ベンチトップ遠心分離はオープンで手動のプロセスであり、拡張が困難です。私たちのプロトコルは、間葉系幹細胞(MSC)の解離、洗浄、および収穫を1回の実行で閉じて自動化する方法を示しています。セットアップは簡単です。
プロセス全体は、クラスcGMP施設のバイオセーフティキャビネットの外で実行できます。クローズド自動セル処理により、リスクが発生しやすい手動処理ステップが削減され、cGMPコンプライアンスが可能になります。この方法は、多層培養系で増殖した他の細胞種にも適用できます。
カウンターフロー遠心分離システムにより、さまざまなアプリケーションに合わせて任意のプロトコルステップを変更できます。この手順を実演するのは、シンガポールのスターであるバイオプロセシングテクノロジーインスティテュートの幹細胞バイオプロセシンググループのスタッフサイエンティストであるアランラム博士です。シングルユース向流遠心分離キットの組み立てを開始するには、図に示すように、シングルユースキットをシングルユースPVCトランスファーバッグにチューブ溶接で接続します。
次に、バイオセーフティキャビネット内で、コンフルエント、ウォートンゼリー由来のヒト間葉系幹細胞またはウォートンゼリーHMSCを含む10層の多層フラスコをカスタムチューブアセンブリに取り付けます。付属のカスタムチューブアセンブリを備えた10層培養容器をベンチに移し、シングルユースキットのラインEに溶接します。また。無菌サンプルポートを高流量シングルユースキットのラインGに溶接します。
次に、収穫ラインHを50ミリリットルの注射器を取り付けた滅菌ルアーに接続します。機器の実行を設定するには、機器の背面にあるトグルスイッチを使用して機器のスイッチを入れ、付属のUSBCケーブルを使用してラップトップを機器のUSBCポートに接続します。デスクトップまたはスタートメニューからカウンターフロー遠心分離機のグラフィカルユーザーインターフェイスまたはGUIソフトウェアを実行し、サインインします。
次に、メインのウェルカム ページの [プロトコルの選択] ボタンをクリックしてプロトコルを読み込みます。次に、装置の青いロック解除ボタンを押してガラスドアを開き、組み立てられたシングルユースキットをカウンターフロー遠心分離システムにロードします。まず、10層の多層フラスコを斜めに配置した状態で、バブルセンサーストリップのチューブポートと最もよく一致する順序でバッグをハンガーフックに掛けることから始めます。
キットを2つのキット位置ボタンに合わせます。蠕動ポンプの周りにポンプチューブを引き伸ばし、白い電球型のコネクタを所定の位置に押し込みます。向流遠心室キャリアの銀色のレバーを持ち上げて遠心分離室を取り付け、レバーを直立位置に戻して固定します。
キットの各ポートからのチューブをバブルセンサーストリップに沿ってトラックに押し込みます。ドアラッチを押してドアを閉じます。GUIの[開始]ボタンを押します。
チェックリストが表示されます。最初の4つの項目は機器チェックで、最後の2つはユーザーチェックです。この時点で、バッグと接続がキットの画像と一致し、手動クランプが開いていることを確認してください。
確認を押して、プロトコル入力画面を表示します。データ入力または収穫量ダイアログボックスの値を45ミリリットルに設定し、[確認]を押します。機器の緑色のスタートボタンを押して、プロトコルの実行を開始します。
最初のプライミングが完了したら、使用済み培地が廃棄物バッグに完全にポンプで排出されていることを確認してください。ワークフロー表に示されている一時停止ステップで、多層フラスコを持ち上げて振とうし、バッファーをすべてのトレイに均等に分配します。完了したら、次のステップのために10層多層フラスコを元の描画位置に戻します。
ステップ20および23では、トリプシン処理された細胞が中間バッグに完全に移されることを確認する。ステップ25で中間バッグを手動でよく混ぜます。ステップ26では、2ミリリットルのルアーシリンジを使用して、サンプリングポートからサンプリングします。
ステップ29および30では、流動細胞床の安定した形成を確認する。ここに示す流動細胞床のようになるはずです。ランプから停止ステップへの実行が完了し、向流遠心分離システムのすべてのピンチ値が自動的に閉じます。
プロトコルの実行が完了したら、機器の青いロック解除ボタンを押して、ガラスのドアを開きます。ハンドキャリーチューブシーラーを使用して収穫ラインを無菌的に密封し、濃縮細胞収穫物で満たされた密封されたシリンジを細胞計数と凍結保存のために生物学的安全キャビネットに慎重に移します。レバーを使用してチャンバーを再度取り外します。
電球コネクタをフィッティングから引き出し、キットを慎重に持ち上げてバイオハザードバッグに廃棄します。エタノールワイプを使用して機器を清掃し、ドアを閉めます。最後に、機器の背面にあるスイッチをオフにする前に、まずGUIアプリケーションを閉じます。
ウォートンゼリーMSCは、血清含有培地と無血清、異種剤フリー培地の両方で増殖した場合によく増殖しました。しかし、無血清、ゼノフリー培地のものは、血清培地の15ミクロンと比較して、わずかに長い線維芽細胞様の紡錘形の形態を示し、平均細胞サイズは17ミクロンと大きくなりました。3つの継代にわたる両方の培地において、ウォートンゼリーHMSCは一貫して平方センチメートルあたり約23, 000細胞の最大細胞密度および34時間の集団倍増時間に達した。
実証された向流遠心分離を使用してウォートンのゼリーHMSCを10層培養容器で展開すると、10倍の体積減少が達成され、ミリリットルあたり530万細胞もの細胞濃度が生成されました。このプロトコルは、3回の独立した実行で、一貫して約98%の高い細胞回収率と約99%の高い細胞生存率を達成しました。両方の方法を使用して収穫されたウォートンゼリーHMSCは、CD73、CD90、およびCD105陽性、ならびにCD34およびCD45陰性の特徴的な表面マーカープロファイルを示しました。
向流遠心分離から採取された細胞は、手動遠心分離によって回収されたものと比較して、同様のコロニー形成単位線維芽細胞アッセイまたはCFU電位を示した。どちらの方法でも、細胞は脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞に分化する能力を保持していました。逆流遠心分離後の細胞のサイトカイン分泌プロファイルは、逆流遠心分離前に匹敵した。
ベッドのセットアップを参照して使い捨てキットを組み立て、この向流遠心システムプロトコルビルダーで置き換えてください。最終製品から残留不純物を洗浄するためのプロトコルは、ユーザーがロットリリース基準を満たすのをサポートするために臨床アプリケーションで使用できます。大規模な処理のための流体移送のプロセスを迅速化するために、多層フラスコから直接収穫するのではなく、外部ポンプを使用してトリプシン処理内容物を最初に移送バッグに移すことができる。
