調節ネットワーク（GRNs）25〜28。 ウニ​​の受精卵へのマイクロインジェクションには、いくつかのステップが必要です。まず、卵は、従来の注射（後述）に固定化される必要がある。マイクロインジェクション皿を負に帯電した卵が3を接着することができ、正に荷電した表面を作成し、硫酸プロタミン（PS）でコーティングされている。卵は、自然海水又は人工海水（pH8.0）中で2回洗浄した酸性海水に10分間液（pH 5.15）中でインキュベートしdejelliedされる。 dejellied卵を慎重に一直線に漕いている受精29の結果、卵の皮質の顆粒から分泌されるovoperoxidaseの活性を阻害するのに必要とされる1 mMの3 -アミノトリアゾール（3-AT）の存在下でのPSでコーティングされた皿の中央にある。このステップは、受精エンベロープの硬化を防止し、マイクロインジェクション針進入を容易にすることが重要である。 1mMの3-ATの代替として、10mMのパラアミノ安息香酸（PABA）を用いることができる。注射液は、特殊なマイクロローディングピペットチップを用いてマイクロインジェクション針にロードされ、マイクロマニピュレータ及び圧力装置（ 図1）に取り付けられたホルダに取り付けられている。各針は、別々の日に複数の実験における個々の接合体のマイクロインジェクションするために使用することができる。接合体が硬化するまで、マイクロインジェクションは、10〜15分間行うことができる。接合体は、その後、15℃の海水培養で洗浄する胚は胞胚段階に孵化に到達すると、それらはFERのコンポーネントを消化孵化酵素をリリースtilizationエンベロープ30と、それらが自然に、PSでコーティングされた皿から切り離すことができます。必要ならば、胚は、胚に穏やかに穏やかに海水を吹き付け口ピペットまたはパスツールピペットを用いてディッシュから剥離することができる。記載された方法は、下流の分析のためのハイスループット法を提供する、単一皿上100-400新たに受精した卵の効率的かつ信頼性の高いマイクロインジェクションを可能にする。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:793px;" width="794">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass pasteur pipettes</td>
			<td style="width:200px;">VWR</td>
			<td style="width:211px;">14673-043</td>
			<td style="width:167px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Inverted microscope Axiovert 40C</td>
			<td style="width:200px;">Zeiss</td>
			<td style="width:211px;">4109431007990000</td>
			<td>Injection microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microloader tips</td>
			<td style="width:200px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:211px;">5242 956.003</td>
			<td style="width:167px;">Load injection solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nylon filter mesh 80 &#956;m</td>
			<td style="width:200px;">Amazon.com</td>
			<td style="width:211px;">03-80-37</td>
			<td style="width:167px;">Filter eggs to get rid of debris</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">P20 or P200 Aerosol Barrier Pipette Tips</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:211px;">02707432 or 02707430</td>
			<td style="width:167px;">Part of a mouth pipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Parafilm</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:211px;">13 374 12</td>
			<td style="width:167px;">Part of a mouth pipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Polyethylene tubing</td>
			<td style="width:200px;">Intramedic</td>
			<td style="width:211px;">PE-160</td>
			<td style="width:167px;">Part of a mouth pipette</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Protamine sulfate</td>
			<td style="width:200px;">MP Biomedicals, LLC</td>
			<td style="width:211px;">194729</td>
			<td style="width:167px;">Attach dejellied eggs to injection dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sea urchins S. purpuratus</td>
			<td>Pt. Loma Marine Invertebrate Lab</td>
			<td style="width:211px;">N/A</td>
			<td style="width:167px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sea water</td>
			<td style="width:200px;">any pet store</td>
			<td style="width:211px;">Instant Ocean</td>
			<td style="width:167px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sterile 60 mm x 15 mm Polystyrene Petri Dish</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:211px;">0875713A</td>
			<td style="width:167px;">Injection dishes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Three-Axis Coarse Positioning Micromanipulator MMN-1</td>
			<td style="width:200px;">Narishige</td>
			<td style="width:211px;">9124</td>
			<td>Manipulate injection needle</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Three-Axis Joystick Type Oil Hydraulic Fine Micromanipulator MMO-202ND</td>
			<td style="width:200px;">Narishige</td>
			<td style="width:211px;">9212</td>
			<td>Manipulate injection needle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Transfer pipettes</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:211px;">13-711-9AM</td>
			<td style="width:167px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vertical needle puller </td>
			<td style="width:200px;">Narishige</td>
			<td style="width:211px;">PC-10</td>
			<td>Pull injection needles</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput microinjections of sea urchin zygotes

細胞および胚へのマイクロインジェクションは、広範囲の生物学的プロセスを研究するために使用される一般的な技術である。この方法では、処理溶液の少量は、物理的に個々の固定化細胞または胚を注入するために使用されているマイクロインジェクション針の中に装填される。ハイスループット配信のためにこの手順を実行するには、最初のトレーニングの必要性にもかかわらず、マイクロインジェクションは、細胞、卵や胚に最大の効率と（サンプルの複雑な混合物を含む）処理溶液の多種多様な再生可能な配信を提供しています。微量注入への応用DNAの送達は、mRNAが、組換えタンパク質、機能の獲得、および機能試薬の損失を構築挙げられる。蛍光または比色染料がインスタント効率的な配信の可視化だけでなく、送達される溶液の量を確実に正常化するためのツールを有効にするために注入された溶液に添加される。記載されている方法は、100〜400ウニzのマイクロインジェクションを可能にします10〜15分内ygotes。

GFPとmCherryレポーター構築物は、in vitroで転写され、新たに受精卵に微量注入していた。胚（胞胚期まで）24時間15℃でインキュベートし、ツァイスオブザーバーZ1顕微鏡を用いて画像化した。レポーター構築物の注入は任意の発達障害（ 図6）には至らなかった。蛍光シグナルの定量化のため、画像取得を最大限蛍光画素（ 図6D〜F）を捕捉するために低?...

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High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

マイクロインジェクションは、卵、胚、および種々の種の細胞にDNA構築物、mRNAは、モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは他の治療法を送達するために使用される一般的な技術である。

ウニ​​接合体のハイスループットマイクロインジェクション

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

high-throughput-microinjections-of-sea-urchin-zygotes

Research

JoVE Journal

Biology

14.4K ビュー.  University of Delaware. マイクロインジェクションは、卵、胚、および種々の種の細胞にDNA構築物、mRNAは、モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは他の治療法を送達するために使用される一般的な技術である。 

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Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

急性腎障害を研究するためにゼブラフィッシュ幼生の静脈内Microinjections

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

生物学

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

ハイスループット酵母プラスミドの過剰発現の画面

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

リグノセルロース系材料のためのハイスループット糖化アッセイ

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

アフィニティータグ組換えタンパク質のハイスループット精製

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae zygotes result from the fusion of haploid cells of distinct mating type (MATa, MATalpha) and give rise to corresponding stable diploids that successively generate as many as 20 diploid progeny as a result of their strikingly asymmetric mitotic divisions 2. Zygote formation is orchestrated by a complex sequence of events: In this process, soluble mating factors bind to cognate receptors, triggering receptor-mediated signaling cascades that facilitate interruption of the cell cycle and culminate in cell-cell fusion. Zygotes may be considered a model for progenitor or stem cell function.
Although much has been learned about the formation of zygotes and although zygotes have been used to investigate cell-molecular questions of general significance, almost all studies have made use of mating mixtures in which zygotes are intermixed with a majority population of haploid cells 3-8. Many aspects of the biochemistry of zygote formation and the continuing life of the zygote therefore remain uninvestigated.
Reports of purification of yeast zygotes describe protocols based on their sedimentation properties 9; however, this sedimentation-based procedure did not yield nearly 90% purity in our hands. Moreover, it has the disadvantage that cells are exposed to hypertonic sorbitol. We therefore have developed a versatile purification procedure. For this purpose, pairs of haploid cells expressing red or green fluorescent proteins were co-incubated to allow zygote formation, harvested at various times, and the resulting zygotes were purified using a flow cytometry-based sorting protocol. This technique provides a convenient visual assessment of purity and maturation. The average purity of the fraction is approximately 90%. According to the timing of harvest, zygotes of varying degrees of maturity can be recovered. The purified samples provide a convenient point of departure for "-omic" studies, for recovery of initial progeny, and for systematic investigation of this progenitor cell.

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

To purify zygotes of S. cerevisiae, haploid cells of opposite mating type were engineered to express red or green fluorescent proteins, co-incubated to allow zygote formation, and fractionated using a flow cytometry-based protocol. The highly-enriched fraction enables subsequent "-omic" studies, recovery of initial progeny, and systematic investigation of zygote morphogenesis.

のフローサイトメトリーベースの精製<em&gt; S.セレビ</em&gt;受精卵

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

ハイスループットシーケンシングのための高品質クロマチン免疫沈降DNAテンプレート（チップ-SEQ）の生成

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

ルシフェラーゼを発現する組換えウイルスの高スループット滴定

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and evolution of developmental processes. The sea star, Patiria miniata, is gaining prevalence as a model system for these types of studies which were previously performed almost exclusively in the sea urchins, Strongylocentrotus purpuratus and Lytechinus variegatus. An advantage of these model systems is the ease of producing modified embryos in which a particular gene is up or downregulated, labeling a group of cells, or introducing a reporter gene. A single microinjection method is capable of creating a wide variety of such modified embryos. Here, we present a method for obtaining gametes from P. miniata, producing zygotes, and introducing perturbing reagents via microinjection. Healthy morphant embryos are subsequently isolated for quantitative and qualitative studies of gene function. The availability of genome and transcriptome data for this organism has increased the types of studies that are performed and the ease of executing them.

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Methods that produce morphant embryos are essential to study developmental mechanisms and gene regulatory networks. The sea star Patiria miniata is an emerging model system for these studies. Here we present a protocol for obtaining gametes, producing cultures of embryos, and rapid microinjection of zygotes from this species.

のマイクロインジェクション法<em&gt; Patiria minata</em&gt;接合体

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

ハイスループットのアプリケーションのための大人のゼブラフィッシュハーツの回復

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

転写後調節される遺伝子の化学モジュレーターのためのハイスループットスクリーニング

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Methods Article

ウニ接合体のハイスループットマイクロインジェクション

Methods Article

ウニ​​接合体のハイスループットマイクロインジェクション

ウニ接合体のハイスループットマイクロインジェクション