著者らは、クローズドシステムの知識、バッグのデザイン、バッグシーラーや溶接機のローンだけでなく、HYPERStackの回路図に袋を作成すると彼らの支援についてロンザウォーカーに感謝します。

1。 HYPERStack容器 - ガス透過性材料技術の背景<ol><li> HYPERStack容器は、細胞代謝のために76.2micronガス透過性高分子膜を介してガス交換に依存している細胞の閉鎖系培養のための多層容器です。 </li><li> HYPERStack容器は、容器内の細胞を上記の&quot;ヘッドスペース&quot;を持っていないという点で、従来の細胞培養容器とは異なります。むしろ容器内のガス交換のためのこの&quot;ヘッド&quot;を含むより、ガス透過性の製品は大気に開放されている各培養チャンバーの下に空気のスペースを（&quot;気管&quot;のスペースと呼ばれる）がある。 </li><li>この気管スペースは、同等のガス交換を持っている容器の各細胞培養室で増殖する細胞を可能にします。 </li><li>ガス透過性フィルムは、無菌環境を維持しながら、ガス交換が発生することができます。複数の層のそれぞれについて、すべての流体の操作は、単一のエントリのポートを介して行われる。 </li></ol> 2。 HYPERStackの船舶のコンポーネントの概要<ol><li> Stacketteは、トッププレートとガス透過膜で構成されている個々の細胞培養のコンパートメントです。細胞は、このコンパートメント内で培養される。 </li><li>液体マニホールドはHYPERStackモジュール内で一緒に12 stacketteの層のそれぞれを接続します。モジュールは、12層の倍数で血管を形成するために配管で接続されています。マニホールドは、ユーザーが全体の容器に一つの流体操作を行うことができます。 </li><li>エアマニホールドはまた一緒にstacketteの層を接続しますが、それは流体の追加が発生したときに容器から空気を置換するために使用。それは、充填時に使用する上限ラインが含まれています。 </li><li>気管スペースには、ガス交換は、各レイヤー&quot;ガス透過膜を介して行うことが可能なため、各stackette層との間にオープンエアの空間です。 </li><li>液体ハンドリングチューブを液体マニホールドに接続され、すべてのクロー​​ズドシステムの流体操作を行うために使用されます。このコンポーネントは、カスタマイズすることができます。 </li><li>ベントチューブは、空気マニホールドに接続してエアフィルタが含まれており、無菌性を維持しながら、余分な空気を解放するために使用されています。 </li><li>チェースチューブは、フィルタとクランプがあり、液体ハンドリングのチューブに接続されており、容器に充填した後、液体ハンドリングチューブからの流体を排気するために使用されます。 </li><li>コー​​ニングのスタックマニピュレータまたはCSMは、使用中に正しい位置に船を置くことを支援するためのハンドリング装置です。 </li><li>充填ウェッジは、手動でHYPERStack容器に充填する際に使用するステンレス鋼アシストです。 </li></ol> 3。 HYPERStackの船舶に使用されるガス透過膜を介してガスの拡散の結果<ol><li>ベントヘッドスペースと伝統的な細胞増殖のシステムでは、メディア内の酸素は、培養の3日間で50％の平均を消耗しています。 （図1） </li><li>同じ細胞増殖システムでは、メディア3mmの高さで酸素勾配は、細胞層にあるよりも、ヘッドスペースの接合部へのメディアではほぼ50％大きくなります。 （図2） </li><li> 76.2micronのガス透過性のポリスチレン膜を介して酸素の拡散は、メディアの2.6ミリメートルを介して拡散に等しいです。 HYPERStack船で使用されるガス透過膜は、ガス交換は、細胞層で発生することができます。 </li><li>細胞がコンフルエントに成長するにつれてHYPERStack船の気管空間における酸素の％は一定に保たれます。 （図3） </li></ol> 4。メディアバッグの準備<ol><li> HYPERStack - 12層の血管は、メディアの1.3Lを受け取り、HYPERStack - 36層の血管は、メディアの3.9Lを取ります。 </li><li>前に袋詰めメディアを接種するために血清を使用する場合、チューブはメディアの袋に血清袋を溶接してよく混ぜる。 </li><li>大きなバッグのクランプを使用してバッグ内のメディアの約300 mLをオフクランプ。これは、すべての接種した細胞を充填し、どれもメディアの袋に残っていない時に使用されるようになります。袋のスタンドにメディアの袋を置きます。 </li></ol> 5。接種メディア<ol><li>細胞懸濁液を取り付けたチューブと注射器を埋める。チューブ溶接3 / 16&quot;メディアのバッグに細胞懸濁液を含む注射器からチューブ。 </li><li>メディアのバッグに細胞懸濁液を注入し、よく混合する。 </li></ol> 6。手順を埋める<ol><li>チューブはHYPERStack容器の3 / 8&quot;液体ハンドリングのチューブに接種したメディアの袋を溶接。（無菌接続するか、多目的で接続する（MPCは）を使用して、また容器へのメディアの袋を添付することができます）。 </li><li> HYPERStackで液体ハンドリングとチェースチューブのクランプを閉じます。 </li><li>フックベントフィルターチューブCSM上に保持するクランプに、負荷の位置でCSMにHYPERStack 36レイヤの容器を置きます。蓋を締めて、塗りつぶしの位置にCSMを移動する。正しい充填位置に容器を入れて、エアフィルターは、格納操作中に濡れを防ぐために、最も高い位置に今である。 10 °の角度許可equilibr充填時の層への液体について注意深く検討する必要があります。充填ウェッジで、その側に置かHYPERStack - 12層の容器は、充填のための正しい位置にあります。 </li><li> HYPERStack容器（より高いではない）と同じレベルに袋を置いて充填ラインから澄んだ空気。チェースチューブクランプを保つことは閉じ、容器を入力して流体を許可する液体処理管クランプとメディアのバッグのクランプを開きます。 </li><li>袋のスタンドを使用して、容器内への細胞懸濁液の流れを支援するメディアのバッグを引き上げる。 </li><li>接種したメディアのすべてが血管に入るまで、容器を充填します。媒体の300mLのは、まだメディアの袋の上部に残るはずです。容器の充填継続するメディアの袋からクランプを外します。液体は、上側の空気のマニホールドに近づくと、充填にわたって防止するために、メディアの袋を下げて充填速度を遅くする。徐々に充填ラインへの液体レベルをもたらし、液体ハンドリングのチューブをクランプする。 </li></ol> 7。層に液体をロックする分離方法<ol><li>多様体の両​​方のセットが最も高い位置になるように、分離位置にCSMのHYPERStackの容器を持参し、容器の高さの下にメディアの袋を下げてください。 HYPERStack - 12層の容器は、容器の側面に手を置き、充填くさびを持ち上げるために他を使用して分離位置に持ち上げることができます。 </li><li>直立した状態で開催されたチェイスのフィルタで、チェイスチューブクランプを開きます。これはメディアの袋に戻し、液体ハンドリングのチューブでメディアを空にするか、追うだろう。チューブが空になると、メディアのバッグのチューブのクランプを閉じてください。 </li><li>直立した状態で追いかけるチューブフィルタを保ち、残りの液体が容器に入ると平衡できるようにHYPERStackに液体ハンドリングのチューブにクランプを開きます。これが発生するために1-2分待ちます。 </li><li>多様体が左にあるように、CSMでHYPERStack容器を回して。 CSMの負荷の位置に容器を下げます。少し左にHYPEStack - 12層の血管をロッキングすること充填ウェッジの削除を許可します。チェイスと液体ハンドリングチューブの両方にクランプを閉じます。 </li><li>メディアのバッグは、今や容器から除去することも、後で収穫の手順で使用するために取り付けられて残ることがあります。添付されたメディアの袋を格納するために、HYPERStack容器の収納トレイに保持バンドの下に空の袋と袋に残っているメディア、および場所をロールバックします。 </li><li>インキュベーターにHYPERStack容器を移動する。血管の世話を運ぶときにエアベントフィルターに入るから液体なるように注意する必要があります。これは、わずかに上向きHYPERStackのマニホールドの端を傾けることによって達成される。 </li></ol> 8。収穫プロトコル<ol><li>収穫の手順を開始するには、チューブは、収穫袋のアセンブリを形成するために一緒に細胞解離液とクエンチの袋を溶接。すべてのチューブのクランプが閉じていることを確認します。 （実証するために漫画を使用してください） </li><li>インキュベーターからHYPERStack容器を削除、保持バンドの下からのメディアの袋を解放し、袋のスタンドにハングアップする。負荷の位置でCSMに容器を置き、血管を保護するために蓋を締めます。保持クランプにベントチューブをフックし、フィルの位置にCSMを移動する。 </li><li>メディアの袋チューブとメディアが添付された袋に流れるように容器の液体ハンドリングチューブのクランプを開き、袋のスタンドのメディア袋がHYPERStackより低くぶら下がっていることを確認して。 </li><li>一度船が約である¾空の、最後の空の位置にCSMの設定を変更してください。 HYPERStack容器と液体ハンドリングチューブが空のときに、費やされるメディアのバッグのチューブのクランプを過ぎてメディアを追跡するためにチューブを持ち上げ、その後液体ハンドリングチューブのクランプと過ごしたメディアバッグのチューブのクランプの両方を閉じます。 </li><li>管の溶接による収穫袋のアセンブリと過ごしたメディアの袋を交換して、袋のスタンドを使用してHYPERStackの高さは上記の細胞解離バッグのアセンブリの高さを上げる。 </li><li>平衡の位置にCSMを置きます。細胞解離液のチューブのクランプを開き、HYPERStackにソリューションを移す。転送が完了すると、液体ハンドリングチューブと細胞解離液をチューブにクランプを閉じます。 </li><li>負荷の位置にCSMをもたらす。水平方向の位置決めレバーが開いて保持することにより、穏やかに細胞層を介してソリューションを配布し、ホイールを使用して側に船の側を揺らし。容器は、時折ソリューションの平等な分配を維持するためにロッキングの間に平衡の位置に戻されることがあります。それは、層が完全にコーティングされていることを視覚的に明らかでないかもしれませんが、解離液は均等に細胞の表面に分散されます。解決策が十分に分散されると、負荷の位置でHYPERStackをロックするためにCSMのレバーを離します。この位置でHYPERStackを残すあなたの細胞に必要な解離時間の間。 </li><li>細胞がはがれるしたら、ガイドとして濁度を用いて、平衡の位置にCSMを移動する。ケアは、以上の細胞を消化しないように注意してください。クエンチ袋クランプとクエンチメディアが血管を入力できるようにするHYPERStackの液体ハンドリングのチューブクランプを開きます。転送が完了したらHYPERStackの液体ハンドリングのチューブのクランプを閉じます。 </li><li>負荷の位置にCSMを戻し、サイドに船の側の岩に水平方向の位置決めレバーを押し続けます。 </li><li>袋のスタンドを使用して、HYPERStackのレベル以下に収穫袋のアセンブリの位置を下げる。 、空の位置にCSMを調整して容器の液体ハンドリングのチューブのクランプを開き、バッククエンチ袋に細胞溶液を移す。負荷の位置にCSMを戻し、チューブシーラーを用いて容器から収穫袋のアセンブリを取り外してください。細胞溶液は、処理の準備ができています。 </li></ol> 9。代表的な結果<ul><li>標準ポリスチレンの表面からのガス透過性ポリスチレン表面への変換時に最適化される時間のニーズを収穫。細胞はHYPERStack製品でより速く解放する傾向がある。 </li><li>顕微鏡下で細胞を表示するには通気口と液体ハンドリングのチューブは、オフクランプする必要があります。マニホールドは、顕微鏡のステージ上で、下向きのと、上下逆さまにHYPERStackの容器を置きます。 </li><li>予防のステップは、それらが機能停止の原因となる使用中にフィルターを湿潤を避けるために撮影することができます。しないことでHYPERStack容器を充填し、通気口と追いかけチューブを保つ上から濡れが発生しないはず、クランプが開いているときに上昇。 </li><li>チューブ上の閉鎖クランプの圧力は、クランプが開かれた後、それが閉じたままになります。反対方向にチューブをつまんでは、それを開くでしょう。 </li><li>重力のフィードを介してHYPERStackの容器を出入りするメディアフロー時間はHYPERStack容器内のメディアの最上位レベルの間にメディアの高さの違いとメディアのコンテナ内のメディアのトップレベルに基づいています。距離感が大きくなればなるほど、流れ速い。最大流量は1.5L/minのフィルタの定格によって制限されます。 </li><li> HYPERStack容器内の適切な充填量を維持することが細胞増殖のチャンバー内の空気気泡の形成を防ぐことができます。気泡は、サンプリングや蒸発水損失によるunhumidified環境でインキュベートすることにより発生することができます。追加の流体がエンドユーザによって追加する必要がある場合は、サンプリング量と周波数だけでなく、インキュベーションの条件が決定されます。 </li></ul><img src="/files/ftp_upload/2499/2499fig1.jpg" alt="図1" /> 図1標準的な細胞培養容器内のメディアの酸素欠乏。図は3日以上の細胞のレベルでの酸素のmg / Lの減少を示しています。 <img src="/files/ftp_upload/2499/2499fig2.jpg" alt="図2" /> 図2標準的な細胞培養容器の培地中の酸素勾配。図は、酸素のmg / Lは細胞層よりもヘッドスペースの交差点へのメディアで最大であることを示しています。 <img src="/files/ftp_upload/2499/2499fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。細胞増殖中HYPERStackの気管空間における酸素の割合。図は、96時間にわたって、それぞれのガス透過膜の底部を供給する層との間の酸素の割合は、、一定であることを示しています。これは、コンフルエントに成長中に酸素をアクセスするために細胞の能力を示しています。

7745209：HYPERStack容器のガス透過性の技術は米国特許＃の下に覆われている。著者は、この記事で使用する楽器を生成するコーニングライフサイエンス、Incの従業員です。

HYPERStack容器は、正常に成長し、プライマリおよび幹細胞を設計しています。容器内への流体の追加は、重力供給によって、また、無菌のメディアのコンテナからポンプによる無菌バッグの接続を介して行われている。容器は、同じ体積のフットプリントの積層板製品の対成長領域にある以上の2.5倍に増加しています。 HYPERStack - 12が6,000 cm 2の成長分野を持っている、HYPERStack - 36は、18,000 cm 2の成長分野を持っており、HYPERStack - 120は、成長地域の60,000 cm 2としています。表面積を増やすことにより、ユーザは同一の細胞集団またはロットからの複数のセルを生産し、ばらつきを削減することができます。彼らはまた、同じセルの出力を達成するため、または人々、クリーンルームのスイート、またはインキュベータを追加することなく、セルの出力を高めるためにより少ない容器を使用して領域および/または労働を節約することができます。システムは、低微粒子アセンブリのメソッドを使用して、接着剤を使用せずに生成されます。それは、チューブセットとフィルターにあらかじめ組み込まれていますクローズドシステム、トリプル重包装と滅菌に提供されています。

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>1.5L Bagged Media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>TBD</td>
<td>1350ml media + 150ml serum (if required)</td>
</tr>
<tr>
<td>4.0L Bagged Media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>TBD</td>
<td>3600ml media + 400ml serum (if required)</td>
</tr>
<tr>
<td>HYPERStack Vessel-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>10012</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HYPERStack Vessel-36</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>10036</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Filling Wedge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>10040</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stack Manipulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>TBD</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HyQtainer Sub-Assembly Sampling Device</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>HyClone/LonzA</td>
<td>SH3B0324.01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>600ml Bagged Media Quencher (10% FBS IMDM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>TBD</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>600ml Cell Dissociation Solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>TBD</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

closed system cell culture protocol using hyperstack vessels with gas permeable material technology

マイクロビーズが最適な選択ではない場合、大容量接着細胞培養は、現在スタックプレートの細胞増殖製品の標準化されています。 HYPERStack船は、現在のスタックプレート製品からのクローズドシステムのスケールアップが可能と同じ体積のフットプリントで、&gt; 2.5倍以上のセルを実現。 HYPERStack船ガス交換が発生することができるガス透過性材料を介して関数は、したがって、容器内の内部ヘッドスペースが不要になります。ヘッドスペースの除去は細胞増殖を最小限にするために発生するコンパートメントは、同じ体積のフットプリント内で細胞増殖の表面積の複数の層をできるように、スペースを減らすことができます。 このような細胞療法やワクチンの生産などの多くのアプリケーションでは、クローズドシステムは、細胞の成長と収穫のために必要です。 HYPERStack容器は、メディアの袋または他の方法からチューブを介して細胞と試薬の追加および削除することができます。 このプロトコルは、細胞、クローズドシステムの細胞増殖のプロトコル、および様々な収穫方法の代謝のニーズを満たすためにHYPERStack船、ガスの拡散の結果で使用されるガス透過性材料の背後にある技術について説明します。

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Closed System Cell Culture Protocol Using HYPERStack Vessels with Gas Permeable Material Technology

技術、プロトコル、および高収率で接着細胞の培養に使用コーニングHYPERStack船と付属品の取り扱いへの導入。プロトコルは、現在のスタック板製品を介して細胞の回収を増加させるための閉鎖系容器を使用する方法について説明します。

ガス透過性材料技術とHYPERStackの船舶を使用するクローズドシステムの細胞培養のプロトコル

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice.   ...

closed-system-cell-culture-protocol-using-hyperstack-vessels-with-gas

Research

JoVE Journal

Biology

18.7K ビュー.  Corning Life Science. 技術、プロトコル、および高収率で接着細胞の培養に使用コーニングHYPERStack船と付属品の取り扱いへの導入。プロトコルは、現在のスタック板製品を介して細胞の回収を増加させるための閉鎖系容器を使用する方法について説明します。

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Principles of Site-Specific Recombinase (SSR) Technology

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular biology. Site-specific recombinases are proteins that bind to distinct DNA target sequences. The Cre/lox system was first described in bacteriophages during the 1980's. Cre recombinase is a Type I topoisomerase that catalyzes site-specific recombination of DNA between two loxP (locus of X-over P1) sites. The Cre/lox system does not require any cofactors. LoxP sequences contain distinct binding sites for Cre recombinases that surround a directional core sequence where recombination and rearrangement takes place. When cells contain loxP sites and express the Cre recombinase, a recombination event occurs. Double-stranded DNA is cut at both loxP sites by the Cre recombinase, rearranged, and ligated ("scissors and glue"). Products of the recombination event depend on the relative orientation of the asymmetric sequences.
SSR technology is frequently used as a tool to explore gene function. Here the gene of interest is flanked with Cre target sites loxP ("floxed"). Animals are then crossed with animals expressing the Cre recombinase under the control of a tissue-specific promoter. In tissues that express the Cre recombinase it binds to target sequences and excises the floxed gene. Controlled gene deletion allows the investigation of gene function in specific tissues and at distinct time points. Analysis of gene function employing SSR technology --- conditional mutagenesis -- has significant advantages over traditional knock-outs where gene deletion is frequently lethal.

Principles of Site-Specific Recombinase SSR Technology

The advent of site-specific recombinase (SSR) technology and the Cre/lox system has led to numerous advances in molecular biology, and has proven itself as a valuable tool for assessing gene function in transgenic animals. This interview discusses the mechanism of site specific recombination by Cyclization recombinase (Cre) and how the use of this enzyme has led to the development of conditional mutagenesis, which has significant advantages over traditional knock out strategies.

部位特異的リコンビナーゼ（SSR）技術の原理

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular ...

生物学

Engineering Cell-permeable Protein

The protein transduction technique enables the direct delivery of biologically active material into mammalian cells [for review see 1,2]. For this one can make use of the translocating ability of so-called cell penetrating peptides (CPPs), also designated as protein transduction domains (PTDs). The TAT-CPP derived from the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Tat (trans-activator of transcription) protein has been widely used. The positively charged TAT promotes cell permeability thereby overcoming the barriers of the cellular membrane by endocytosis or/and direct membrane penetration2. In combination with a nuclear localization signal (NLS) fusion proteins are able to enter the nucleus exhibiting functionality. Our video presentation demonstrates, as an exemplification for the engineering of cell-permeable proteins, the construction, production and application of a cell-permeable version of the DNA-modifying enzyme Cre.
Cre is a site-specific recombinase that is able to recognize and recombine 34 base pair loxP sites in mammalian cells in vitro and in vivo. Therefore the Cre/loxP system is widely used to conditionally induce mutations in the genome of living cells3,4. The delivery of active Cre recombinase to cells, however, represents a limitation.
We describe the pSESAME vector system, which allows a direct insertion of the gene-of-interest and provides a platform to rapidly clone different domains and tags used within the vector in a convenient and standardized manner. Rearranging of the different tags has been shown to modify the biochemical properties of the fusion proteins providing a possibility to achieve higher yield and better solubility. We demonstrate how to express and purify recombinant cell-permeant proteins in and from E. coli. The functionality of the recombinant Cre protein is finally validated in cell culture by assessing its intracellular recombinase activity.

Protein transduction enables the direct delivery of biologically active proteins into cells. In contrast to conventional methods such as DNA transfection or viral transduction this non-invasive paradigm allows highly efficient cellular manipulation in a titratable manner circumventing cellular toxicity and the risk of oncogenic transformation by permanent genetic modification.

エンジニアリング細胞透過性のタンパク質

The protein transduction technique enables the direct delivery of biologically active material into mammalian cells [for review see 1,2]. For this one can ...

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development and growth of mammalian embryos are critically dependent on the function of the placenta, WEC technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages during embryonic day (E) 6.5-E12.5 in the mouse or E8.5-E14.5 in the rat 2, 3, 4. In WEC, we can directly target desired areas of embryos using fine glass capillaries because embryos can be manipulated under the microscope. Therefore, rodent WEC is very useful technique when we want to study dynamic developmental processes of postimplanted mammalian embryos. Up to date, several types of WEC systems have been developed 1. Among those, the rotator-type bottle culture system is most popular and suitable for long-term culture of embryos at midgestation, i.e., after E9.5 and E11.5 in the mouse and rat, respectively 1. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat WEC after E12.5 using a refined model of the original rotator system, which was designed by New and Cockroft 5, 6, and introduce various applications of WEC technique for studies in mammalian developmental biology.

Whole embryo culture technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat whole embryo culture after E12.5 using the rotator-type bottle culture system.

腱板断型ボトルの培養システムを使用してげっ歯類全胚培養の方法

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

Determining Cell Number During Cell Culture using the Scepter Cell Counter

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and accuracy. Cell counts are important for monitoring cell health and proliferation rate, assessing immortalization or transformation, seeding cells for subsequent experiments, transfection or infection, and preparing for cell-based assays. It is important that cell counts be accurate, consistent, and fast, particularly for quantitative measurements of cellular responses.
Despite this need for speed and accuracy in cell counting, 71% of 400 researchers surveyed1 who count cells using a hemocytometer. While hemocytometry is inexpensive, it is laborious and subject to user bias and misuse, which results in inaccurate counts. Hemocytometers are made of special optical glass on which cell suspensions are loaded in specified volumes and counted under a microscope. Sources of errors in hemocytometry include: uneven cell distribution in the sample, too many or too few cells in the sample, subjective decisions as to whether a given cell falls within the defined counting area, contamination of the hemocytometer, user-to-user variation, and variation of hemocytometer filling rate2.
To alleviate the tedium associated with manual counting, 29% of researchers count cells using automated cell counting devices; these include vision-based counters, systems that detect cells using the Coulter principle, or flow cytometry1. For most researchers, the main barrier to using an automated system is the price associated with these large benchtop instruments1.
The Scepter cell counter is an automated handheld device that offers the automation and accuracy of Coulter counting at a relatively low cost. The system employs the Coulter principle of impedance-based particle detection3 in a miniaturized format using a combination of analog and digital hardware for sensing, signal processing, data storage, and graphical display. The disposable tip is engineered with a microfabricated, cell- sensing zone that enables discrimination by cell size and cell volume at sub-micron and sub-picoliter resolution. Enhanced with precision liquid-handling channels and electronics, the Scepter cell counter reports cell population statistics graphically displayed as a histogram.

The Scepter Cell Counter is a handheld automated device that can be used to count cells, monitor cell diameter and volume, and be used to check the health and quality of cellular populations from one culture to the next.

セプターのセルカウンターを用いて細胞培養中の細胞数の決定

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and ...

A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids can lead to severe side effects. Test systems are needed to search for novel compounds influencing glucocorticoid signaling in vivo or to determine unwanted effects of compounds on the glucocorticoid signaling pathway. We have established a transgenic zebrafish assay which allows the measurement of glucocorticoid signaling activity in vivo and in real-time, the GRIZLY assay (Glucocorticoid Responsive In vivo Zebrafish Luciferase activitY). The luciferase-based assay detects effects on glucocorticoid signaling with high sensitivity and specificity, including effects by compounds that require metabolization or affect endogenous glucocorticoid production. We present here a detailed protocol for conducting chemical screens with this assay. We describe data acquisition, normalization, and analysis, placing a focus on quality control and data visualization. The assay provides a simple, time-resolved, and quantitative readout. It can be operated as a stand-alone platform, but is also easily integrated into high-throughput screening workflows. It furthermore allows for many applications beyond chemical screening, such as environmental monitoring of endocrine disruptors or stress research.

We describe the procedure and data analysis of a chemical screening system for glucocorticoid stress hormone signaling using zebrafish larvae: the Glucocorticoid Responsive In vivo Zebrafish Luciferase activitY (GRIZLY) assay. The assay sensitively and specifically detects effects on glucocorticoid signaling by compounds that require metabolization or affect endogenous glucocorticoid production.

ゼブラフィッシュ幼虫ルシフェラーゼレポーターシステムを用いたグルココルチコイドシグナル伝達のための化学スクリーニング法

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids ...

Discovering Protein Interactions and Characterizing Protein Function Using HaloTag Technology

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous proteomes, including those from viruses, bacteria, and yeast.&#160; In comparison, analysis of the human proteome lags behind, partially due to the sheer number of proteins which must be studied, but also the complexity of networks and interactions these present. To specifically address the challenges of understanding the human proteome, we have developed HaloTag technology for protein isolation, particularly strong for isolation of multiprotein complexes and allowing more efficient capture of weak or transient interactions and/or proteins in low abundance. &#160;HaloTag is a genetically encoded protein fusion tag, designed for covalent, specific, and rapid immobilization or labelling of proteins with various ligands. Leveraging these properties, numerous applications for mammalian cells were developed to characterize protein function and here we present methodologies including: protein pull-downs used for discovery of novel interactions or functional assays, and cellular localization. We find significant advantages in the speed, specificity, and covalent capture of fusion proteins to surfaces for proteomic analysis as compared to other traditional non-covalent approaches. We demonstrate these and the broad utility of the technology using two important epigenetic proteins as examples, the human bromodomain protein BRD4, and histone deacetylase HDAC1.&#160; These examples demonstrate the power of this technology in enabling &#160;the discovery of novel interactions and characterizing cellular localization in eukaryotes, which will together further understanding of human functional proteomics. &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;

HaloTag technology is a multifunctional technology which has shown significant success in isolation of both small and large protein complexes from mammalian cells.&#160; Here we highlight the advantages of this technology compared to existing alternatives and demonstrate its utility to study numerous aspects of protein function inside eukaryotic cells.

タンパク質相互作用を発見したHaloTag技術を用いたタンパク質機能の特性評価

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are produced by differentiated thyrocytes, organized in closed spheres called follicles, while calcitonin is synthesized by C-cells, interspersed in between the follicles and a dense network of blood capillaries. Although adult thyroid architecture and functions have been extensively described and studied, the formation of the &#8220;angio-follicular&#8221; units, the distribution of C-cells in the parenchyma and the paracrine communications between epithelial and endothelial cells is far from being understood.
This method describes the sequential steps of mouse embryonic thyroid anlagen dissection and its culture on semiporous filters or on microscopy plastic slides. Within a period of four days, this culture system faithfully recapitulates in vivo thyroid development. Indeed, (i) bilobation of the organ occurs (for e12.5 explants), (ii) thyrocytes precursors organize into follicles and polarize, (iii) thyrocytes and C-cells differentiate, and (iv) endothelial cells present in the microdissected tissue proliferate, migrate into the thyroid lobes, and closely associate with the epithelial cells, as they do in vivo.
Thyroid tissues can be obtained from wild type, knockout or fluorescent transgenic embryos. Moreover, explants culture can be manipulated by addition of inhibitors, blocking antibodies, growth factors, or even cells or conditioned medium. Ex vivo development can be analyzed in real-time, or at any time of the culture by immunostaining and RT-qPCR.
In conclusion, thyroid explant culture combined with downstream whole-mount or on sections imaging and gene expression profiling provides a powerful system for manipulating and studying morphogenetic and differentiation events of thyroid organogenesis.

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.

アン<em&gt;生体外</em甲状腺の開発を研究する&gt;文化システム

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding primary 3D epithelial structures in vitro. Both the architecture and physiological properties of these &#39;mini-guts&#39;, also called organoids, closely resemble their in vivo counterparts. This makes them an attractive model system for the small intestinal epithelium. Using retroviral transduction, functional genetics can now be performed by conditional gene overexpression or knockdown. This video demonstrates the procedure of organoid culture, the generation of retroviruses, and the retroviral transduction of organoids to assist phenotypic analysis of the small intestinal epithelium in vitro. This novel organotypic model system in combination with retroviral mediated gene expression provides a valuable tool for rapid analysis of gene function in vitro without the need of costly and time-consuming generation for transgenic animals.

This protocol explains primary Lgr5-positve organoid culture and the subsequent performance of retroviral transduction. This enables Cre-inducible overexpression or knockdown of the delivered transgene and allows functional studies to be carried out in the novel in vitro organotypic model system.

初代腸オルガノイド培養におけるレトロウイルス感染のビデオプロトコル

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Zinc-finger domains are intrinsically cell-permeable and capable of mediating protein delivery into a broad range of mammalian cell types. Here, a detailed step-by-step protocol for implementing zinc-finger technology for intracellular protein delivery is presented.

細胞透過性のCysを用いて哺乳動物細胞への直接タンパク質送達<sub&gt; 2</sub&gt; -His<sub&gt; 2</sub&gt;ジンクフィンガードメイン

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the invasion of non-indigenous species. However, an exact identification of field predator-prey interactions is difficult in many cases. These analyses are often based on a visual evaluation of gut content or the analysis of stable isotope ratios (&#948;15N and &#948;13C). Such methods require comprehensive knowledge about, respectively, morphologic diversity or isotopic signature from individual prey organisms, leading to obstacles in the exact identification of prey organisms. Visual gut content analyses especially underestimate soft bodied prey organisms, because maceration, ingestion and digestion of prey organisms make identification of specific species difficult. Hence, polymerase chain reaction (PCR) based strategies, for example the use of group-specific primer sets, provide a powerful tool for the investigation of food web interactions. Here, we describe detailed protocols to investigate the gut contents of macroinvertebrate consumers from the field using group-specific primer sets for nuclear ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA). DNA can be extracted either from whole specimens (in the case of small taxa) or out of gut contents of specimens collected in the field. Presence and functional efficiency of the DNA templates need to be confirmed directly from the tested individual using universal primer sets targeting the respective subunit of DNA. We also demonstrate that consumed prey can be determined further down to species level via PCR with unmodified group-specific primers combined with subsequent single strand conformation polymorphism (SSCP) analyses using polyacrylamide gels. Furthermore, we show that the use of different fluorescent dyes as labels enables parallel screening for DNA fragments of different prey groups from multiple gut content samples via automated fragment analysis.

Most common gut content analyses of macroinvertebrates are visual. Requiring intense knowledge about morphological diversity of prey organisms, they miss soft bodied prey and, due to strong comminution of prey, are nearly impossible for some organisms, including amphipods. We provide detailed, novel genetic approaches for macroinvertebrate prey identification in the diet of amphipods.

水生動物使用グループ固有の rDNA プライマーの遺伝的腸内容分析の研究プロトコル

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...