1。サンプルの固定と樹脂の埋め込み<ol><li>新鮮な組織や細胞のサンプルを2％パラホルムアルデヒド中で少なくとも2時間固定し、pH7.4の0.1 Mリン酸緩衝液中2.5％グルタルアルデヒドされています。サンプルサイズが十分浸透または固定を可能にするために厚さ0.150ミリメートルを超えてはならない、と12時間以上の修正に配置したままにしないでください。 </li><li> 20ミリリットルのガラスシンチレーションバイアルにサンプルを配置し、それらに0.1Mカコジル酸緩衝液で3回、5分ごとに、すすいでください。 </li><li> 30分間、0.1Mカコジル酸緩衝液（0.1M、pH7.4）中1.5％（w / v）のフェロシアン化カリウムと1％（w / v）の四酸化オスミウムで染色。 </li><li> 30分間0.1Mカコジル酸緩衝液で1.0％（w / v）の四酸化オスミウムで染色。 </li><li> 3分間蒸留水で一度すすいでください。 </li><li> 30分間二重蒸留水の1％（w / v）の酢酸ウラニルで染色。 </li><li>段階的なアルコールのシリーズ、2分ごとに変化（1 × 50％、1 × 70％、1 × 90％、1 × 95％、2 × 100％）で脱水後、蒸留水で5分間のセクションをすすぎ、と。 </li><li> 70％、90％、95％、次いで100％エタノールで50％Durcupanから始まるエタノール混合Durcupan樹脂、それぞれの変更30分、濃度の増加に埋め込む、その後に続く。 </li><li>新鮮なDurcupanと交換し、4時間ゆっくり振とうする。 </li><li>場所のセクション、金型分離剤を塗布した、と65の場所ガラスの顕微鏡で、木製のカクテルの棒をスライドを使用して24時間℃のオーブン。 </li></ol> 2。 FIB / SEM用サンプルの準備<ol start="11"><li>二枚のガラスの顕微鏡スライドの間から、サンプルを含む、樹脂層を分離し、エージェントを分離し、任意の型を削除するには徹底的に洗ってください。 </li><li>低消費電力の目標に透過光顕微鏡を使用して、または樹脂のスライス内に​​関心領域を識別するために、透過照明で顕微鏡を解剖。 </li><li>カミソリの刃を使用して、関心領域の周りに小さな（3mm × 3mmの）正方形を切り取り、アクリル接着剤で空白樹脂ブロック（図1）の上部にこれを貼り付けます。硬化への接着のために5分待ってから、次のステップに進みます。 </li><li> ulramicrotomeのホルダーにブロックを固定し、付属の実体顕微鏡を用いて、物質の残物の唯一の小さなピラミッドまで、カミソリの刃で対象領域の周囲にトリム。 </li><li>さらに、関心領域を正確に基準にしてブロックの表面（図1）の寸法を配置できるように、ウルトラミクロトームに固定されたガラスナイフを使用して、ブロックをトリム。ブロックの一方の端をカット、垂直のステップはサンプル（図1および2）で切断されるように、関心領域に近い。このステップでは、画像面（図2）を形成する。 </li><li>透過光顕微鏡を用いて、ウルトラミクロトームと写真ブロック内の関心領域からブロックを削除します。 </li><li>残りの樹脂のスタブからトリミングされたブロックをカット。これは、宝石商の鋸を使用して行われ、唯一の小さなブロックがFIB / SEMの内部に配置されることが保証されている。このブロックの全体の高さは5mmを超えてはなりません。 </li><li>イメージを作成する側は、最も外側のエッジ（図1）にあることを確実にカーボンペーストをアルミスタブに接着剤がブロック。 </li><li>接着剤が乾燥した後、金の薄層（&gt; 20 nmの、クレッシントンの真空蒸着装置）でコーティングブロックを。 </li></ol> 3。 FIB / SEMのイメージング<ol start="20"><li>関心とブロックの側面の選択された領域が撮像されるように、低倍率で、そして二次電子を用いてイメージング（5kVの、0.5 NAMP）、オリエントブロックは演算子（図2のC、D）を直面している。 </li><li>オリエントは、顔を撮像するようにブロックが加工ビームと平行に位置しています。これは、電子ビームがこの面に54 °（図2 B）に配向していることを意味します。 </li><li> 13の現在のイオンビームを使用して - 30 kVで27 NAMPSは、撮像しようとする領域の前面から樹脂の狭いバンドを削除します。 </li><li>関心領域を覆う粉砕顔を表示するには、後方散乱イメージングモードに切り替えます。 </li><li> （図2）粉砕し、撮像されるブロックの正確な領域を見つける光顕微鏡の基準画像（ステップ16で撮影）と粉砕顔の画像を使用する。 </li><li>関心領域（図2）の上に、ブロックの表面に、顕微鏡のガス噴射システムを使用して、炭素（または金属）の保護層（約1ミクロンの厚さ）を、入金。 </li><li> 700ピコアンペア、細かく粉砕最後の画像が撮影される内のブロックの領域の現在の使用。 </li><li>はミリングアーティファクトが顔に見られないようになるまで完全に工場この画像の顔に加工ビームを残す。顔の完全な工場は、視野全体にわたって続く各画像の変化を観察することによってチェックされます。不十分な加工もverticaに現れる白い縞や&quot;カーテン&quot;として見ることができるLLYイメージに。 </li><li>放散させるためにどのような熱変化のための少なくとも2時間顕微鏡を残す。これはブロック面の位置がずれて画像になって、撮像中にドリフトするというリスクを軽減します。 </li><li>顔シリアルイメージングのための顕微鏡のパラメータを選択します。電子ビームは、ブロック面の材料の非常に浅い深さだけのイメージに十分に低い電圧を持っていることを確認してください。これも削除する顔の厚さよりもはるかに浅くする必要があります。 4の間のピクセルサイズを持っている2.0 kVの - - 20 nmのイメージングのための典型的なパラメータは、1.2との間の電圧です。ピクセルは、工場の顔をにして、1つのイメージを取得する総時間は（図3）2分未満に維持されるように、10μsecs周りに保持する時間のニーズに住む。 </li></ol> 4。成功の秘訣 ステップ1）のサンプルが150ミクロンより厚くはないことを確認します。これは、材料にさまざまな汚れや樹脂の十分な浸透が可能になります。これは、すぐに固定した後、ビブラトームで試料をセクショニングすることによって達成することができます。この厚さは、脳組織に適しています。他の組織は、適切な固定と染色を確保するためにテストする必要があります。 ステップ3）試料は、自由にソリューション全体に分布し、そしてこの二次固定剤が導入されている間バイアルの一部で一緒に凝集しないようにする必要があります。これは、サンプルの最大の浸透を確保し、この固定の過程で歪んになるサンプルが削減されます。これは、穏やかに解決策が追加された直後にバイアル内のサンプルを旋回することによって達成される。 ステップ15）関心領域は、（&lt;30ミクロン）のすぐ下のブロックの表面に配置されていることを確認してください。これにより、画像取得の段階でイオンビームによる加工量が削減されます。 ステップ22）イオンビームの走査時間は、全体像の顔が完全に粉砕されていることを確認するadequteにする必要があります。不十分な加工は、画像面に垂直に現れる白い縞、または&quot;カーテン&quot;として表示されます。 ステップ26）最後のミルドフェースは、画像化されている顔よりも大きい必要があります。粉砕された樹脂がすぐ近くにあるブロックの表面にブロックとredepositsから排出されるためです。この再堆積は、撮影視野に侵害することができる、とイメージされるよりもはるかに大きな面積を粉砕することによって回避される。 20ミクロン幅の画像ウィンドウでは、粉砕されたブロック面は、30ミクロン幅より大きいです。 ステップ29）これは、電子ビームのパラメータは画像がブロックの表面の唯一の最初の数ナノメートルから出てくる電子によって生成されるようになっていることが重要です。これは、以下の2 kVの電圧を最小限にしていない電子が離れすぎて浸透しないようにすることで、acheved。これはまた最も高いエネルギーを持つ唯一の電子は、最終イメージに貢献するように検出器のグリッド電圧を使用することによって助けられます。通常は、1.3 kVのグリッドの張力は、1.5 kVのイメージング電圧に使用されます。 5。代表的な結果： <img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig1.jpg" alt="図1"/> 図1樹脂ブロックの準備が。）樹脂はsteromicroscopeで表示成体ラットの脳の冠状断面（80ミクロン厚い）を埋め込 ​​まれた。画像は明らかにメス刃を用いて節（b）からカットすることができます別の脳領域を示しています。ここでは、皮質から1mmの正方形は削除され、（C）ブランク樹脂ブロックにスタックしています。D）樹脂ブロックは、ウルトラミクロトームに取り付けられたガラスナイフでトリミングされ、そして一度ブロックだけを残すために削減されています関心領域（E）、ステップが埋め込 ​​まれた材料の表面に対して垂直にカットされるが。f）この全体のトリミング領域は、その後に金属のコーティングとイメージングを処理する準備が樹脂の残りの部分から切断し、アルミニウムのスタブ上にマウントされています走査型電子顕微鏡。 <img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig2.jpg" alt="図2"/> 図2。）。FIB / SEMイメージングのためのブロック面を準備し、b）のブロックと画像の顔を（黒双方向の矢印で示される）を作成するために粉砕され、エッジのイラストを表示。イオンビーム（ホワイト）の位置は、撮像面に平行に表示されており、電子ビーム（灰色）は、イオンビームに54 °で顔を打つ示されている。c）は電子ビームで撮影されたブロックのビューを示しています。と二次電子で撮像。ブロックのこの側面に沿ってより暗い領域（点線の白いボックスで示されている）ほぼ粉砕された顔の一部を示しています（ダブルヘッドで表示ED黒い矢印）が基本となるサンプルを明らかにする。d）この領域が埋組織を見ることができる唯一の反射電子を用いて画像化されている場合。ここでは、埋め込まれた組織切片の全幅は、二重頭の白い矢印で示されている。 cのスケールバー）は100ミクロンです。 <img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig3.jpg" alt="図3"/> 図3。イメージング等方性ボクセルによる脳組織の容積。）ラットの脳の領域内の超微細構造を示すブロック面のコントラスト後方散乱画像を反転。すべての膜は、目に見えるだけでなく、大型の高分子構造です。B）1600の画像の合計は等方性ボクセルによる画像のスタックに、その結果が5nm間隔で収集された。c）このスタックは、同じ解像度を持つ任意の平面上に結像することができます。この画像は、xy平面、yz平面上に結像される単一のシナプス結合を示しています。

<ol>
	<li>Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+section+scanning+electron+microscopy+of+adult+brain+tissue+using+focused+ion+beam+milling.">Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling.</a> J Neurosci. 28, 2959-2964 (2008).</li><li>Hekking, L. H., Lebbink, M. N., De Winter, D. A., Schneijdenberg, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ion+beam-scanning+electron+microscope:+exploring+large+volumes+of+atherosclerotic+tissue.">Focused ion beam-scanning electron microscope: exploring large volumes of atherosclerotic tissue.</a> J Microsc. 235, 336-347 (2009).</li><li>Armer, H. E., Mariggi, G., Png, K. M., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+transient+blood+vessel+fusion+events+in+zebrafish+by+correlative+volume+electron+microscopy.">Imaging transient blood vessel fusion events in zebrafish by correlative volume electron microscopy.</a> PLoS One. 4, e7716-e7716 (2009).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

関心領域が大きすぎるではない場合FIB / SEMの手法は、最適に動作します。画像化されたボリュームの上限は、イオンビームとそれが多くの時間以上繰り返し圧延一貫してできる領域に依存する。今のところ、これが約60 × 60ミクロンの領域で行われている、しかし、画像はこの領域全体では、適切な画像解像度と大きな画像を収集する時間的要因が主な要因は不可能である。ピクセルと例4 KX 4 Kのイメージとして10マイクロ秒までの滞留時間を取得するには、2分40秒かかります、と60ミクロンの視野のために、これはわずか15ナノメートルのピクセルサイズを与えるだろう。イメージング、細胞と組織の超微細構造の場合は、小さい画素サイズがより適している;通常4〜10nmの/ピクセル間。 60 × 60ミクロンの領域のために画像は顕微鏡がこの能力を持っている場合でも、10時間で取得される。これらの理由から、顕微鏡で10 × 10 × 10ミクロン、または全細胞の有意な地域のために画像のボリュームに最適なツールです。これは簡単に、この手順でうまく対比されているサンプルに48時間の期間内に行うことができます。 これまでのプロトコルは、脳組織だけでなく、カバーガラスに付着している哺乳動物培養細胞の様々なタイプで主に使用されています。しかし、固定と染色の手順は同様に、コントラストの画像スタックを生成するために植物材料を含む生物学的材料の他の多くの種類、使用することができます。 したがって、この手法の主な利点は、等方性ボクセルによる画像のボリュームにその容量です。このタイプの画像のスタックは、スタック内の任意の平面で撮影した画像を使って3Dボリュームの分析が可能になります。これの利点は、あらゆる方向からの画像シリーズで、より大きなイメージの詳細（図3）を提供する画像の特徴にオブザーバをできるようにすることです。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th></tr><tr><td>シアノアクリレート接着剤</td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡：ライカMZ8 </td><td>ライカマイクロシステムズ、ドイツ</td><td></td></tr><tr><td> Durcupan樹脂</td><td>シグマアルドリッチビックケミー社、スイス</td><td></td></tr><tr><td> FIB / SEM顕微鏡（Zeiss、主催による40） </td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガラス組織学スライド</td><td>メンツェル-グレイザー、ドイツ</td><td> AA00008032E </td></tr><tr><td>ガラスナイフメーカー：ライカEM KMR2 </td><td>ライカマイクロシステムズ、ドイツ</td><td></td></tr><tr><td>ガラスシンチレーションバイアル（20ml）を</td><td> EMS、米国</td><td> 72634 </td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド</td><td> EMS、米国</td><td> 16222 </td></tr><tr><td>宝石商ののこぎり</td><td> EMS、米国</td><td> 72010 </td></tr><tr><td>金型分離剤</td><td> Glorex、スイス</td><td> 62407445 </td></tr><tr><td>四酸化オスミウム</td><td> EMS、米国</td><td> 19110 </td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td> EMS、米国</td><td> RT 19208 </td></tr><tr><td>リン酸緩衝液、リン酸塩</td><td>シグマアルドリッチビックケミー社、スイス</td><td> 71642と71496 </td></tr><tr><td>カコジル酸ナトリウム</td><td>シグマアルドリッチビックケミー社、スイス</td><td> 20840 </td></tr><tr><td>金の対象とコーターをスパッタ</td><td>クレッシントン、米国</td><td></td></tr><tr><td>トリス塩基（TBS） </td><td>シグマアルドリッチビックケミー社、スイス</td><td> T1378 </td></tr><tr><td>ウルトラ：ライカUCT </td><td>ライカマイクロシステムズ、ドイツ</td><td></td></tr><tr><td>酢酸ウラニル</td><td> EMS、米国</td><td> RT 22451 </td></tr></tbody></table>

focussed ion beam milling and scanning electron microscopy of brain tissue

このプロトコルは、どのように生物学的サンプルは、脳組織のように、集束イオンビーム/走査型電子顕微鏡（FIB / SEM）を用いて3次元でイメージングすることができますについて説明します。サンプルは、四酸化オスミウムと酢酸ウラニルを用いてアルデヒド類、重金属で染色して固定されています。そして、彼らはアルコールで脱水し、硬化される樹脂、で浸潤。光学顕微鏡とガラスナイフを持つウルトラミクロトームを用いて、表面に近い領域の関心を含む小さなブロックが行われます。ブロックが次にFIB / SEM、およびブロックの片側に沿ってほぼ工場の垂直面をするために使用されるイオンビーム内に配置され、この地域に近い。画像基本的な構造をして後方散乱電子を用いて、小さな顔は、細かいイオンビームで粉砕し、表面には、イメージングと粉砕される顔の正確な領域を決定するために、より密接に吟味されている。顕微鏡のパラメータは、シリアル画像がブロックのボリュームを介して収集されるように顔が繰り返し粉砕し、結像されるように設定されています。画像のスタックは通常、各方向に小さな4 nm程度の寸法と等方性ボクセルが含まれます。任意の撮像面でこの画質は、ユーザーが画像スタック内の任意の視野角でセルの超微細構造を分析することができます。

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Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

このプロトコルは、樹脂の埋め込み脳組織を走査型電子顕微鏡、集束イオンビームの3次元で準備し、画像化する方法について説明します。

集束イオンビームは、粉砕し、脳組織の走査型電子顕微鏡

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

focussed-ion-beam-milling-scanning-electron-microscopy-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

27.8K ビュー.  École Polytechnique Fédérale de Lausanne. このプロトコルは、樹脂の埋め込み脳組織を走査型電子顕微鏡、集束イオンビームの3次元で準備し、画像化する方法について説明します。

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Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments (dendrite, dendritic spine, axon, axon terminal, perikaryon), as well as their intracellular organelles and cytoskeleton, in the central nervous system at high spatial resolution. Combined with TEM, pre-embedding immunocytochemistry allows the discrimination of cellular elements with few distinctive features and identification criteria (e.g., microglial perikarya and processes, when using an antibody against the microglia-specific marker Iba1 (ionized calcium binding adaptor molecule 1; as presented here)), identifying the neurotransmitter contents of cellular elements (e.g., serotonergic) and their ultrastructural localization of soluble or membrane-bound proteins (e.g., 5 HT1A and EphA4 receptors). Here, we describe a protocol for transcardiac perfusion of mice with acrolein fixative, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase-diaminobenzidine (DAB) staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with TEM. When rigorously performed, this technique provides an excellent compromise between optimal ultrastructural preservation and immunocytochemical detection.

We describe a protocol for transcardiac perfusion of mice, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with transmission electron microscopy.

免疫電子顕微鏡のためのマウスの脳組織の準備

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

神経科学

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

小脳顆粒ニューロンの遺伝子操作<em&gt;体外</em&gt;と<em&gt;インビボ</em&gt;ニューロンの形態と移行を研究するために、

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

モデルとしての嗅覚系は、軸索の成長パターンと形態を研究する<em&gt;インビボ</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular concentration of all major ions. As these ion shifts bear significant functional consequences, their quantitative determination is often required to understand the function and dysfunction of neural networks under physiological and pathophysiological conditions. In the present study, we demonstrate the fabrication and calibration of double-barreled ion-selective microelectrodes, which have proven to be excellent tools for such measurements in brain tissue. Moreover, so-called &#8220;concentric&#8221; ion-selective microelectrodes are also described, which, based on their different design, offer a far better temporal resolution of fast ion changes. We then show how these electrodes can be employed in acute brain slice preparations of the mouse hippocampus. Using double-barreled, potassium-selective microelectrodes, changes in the extracellular potassium concentration ([K+]o) in response to exogenous application of glutamate receptor agonists or during epileptiform activity are demonstrated. Furthermore, we illustrate the response characteristics of sodium-sensitive, double-barreled and concentric electrodes and compare their detection of changes in the extracellular sodium concentration ([Na+]o) evoked by bath or pressure application of drugs. These measurements show that while response amplitudes are similar, the concentric sodium microelectrodes display a superior signal-to-noise ratio and response time as compared to the double-barreled design. Generally, the demonstrated procedures will be easily transferable to measurement of other ions species, including pH or calcium, and will also be applicable to other preparations.

We demonstrate the fabrication, calibration and properties of two types of ion-selective microelectrodes (double-barreled and concentric) for measurement of ion concentrations in brain tissue. These are then used in the mouse hippocampal slice preparation to show that excitatory activity changes both extracellular potassium and sodium concentrations.

脳組織における測定細胞外イオンの信号のための、二連と同心微小電極

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular ...

Characterizing Multiscale Mechanical Properties of Brain Tissue Using Atomic Force Microscopy, Impact Indentation, and Rheometry

To design and engineer materials inspired by the properties of the brain, whether for mechanical simulants or for tissue regeneration studies, the brain tissue itself must be well characterized at various length and time scales. Like many biological tissues, brain tissue exhibits a complex, hierarchical structure. However, in contrast to most other tissues, brain is of very low mechanical stiffness, with Young&#39;s elastic moduli E on the order of 100s of Pa. This low stiffness can present challenges to experimental characterization of key mechanical properties. Here, we demonstrate several mechanical characterization techniques that have been adapted to measure the elastic and viscoelastic properties of hydrated, compliant biological materials such as brain tissue, at different length scales and loading rates. At the microscale, we conduct creep-compliance and force relaxation experiments using atomic force microscope-enabled indentation. At the mesoscale, we perform impact indentation experiments using a pendulum-based instrumented indenter. At the macroscale, we conduct parallel plate rheometry to quantify the frequency dependent shear elastic moduli. We also discuss the challenges and limitations associated with each method. Together these techniques enable an in-depth mechanical characterization of brain tissue that can be used to better understand the structure of brain and to engineer bio-inspired materials.

We present a set of techniques to characterize the viscoelastic mechanical properties of brain at the micro-, meso-, and macro-scales.

原子間力顕微鏡、インパクトインデント、およびレオを使用した脳組織のマルチスケール力学的性質を特徴づけます

To design and engineer materials inspired by the properties of the brain, whether for mechanical simulants or for tissue regeneration studies, the brain ...

Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, tri-carboxylic acid (TCA) cycle and oxidative phosphorylation (OXPHOS) pathways to produce cellular energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Impairment of mitochondrial ATP production causes mitochondrial disorders, which present clinically with prominent neurological and myopathic symptoms. Mitochondrial defects are also present in neurodevelopmental disorders (e.g. autism spectrum disorder) and neurodegenerative disorders (e.g. amyotrophic lateral sclerosis, Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s diseases). Thus, there is an increased interest in the field for performing 3D analysis of mitochondrial morphology, structure and distribution under both healthy and disease states. The brain mitochondrial morphology is extremely diverse, with some mitochondria especially those in the synaptic region being in the range of &#60;200 nm diameter, which is below the resolution limit of traditional light microscopy. Expressing a mitochondrially-targeted green fluorescent protein (GFP) in the brain significantly enhances the organellar detection by confocal microscopy. However, it does not overcome the constraints on the sensitivity of detection of relatively small sized mitochondria without oversaturating the images of large sized mitochondria. While serial transmission electron microscopy has been successfully used to characterize mitochondria at the neuronal synapse, this technique is extremely time-consuming especially when comparing multiple samples. The serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) technique involves an automated process of sectioning, imaging blocks of tissue and data acquisition. Here, we provide a protocol to perform SBFSEM of a defined region from rodent brain to rapidly reconstruct and visualize mitochondrial morphology. This technique could also be used to provide accurate information on mitochondrial number, volume, size and distribution in a defined brain region. Since the obtained image resolution is high (typically under 10 nm) any gross mitochondrial morphological defects may also be detected.

Mitochondrial visualization and analysis from mammalian brain tissue is a challenging task. Here, we describe how three dimensional (3D) reconstruction analysis from the serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) can be used to gain insights on the morphological and volumetric analysis of this critical energy generating organelle.

シリアルブロック・フェイス走査型電子顕微鏡を用いて脳ミトコンドリアの解析

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

プレ埋め込み免疫組織化学および電子顕微鏡のための非ヒト霊長類脳組織の調製

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator of cell excitability. Altered concentrations of extracellular K+ affect the resting membrane potential and cellular excitability by shifting the equilibria between closed, open and inactivated states for voltage-dependent ion channels that underlie action potential initiation and conduction. Hence, it is valuable to directly measure extracellular K+ dynamics in health and diseased states. Here, we describe how to make, calibrate and use monopolar K+-selective microelectrodes. We deployed them in adult hippocampal brain slices to measure electrically evoked K+ concentration dynamics. The judicious use of such electrodes is an important part of the tool-kit needed to evaluate cellular and biophysical mechanisms that control extracellular K+ concentrations in the nervous system.

Potassium ions contribute&#160;to the resting membrane potential of cells and extracellular K+ concentration is a crucial regulator of cellular excitability. We describe how to make, calibrate and use monopolar K+-selective microelectrodes. Using such electrodes enables the measurement of electrically evoked K+ concentration dynamics in adult hippocampal slices.

作成、テスト、および成人の脳の切片でカリウム イオン選択的な電極を使用して

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator ...

Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as well as the manifestation of severe brain disorders, including Alzheimer&#8217;s disease and epilepsy. The hippocampus receives a high degree of intra- and inter-connectivity, securing a proper communication with internal and external brain structures. This connectivity is accomplished via different informational flows in the form of fiber pathways. Brain slices are a frequently used methodology when exploring neurophysiological functions of the hippocampus. Hippocampal brain slices can be used for several different applications, including electrophysiological recordings, light microscopic measurements as well as several molecular biological and histochemical techniques. Therefore, brain slices represent an ideal model system to assess protein functions, to investigate pathophysiological processes involved in neurological disorders as well as for drug discovery purposes.
There exist several different ways of slice preparations. Brain slice preparations with a vibratome allow a better preservation of the tissue structure and guarantee a sufficient oxygen supply during slicing, which present advantages over the traditional use of a tissue chopper. Moreover, different cutting planes can be applied for vibratome brain slice preparations. Here, a detailed protocol for a successful preparation of vibratome-cut horizontal hippocampal slices of mouse brains is provided. In contrast to other slice preparations, horizontal slicing allows to keep the fibers of the hippocampal input path (perforant path) in a fully intact state within a slice, which facilitates the investigation of entorhinal-hippocampal interactions. Here, we provide a thorough protocol for the dissection, extraction, and acute horizontal slicing of the murine brain, and discuss challenges and potential pitfalls of this technique. Finally, we will show some examples for the use of brain slices in further applications.

This article aims to describe a systematic protocol to obtain horizontal hippocampal brain slices in mice. The objective of this methodology is to preserve the integrity of hippocampal fiber pathways, such as the perforant path and the mossy fiber tract to assess dentate gyrus related neurological processes.

マウス脳の水平海馬スライス

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) for the Study of Dendritic Spines

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In addition, some features of dendritic spines, such as volume of the spine and post-synaptic density (PSD) (representing post-synaptic part of the synapse), presence of presynaptic terminal, and smooth endoplasmic reticulum or atypical form of PSD (e.g., multi-innervated spines), can be observed only with 3D EM. By employing serial block-face scanning electron microscopy (SBEM) it is possible to obtain 3D EM data easier and in a more reproducible manner than when performing traditional serial sectioning. Here we show how to prepare mouse hippocampal samples for SBEM analysis and how this protocol can be combined with immunofluorescence study of dendritic spines. Mild fixation perfusion allows us to perform immunofluorescence studies with light microscopy on one half of the brain, while the other half was prepared for SBEM. This approach reduces the number of animals to be used for the study.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBEM for the Study of Dendritic Spines

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) is applied to image and analyze dendritic spines in the murine hippocampus.

樹状脊椎研究のためのシリアルブロック顔走査電子顕微鏡(SBEM)

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In ...