進化促進剤と呼ぶこのマイクロ流体癌オンチップモデルは、単一細胞レベルで明確に定義された環境条件内の癌ダイナミクスの長期的でリアルタイムの定量的研究のための制御可能なプラットフォームを提供する。この技術は、腫瘍のようなストレスの風景の下で癌の進化ダイナミクスを探査することを可能にします。形態、集団、運動性、および時間経過に関する移動を含む情報を細胞レベルで提供する。
十分に制御されたストレス勾配の下で混合腫瘍集団の行動を制御し、監視する能力を用いて、我々の技術は、前臨床薬物開発のためのより生理学的に関連するモデルを提示するかもしれない。提示された圧力シーリング包装方法は、周囲ガス組成の高度な調整と下流の実験能力を必要とする他のマイクロ流体システムでも実現できます。長期的な実験を成功させるための鍵は、物理的かつ生化学的に安定した環境を確保することです。
温度、湿度、ガス組成などの要因は常に監視する必要があります。まず、3D印刷機に同時にガス透過性の培養皿を保持するのに十分なプレートホルダーを製造します。カスタマイズされた3つのウェルサンプルプレートのコンポーネントをスクリュードライバーで外します。
少なくとも1時間紫外線露光を介してコンポーネントを消毒し、滅菌環境に放置します。細胞株播種を開始するには、10センチメートル培養皿の各PC3-EpiまたはPC3-EMT細胞培養物に5ミリリットルのトリプシンを加え、摂氏37度のインキュベーターで5分間トリプシンを実行します。培養皿から細胞を15ミリリットルの遠心分離チューブに移し、150倍gで遠心分離機を3分間移します。
上清を捨てます。15ミリリットル遠心管内の各細胞ペレットを再中断し、ヘモサイトメーターを使用して各PC3-MPまたはPC3-EMTの細胞をカウントします。合計2.5倍の10を各セルタイプの4つを分離します。
2つの単離された細胞タイプを混合し、培養培地の2ミリリットルを加える。3つのガス透過性培養皿のそれぞれに細胞培養の2ミリリットルを種分する。細胞が付着するために、一晩で摂氏37度でインキュベーターにガスを透過性のままにします。
少なくとも1時間の紫外線暴露を介してPDMSデバイスを消毒し、無菌環境に残す。現在、二酸化炭素と酸素の両方の制御ユニット、ガスポンプ、ガス混合室、加湿器またはバブラー、3つの別々のガスバルブセット、および圧力計で構成されるガス供給システムを設定します。あるいはノルモキシア状態を提供するガス供給システムを使用する。
混合チャンバーの相対湿度が85%以上に増加していることを確認蓋と底板のための別々の加熱サブユニットと37°Cでステージインキュベーション熱制御ユニットを設定します。翌日、インキュベーターからガス透過性の培養皿を取り出し、詳細なコンポーネントが整っていることを特定し、すべての井戸はガス透過性培養皿ホルダー、PDMSチップホルダー、ガラス窓ホルダー、および35ミリリットル幅のガラス窓のペアを所有しています。これらのコンポーネントを組み立て、ガス透過性培養皿をクランプするために、適合ねじを使用してください。
その後、事前に温めた培養培地を真空チャンバーに移し、20分間脱気する。酸素プラズマシステム内のPDMSチップを30秒間処理し、親水性を維持します。次に、10ミリリットルの脱ガス成長培地でゆっくりと2つの注射器をロードし、残りの2つの注射器は10ミリリットルの脱ガス所望の試薬を含む。
例えば、薬物を含むメディアやメディア。各個々のシリンジを23ゲージの分配針によって50センチメートルの管に1つの中空の鋼鉄ピンに接続する。中空のスチールピンをチューブの反対側に挿入します。
チューブにメディアを押し込んでチューブを盛り付け、キャップレイヤを通して各PDMSチップにスチールピンを挿入します。貯留層を満たし、PDMSパターン層を媒体で濡らします。リザーバ層は、オンチップバブルトラップとして機能し、気泡がマイクロ流体パターンに入るのを防ぎます。
その後、培養培地で1ミリリットルの注射器をロードします。23ゲージの分配針で5センチメートルのチューブに注射器を1つの中空のスチールピンに接続します。中空のスチールピンをチューブの反対側に挿入し、チューブを盛り付けます。
後で過剰なメディアを抽出するために、チップの中心穴に中空のスチールピンを挿入します。フォワードデッキにチップあたり2つの10ミリリットルのシリンジをロードし、他の2つのシリンジをシリンジシステムの引き出しデッキに置きます。マイクロ流体パターンにマイクロバブルを包み込まないようにするために、あらかじめ温め、脱ガスした培地の1ミリリットルを35ミリリットルの深気透過培養皿に分配する。
チップを気体透過培養膜の上に直接配置し、チップが15度の傾斜角で液体表面に近づきます。PDMSチップホルダーでPDMSチップをクランプし、PDMSデバイスを下に押します。PDMSデバイスの上にシーラーのシートをテープし、PDMSチップホルダーでクランプして、チップが乾燥するのを防ぎます。
アレイ周辺のメディアの流量を1時間あたり20マイクロリットルに設定します。逆顕微鏡の電動ステージ上のステージインキュベーターにプレート全体を配置します。ガスチューブを通してガス供給システムをガスチャネルに接続し、ゲージ圧力を0.2 PSIに維持します。
これは、装置のシールを確実にするために設置PDMSチップに対してガス透過性培養膜を加圧する。センターホールから1ミリリットルのシリンジを使用して、チップ内の過剰な媒体をゆっくりと抽出します。培地を抽出しながら顕微鏡でチップを観察し、チップが密封されたら抽出を停止します。
ステージ上のインキュベーターの温度センシングユニットを3つのウェルプレートに接続し、摂氏37度に設定します。本研究では、外部応力の存在なしに進化促進器で培養されたPC3は、整列しながら成長曲線を持っていた。チップ全体の位置の関数としての細胞増殖プロファイルの同一性を示唆する。
曲線の初期傾斜は、増殖速度を明らかにします。デバイス内の細胞の倍時間は約24時間です。PC3-EMTとPC3-Epi細胞を発現するmCherryを発現するGFPは、進化促進剤において共培養した。
40%の合流から始めて、コカルチャーは3日以内に40%コンフルエントに成長した。一方、全合流の成長曲線は、ロジスティック成長モデルの形で。PC3-EMTの人口は拡大を続け、PC3-Epiは漸近期で抑制された。
PC3-EpiおよびPC3-EMT細胞は、装置の中央に密着し、空の領域に向かって自由に移動させられた。両方の形型の速度の正規化されたヒストグラムは、PC3-EMTの速度がPC3-Epiより1.8倍有意に高かったことを示す。培養培地を事前に温め、ガスを脱熱する必要がある一方で、マイクロバブルを何としても作らないようにすることは非常に重要です。
PDMSチップは適切に濡れ、穏やかに取り扱う必要があります。当社の圧力シール方法のソフト再シールの性質により、多くの下流実験が前もって形成することができます。非臨床集団抽出、局所代謝産物分析、空間的に解決された免疫蛍光およびシーケンシングなど。
当社の技術は、複雑なスーパーマイクロ環境で主要なコンポーネントと相互作用を包括的に再現する方法を実証しています。定量的で信頼性が高く、再現性の高いデータを提供できるシンプルさ。
