This work was supported by DFG Schwerpunktprogramm 1392 (project MA 4113/2-2), cluster of Excellence and DFG Research Center Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain (project B1-9), and the German Ministry of Research and Education (BMBF; project 1364480).

注：動物実験における倫理のためのゲッティンゲン大学委員会によって承認された動物の取り扱いおよび実験を行った。 楽器やピペットの作製の作製<ol><li>エレクトロポレーションのセットアップは、大きな作動距離を持つ実体顕微鏡で構成され、使用される色素のための蛍光照明とフィルターのセットが装備されていることを確認してください。 </li><li>エレクトロポレーションのために専用の単一細胞エレクトロまたはオシロスコープに取り付ける一般的な方形パルス発生器のいずれかを使用します。ピペットホルダーと風呂電極にエレクトロ出力を接続します。マイクロピペットホルダとバス電極と負端子にパルス発生器の正端子を接続する。ピペットホルダーとバス電極の両方が塩化銀の薄層で被覆された銀のワイヤが含まれていることを確認してください。 </li><li>正確な位置決めを可能にするマイクロマニピュレータにピペットホルダーをマウントします。 </li&gt; <li>内部のフィラメントとホウケイ酸ガラスキャピラリーからエレクトロポレーション、マイクロピペットを製作。 </li><li>水平マイクロピペットプラーを使用して、Bestman らによって記載されるように、パッチクランプ実験用ピペットの製造のための修正されたプロトコルを適用する。13。 </li><li>長いシャンク単一細胞エレクトロポレーション用15-20メガオームの高いピペット抵抗をもたらす小さな先端開口を生成するためのパラメータを適応させる。ピペット抵抗は、セル群の標識のために、 例えば 、3-4メガオーム低いはず。 </li><li>直接的に専用の単一細胞エレクトロピペット抵抗測定、規定された電圧パルスの印加後にオシロスコープで電流の流れを測定した後、オームの法則でそれを計算する。 </li></ol>エレクトロポレーションソリューションの調製<ol><li>カエルリンガー（98のNaCl、2mMのKClの中で、フルオロフォア結合デキストランを溶解させ、1mMのCaCl 2、2mMの上記MgCl 2は 、5 mMグルコース、5 mMのピルビン酸ナトリウム、pHを7.8に調整し、10mMのHEPESは、オスモル濃度は3 mMの濃度で）230ミリオスモル/ Lであった。低い色素濃度が使用される場合、細胞はそのように明るく標識されなくてもよい。大容量の原液を調製し、少量のアリコートに分割する。ストレージ（ヶ月間安定）のためにそれらを凍結する。 注：デキストランさまざまなサイズで提供され、発光/励起スペクトルの様々な（ 例えば 、アレクサ488デキストラン10KD、アレクサ546デキストラン10KD、アレクサ568デキストラン10KD、アレクサ594デキストラン10KD、TMR-デキストラン3kD。）。 </li><li>デキストラン溶液（1-5μl）を少量の細長いピペットチップでマイクロピペットを埋め戻す。注意深くピペットチップから残留気泡を除去するためにマイクロピペットを指ではじく。 </li><li>ピペットホルダーにマイクロピペットをマウントします。ピペット内部の銀線を染料溶液に接触していることを確認してください。 </li></ol>幼虫Xの3選定ツメガエル&lt;/ em&gt;の<ol><li> Xのアルビノ幼虫を使用してください実験のためツメガエル 。野生型動物は、共焦点/多光子イメージング中に自己蛍光発光を示すので、記載された実験には適していない顔料で満たされたメラニン保有細胞を有する。 </li><li> Nieuwkoopとフェーバー14の後premetamorphoticオタマジャクシを上演。実験用のステージ45-53のオタマジャクシを選択します。 </li></ol>フォア結合デキストラン4.エレクトロ<ol><li>ペトリ皿、組織の小片を置き、0.02％トリカイン（エチル3-アミノベンゾエートメタン、pHを7に調整）を含有する少量の水でそれをカバー。 </li><li> 0.02％トリカインを含む水でオタマジャクシを麻酔。いくつかの分後に動物が動いやめる。オタマジャクシに触れることによって、適切な麻酔を確認してください。彼らは、非応答でなければなりません。 </li><li>慎重に組織に覆わペトリ皿に麻酔からオタマジャクシを移す。 </li><li>必ず風呂あるelectrを作るODEは、エレクトロポレーション回路を閉じる。電極がウェットティッシュに接触していることを確認してください。オタマジャクシへの直接接触が必要ではない。 </li><li>マイクロマニピュレーターを用いて嗅覚器官に近い位置マイクロピペットチップ。 </li><li>ピペットチップで嗅覚器官をカバーする皮膚を貫通し、慎重に主嗅上皮や鋤鼻上皮の中心に位置する感覚ニューロン層に先端を進める。 </li><li>感覚ニューロンに色素を転写する正四角形の電圧パルスをトリガする。単一の電圧パルスを印加する（ 例えば 、25 V、パルス長25ミリ秒）または複数のパルス列（ 例えば 、50 V、パルス長300秒、200 Hzで400ミリ列持続時間）。 注：目的のラベリングの延長のための最適な電圧パルスのパラメータを決定します。標識細胞の数を低下させるために、電圧パルスの振幅、持続時間、および繰り返し回数を減らす。 pが高電圧パルスの振幅、持続時間及び数を適用するより広範な標識のためulses。 </li><li>実体顕微鏡の蛍光灯照明を使用してトリガパルスによる成功した染料押出およびエレクトロポレーションを視覚化する。染料は、成功したエレクトロポレーション後、細胞体と樹状突起に素早く広がります。 </li><li>繰り返しますオタマジャクシの第二嗅覚器官のために4.5から4.9を繰り返します。 </li><li>回復のために新鮮な水で満たされたビーカーにオタマジャクシを移す。約後に5分オタマジャクシが麻酔から覚めると、通常の水泳運動を開始します。 </li><li> 24時間後にエレクトロ色素が感覚ニューロンに広がり、最終的には軸索輸送を経由して嗅球に到達した。 </li></ol>細胞および軸索プロセスのin vivo可視化5.取付の動物<ol><li> 0.02％トリカインを含む水でオタマジャクシを麻酔。 </li><li>注意深く例えば撮像チャンバ内にオタマジャクシを移す、小さなシリコンゴムは、オタマジャクシサイズの凹部をペトリ皿を覆った。&lt;/ LI&gt; <li>パラフィルムのストライプに小さな長方形に切る。切り抜き窓を介して露出し前方終脳を残して、パラフィルムでオタマジャクシをカバーしています。オタマジャクシを傷つけることなく、皿の上に針でパラフィルムを固定します。 </li><li>オタマジャクシは0.02％トリカインを含む十分な水の中に沈めていることを確認します。 </li><li>直立多光子顕微鏡や共焦点顕微鏡のステージ上イメージングチャンバーをマウントします。 </li><li>嗅球の像の3次元積層を獲得。イメージング処理が可能な限り短く、10〜15分を超えていないことを確認してください。 </li><li>別のタンクに通常の水にオタマジャクシを返すと光への曝露を防止する。 5分後、オタマジャクシが麻酔から目覚める。 </li><li>繰り返します、 例えば 、指定された時間間隔の後に5.1から5.7を繰り返します。毎日。 </li></ol>細胞および軸索プロセスの ex vivo可視化のための6のマウント動物<ol><li>代わり部5にプロトコルの標識された感覚ニューロンを可視化するために摘出した脳の準備を使用しています。 </li><li>麻酔や脊髄への移行時に、脳の離断によってオタマジャクシを殺す。嗅覚器官、嗅神経と前方終脳を含む組織のブロックを切り出す。 </li><li>カエルリンガー溶液に組織ブロックを転送し、脳の腹側を露出させ細かいハサミで結合組織を取り除く。 </li><li>イメージング室に組織ブロックを転送し、ナイロン糸で弦楽器プラチナ枠で固定します。 </li><li>共焦点/多光子顕微鏡のステージ上イメージングチャンバーをマウントします。 </li><li>嗅球の像の3次元積層を獲得。 </li></ol> 7.画像処理およびデータ評価<ol><li>クーペ、P. らによって記載されるように最適化し、画質と神経構造の視覚化を改善するために、フィルタリングの非局所的な手段を適用する。15。 NOTE：ライブ試料のより深い組織層におけるイメージング実験からのデータは、多くの場合、ノイズが多い。 </li><li>概要については、画像スタックの最大強度投影を作成します。 </li><li>タイムラプスイメージングのための実験は、感覚ニューロンの単一の明確に識別軸索のためのデータセットをスクリーニングする。 </li><li>パンらによって記載されるように神経突起のソフトウェア支援のトレースを介して細胞の形態を再構築。16。 </li></ol>

<ol>
	<li>Huard, J. M., Youngentob, S. L., Goldstein, B. J., Luskin, M. B., Schwob, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+olfactory+epithelium+contains+multipotent+progenitors+that+give+rise+to+neurons+and+non-neural+cells.">Adult olfactory epithelium contains multipotent progenitors that give rise to neurons and non-neural cells.</a> J. Comp. Neurol. 400 (4), 486-4810 (1998).</li><li>Schwob, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+regeneration+and+the+peripheral+olfactory+system.">Neural regeneration and the peripheral olfactory system.</a> Anat. Rec. 269 (1), 33-49 (2002).</li><li>Leung, C. T., Coulombe, P. A., Reed, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+olfactory+neural+stem+cells+to+tissue+maintenance+and+regeneration.">Contribution of olfactory neural stem cells to tissue maintenance and regeneration.</a> Nat. Neurosci. 10 (6), 72-726 (2007).</li><li>Lodovichi, C., Belluscio, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant+receptors+in+the+formation+of+the+olfactory+bulb+circuitry.">Odorant receptors in the formation of the olfactory bulb circuitry.</a> Physiology (Bethesda. 27 (4), 212-2110 (2012).</li><li>Mori, K., Sakano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+is+the+olfactory+map+formed+and+interpreted+in+the+mammalian+brain).">How is the olfactory map formed and interpreted in the mammalian brain).</a> Annu. Rev. Neurosci. 34, 467-499 (2011).</li><li>De Vry, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electroporation+of+the+central+nervous+system:+a+non-viral+approach+for+targeted+gene+delivery.">In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery.</a> Prog. Neurobiol. 92 (3), 227-244 (2010).</li><li>Hovis, K. R., Padmanabhan, K., Urban, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+of+in+vitro+electroporation+allows+visualization,+recording,+and+calcium+imaging+of+local+neuronal+circuits.">A simple method of in vitro electroporation allows visualization, recording, and calcium imaging of local neuronal circuits.</a> J. Neurosci. Methods. 191 (1), 1-10 (2010).</li><li>Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+electroporation+theories:+a+review.">Membrane electroporation theories: a review.</a> Med. Biol. Eng. Comput. 44 (1-2), 5-14 (2006).</li><li>Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+electroporation+in+Xenopus+tadpoles+in+vivo--from+single+cells+to+the+entire+brain.">Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo--from single cells to the entire brain.</a> Differentiation. 70 (4-5), 148-154 (2002).</li><li>Hewapathirane, D. S., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+electroporation+in+vivo+within+the+intact+developing+brain.">Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain.</a> J. Vis. Exp. (17), (2008).</li><li>Gliem, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimodal+processing+of+olfactory+information+in+an+amphibian+nose:+odor+responses+segregate+into+a+medial+and+a+lateral+stream.">Bimodal processing of olfactory information in an amphibian nose: odor responses segregate into a medial and a lateral stream.</a> Cell. Mol. Life Sci. 70 (11), 1965-1984 (2013).</li><li>Hassenkl&#246;ver, T., Manzini, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+wiring+logic+in+amphibians+challenges+the+basic+assumptions+of+the+unbranched+axon+concept.">Olfactory wiring logic in amphibians challenges the basic assumptions of the unbranched axon concept.</a> J. Neurosci. 33 (44), 17252-1710 (2013).</li><li>Bestman, J. E., Ewald, R. C., Chiu, S. -. L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+single-cell+electroporation+for+transfer+of+DNA+and+macromolecules.">In vivo single-cell electroporation for transfer of DNA and macromolecules.</a> Nat. Protoc. 1 (3), 1272-1210 (2006).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J., Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal table of Xenopus laevis. , (1994).</li><li>Coup&#233;, P., Munz, M., Manj&#243;n, J. V., Ruthazer, E. S., Collins, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CANDLE+for+a+deeper+in+vivo+insight.">A CANDLE for a deeper in vivo insight.</a> Med. Image Anal. 16 (4), 849-864 (2012).</li><li>Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=V3D+enables+real-time+3D+visualization+and+quantitative+analysis+of+large-scale+biological+image+data+sets.">V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets.</a> Nat. Biotechnol. 28 (4), 348-353 (2010).</li><li>Falk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+cDNA/Morpholinos+to+targeted+areas+of+embryonic+CNS+in+Xenopus.">Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus.</a> BMC Dev. Biol. 7 (107), (2007).</li><li>Nezlin, L. P., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+olfactory+sensory+neurons+project+into+more+than+one+glomerulus+in+Xenopus+laevis+tadpole+olfactory+bulb.">Individual olfactory sensory neurons project into more than one glomerulus in Xenopus laevis tadpole olfactory bulb.</a> J. Comp. Neurol. 481 (3), 233-239 (2005).</li><li>Nagayama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+simultaneous+tracing+and+Ca2++imaging+of+local+neuronal+circuits.">In vivo simultaneous tracing and Ca2+ imaging of local neuronal circuits.</a> Neuron. 53 (6), 789-803 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ここで説明する実験手順は、幼虫Xの嗅覚器官の感覚ニューロンを標識化することができますフルオロフォア結合デキストランのエレクトロポレーションおよび生きている動物における感覚軸索成長のその後の可視化によってツメガエル 。 インビボでのエレクトロポレーションのパラメータを変えることにより、標識された感覚ニューロンの数を制御することが可能である。それは、感覚上皮のニューロンの大規模なグループ、非常に少数または単一の細胞を標識することが可能となる。 希望する神経細胞のラベリングの延長を保証するためには、マイクロピペット特性および電気穿孔パルス約特に慎重であることが重要です。高いピペット抵抗、電圧パルスの振幅、持続時間及び繰り返し回数の減少は、より広範な標識をもたらすことができるピペット抵抗と高電圧パルスの振幅、持続時間、およびパルスの数を減少させる一方で、標識された細胞の量を減らすことができる。目エレクトロポレーションのための蛍光デキストランの電子の使用は、適用した設定が適切であれば即時の視覚的なフィードバックを提供しています。プロトコルで提供された値を超えたパルスの振幅、持続時間、および数のパラメータを使用すると、潜在的に細胞の損傷、あるいは細胞死17につながる可能性があることに注意してください。マイクロピペットの目詰まりや破損のヒントにも成功したエレクトロポレーションを妨げることができます。 Xの嗅覚器官のin vivoエレクトロポレーションでは postmetamorphoticカエルの皮膚は厳しいですし、簡単にマイクロピペットで浸透することはできませんので、 ツメガエルは幼虫期に限られている。神経突起のin vivo可視化は、より深い脳領域または血管によって励起/発光光の散乱によって妨げられることができる。この問題は、より大きな脳への高い幼虫期に特に顕著になり、細かい軸索のプロセスの明確な識別をより困難にノイズの多い信号につながることができます。 <pクラス= &quot;jove_content&quot;&gt;ラベリング中に細胞を損傷、動物を解剖することなく、無傷の嗅覚系における感覚ニューロンを可視化するために提示プロトコル許可、組織切片を準備するか、全細胞パッチ中の標識のような、代替的な方法のために必要に応じて組織を固定-clamp実験18。 in vivoでのタイムラプスイメージングで数または単一の感覚ニューロンの標識を組み合わせる場合には、長い時間間隔にわたって単一の成熟した感覚ニューロンの糸球体の接続を可視化することが可能である。このように、それは数週間にわたって未熟感覚ニューロンの軸索投射パターンの開発を監視することも可能である。それは生きている動物内の単一の軸索の成長パターンを監視することができますので、この後者のオプションは、特に興味深い。これは軸索ガイダンスや経路探索を制御する細胞および分子メカニズムを調査する可能性を開く。嗅覚受容体の発現を含むいくつかの要因は、様々なAXOn個のガイダンス分子と感覚ニューロンの匂い物質誘発性/自発的活動は、感覚ニューロン軸索4,5のターゲット発見を調節することが示されている。 プロトコルの適用は、嗅覚感覚ニューロンに限定されず、 例えば、他の細胞型を研究するために適用することができる。、発達中の脳または嗅球の僧帽細胞の神経性ゾーン/前駆幹細胞。さらに実証技術は、標識されたニューロンおよび/ ​​または接続された回路7,19についての機能情報を取得するために、カルシウム感受性デキストランまたは注入された膜透過性カルシウム色素と組み合わせて使用することができる。デキストランに結合されたフルオロフォアの広範囲の利用可能性は、異なる色を持つ複数の個々の細胞または集団の標識化を可能にする。また、蛍光タンパク質のための例示的な符号化のためのDNA溶液を、プラスミドエレクトロポレーションに適しており、さらにversatiliを高めることができるTYとテクニック6の有用性。プロトコルは、さらにデキストランおよびDNAまたは荷電モルホリノの組み合わせエレクトロポレーション、遺伝子発現13,17を操作することができるように拡張することができる。 記載されている方法は確かに複雑であり、脊椎動物の嗅覚系における軸索ガイダンスを調節し、まだ十分に理解されていないプロセスを調査するための新しいツールを表しています。

The lifelong turnover of sensory neurons distinguishes the olfactory system from many other sensory and neuronal systems1,2. Newly formed sensory neurons are continuously generated in the basal portion of the olfactory epithelium3 and extend their axons into the olfactory bulb, the first relay station of the olfactory system4. However, the cellular and molecular mechanisms controlling the formation and maintenance of the olfactory map are far from being fully understood4,5.
Here, we describe a protocol for labeling sensory neurons of the olfactory organ of larval X. laevis by in vivo electroporation of fluorophore-coupled dextrans. The presented protocol allows visualization of axonal morphology and connectivity, track axonal development over time and study mechanisms regulating axonal wiring and guidance.
Electroporation is a well established method to introduce charged macromolecules, like dextran-coupled dyes and DNA, into cells6,7. The cell membrane is permeabilized by application of short voltage pulses and the molecules are electrophoretically delivered into the cytosol8. Spatially restricted electroporation using a micropipette permits selective labeling of cells including neurons and has been applied in various neuronal systems including the visual system of X. laevis9,10.
We show how the electroporated animals can be used to study axonal growth patterns and morphology in living animals using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. The described procedure allows identifying the coarse topology of axonal projections of sensory neurons of the main and accessory olfactory system11,12. Using in vivo time lapse imaging, it is also suitable to supervise the glomerular connections of single mature sensory neurons, and to monitor the evolution of the axonal projection patterns of immature sensory neurons12. The described protocol can be applied to investigate the structure and formation of olfactory circuits in the intact animal and can be adapted to other cell types within the olfactory and other neuronal systems.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="589">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:100px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">SZX16</td>
			<td style="width:100px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">stereomicroscope with fluorescent illumination</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Axon Axoporator 800A</td>
			<td style="width:100px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">single cell electroporator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">ELP-01D</td>
			<td style="width:100px;">npi electronic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">electroporator</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">MMJ</td>
			<td style="width:100px;">M&#228;rzh&#228;user Wetzlar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">manual micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">P-1000</td>
			<td style="width:100px;">Sutter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Horizontal micropipette puller</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:203px;">G150F-4</td>
			<td style="width:100px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">glass capillaries for electroporation pipette fabrication; internal filament makes backfilling easier</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Alexa 488-dextran 10kD</td>
			<td style="width:100px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D22910</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Alexa 546-dextran 10kD</td>
			<td style="width:100px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D22911</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Alexa 568-dextran 10kD</td>
			<td style="width:100px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D22912</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Alexa 594-dextran 10kD</td>
			<td style="width:100px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D22913</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">TMR-dextran 3kD (micro-Ruby)</td>
			<td style="width:100px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D7162</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">microloader pipette tips</td>
			<td style="width:100px;">eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">930001007</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:203px;">tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td>
			<td style="width:100px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E10521</td>
			<td style="width:167px;">anesthetic; use gloves</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">A1-MP</td>
			<td style="width:100px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">multiphoton microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">LSM 780</td>
			<td style="width:100px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Imaris</td>
			<td style="width:100px;">Bitplane</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">alternative software for neuronal tracing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the olfactory system as a model to study axonal growth patterns and morphology in vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

記載されたプロトコルが正常にエレクトロポレーションし、麻酔されたXの嗅覚系の感覚ニューロンの軸索プロセスのin vivoでの可視化に適用することができツメガエル 、共焦点レーザー走査または多光子顕微鏡法（ 図1）を使用。 エレクトロポレーションは、フルオロフォア結合デキストランを入力すると、急速に嗅覚器官の細胞の内側に広がることを可能にする。これは、電圧パルスのトリガ後に成功したラベリングを検証するために蛍光照明を適用すると便利です。 、エレクトロポレーションパラメータに応じて、例えば 、ピペット抵抗は、細胞（ 図2A、B）または嗅覚器官の単一細胞（ 図2C）の基が標識されている。標識された感覚ニューロンの軸索は、嗅神経（ 図2D）で可視化することができ、軸索のプロセスが成功したエレクトロポレーション後、嗅球においても、通常24時間を観察することができる（ 図3）。感覚ニューロンのグループのエレクトロポレーションは、嗅球（ 図3A）に粗配線パターンを可視化することができる。単一細胞エレクトロポレーションは、嗅球（ 図3C-E）における糸球体の構造の個々の軸索投射パターンが、軸索の分岐部と接続性を調査するために適用することができる。 Xの透明アルビノオタマジャクシ麻酔をかけたオタマジャクシの無傷の脳における標識感覚ニューロンの生体内共焦点または多光子イメージングにおけるツメガエル許可 。同じ標識感覚ニューロン（ 図4）のin vivoでの可視化を繰り返すことにより、軸索の成長パターンの開発は、数日/数週間にわたって追跡することができる。感覚ニューロンの成熟度に応じて、エレクトロポレーションの時点で嗅球における軸索パターンが大幅に変化することができる。成熟したニューロンは既に房を備えて精巧な軸索の枝を持っている糸球体に接続されているEDエリア。成熟したニューロンの軸索成長パターンはむしろ安定であるが、糸球体房の軸索の枝や改良の伸びが（ 図4A-E）観測可能である。感覚ニューロンは、 例えば 、長期間にわたって生体内で観察することができる。3週間（ 図4F-I）よりも長い。一方、未熟ニューロンの軸索は、タフテッドarborizationsを有していない、初期成長の過程にまだ​​ある、まだそれらの最終的な糸球体ターゲットに接続していない。実験プロトコルは、成熟中にこれらのニューロンの開発を追跡することができます例えば 、軸索の伸長、分岐及びタフテッドarborizations（ 図4J-L）の設立。その他の例についてもHassenklöverとマンジニ12を参照してください。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52143/52143fig1highres.jpg" width="500"/&gt; 麻酔をかけたXの嗅覚器官の実験プロトコルの図1.概要。（A）の主嗅上皮における感覚ニューロン（MOE）または鋤鼻器官（VNO） ツメガエルの幼生は、蛍光デキストラン溶液を充填したガラスピペットを用いてエレクトロポレーションを介して標識される。標識されたニューロンの軸索は、嗅神経（ON）を介して、続いて、最終的に嗅球（OB）に到達することができる。（B）オタマジャクシに麻酔され、標識されたニューロンを繰り返し、特定の時間間隔で、共焦点又は多光子顕微鏡を用いて調べた。 （C）標識された細胞の軸索成長パターンのインクリメンタル開発は、数日から数週間の時間スパンにわたって追跡することができる。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52143/52143fig2highres.jpg" width="500" /> 図2.エレック嗅覚器官における感覚ニューロンのポレーション（A）エレクトロ低抵抗ピペットとは、嗅覚器官内の複数の細胞の標識をもたらす。この代表的な例では、複数の嗅覚受容ニューロン（ORN類、満たされた矢じり）と2つの円柱形の支持細胞（SCS、アスタリスク）が染色された。破線は、嗅上皮（OE）の境界を画定する。（B）、エレクトロポレーションパラメータを絞り込み、 例えば 、ピペットの抵抗を増大させる、標識細胞の数を制限する。この例では、単一の感覚ニューロン（黒塗り矢印）と一つの隣接支持細胞（アスタリスク）は、エレクトロポレーションの後に染色した。嗅上皮（オープン矢じり）を残し、単一の軸索に注意してください。（C）に成功した単一細胞エレクトロポレーションは、個々の感覚ニューロン（塗りつぶされた矢印）および嗅上皮で、接続された軸索（オープン矢じり）の排他的ラベリングにつながる。 <sチョン&gt;（D）単一ラベルの軸索（オープン矢頭）が嗅球に嗅覚神経（ON）を通じて続くことができる。 <img alt="図3" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52143/52143fig3highres.jpg" width="400" /> 図3.摘出した嗅球における嗅覚軸索投射を可視化。（A）の嗅球における感覚ニューロンの軸索投射の粗いトポロジーは、低抵抗電気穿孔ピペットを用いて可視化することができる。 One嗅球半球とそれに関連する嗅神経（ON）が示されている。 MOE（赤）とVNO（オレンジ）を外側から内側、横方向（緑）、中間体（黄色）：異なる蛍光体に結合された4つのデキストランは、嗅覚器官の4離れた位置で電気穿孔した。これは副嗅球（AOB）と主嗅球（MOB）の3つの主要な投影フィールドを可視化することができます。 <strオング&gt;（B）は嗅球の構造に重ね合わせ、単一の嗅細胞の軸索異なる成長パターン。描写は、異なる幼虫の標本に由来し、複数の単一細胞染色の三次元再構成を組み合わせられる。嗅球内に突出すると球状糸球体（塗りつぶされた矢印）にタフトarborizations /シナプスを形成する単一の嗅覚軸索の（CE）の例。 Xのことに注意してください嗅覚軸索は（塗りつぶされた矢印は、またHassenklöverとマンジニ12を参照）一つ、二つまたは複数の糸球体に接続する前に定期的に（オープン矢じり）を二股ツメガエル 。 <img alt="図4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52143/52143fig4highres.jpg" width="500" /> シングル嗅覚ニューロンの軸索のin vivoでのタイムラプスイメージング。（AE） では 、図4成功した単一細胞のエレクトロポレーションの後、標識軸索を繰り返し嗅球（OB）で可視化することができる。この例では、1週間調査した個々の軸索を示しています。 （開いた矢印）の全体的な形態は大きく変化せず、二つの主要な分岐点を識別することができる。他の二つの糸球体の房が（アスタリスク）安定した状態を保つのに対し、時間経過にわたって、1糸球体房は、連続の減少（塗りつぶされた矢印）を受けることに注意してください。（FI）この特定の軸索を調べたように、この代表的な例は、長期的な観測の生存率を示す3週間以上のために。その成長パターンの明らかな変化は検出できなかった。（JL）成長過程における未熟感覚軸索の一例が示されている。それはまだ糸球体に接続されていないがあり、特徴的な糸球体房が欠落しています。軸索の枝を長くしている5日後に、軸索は複数回と罰金arborizationsである二股確立された。

Watch this Scientific Journal Video about The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo at JoVE.com

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

モデルとしての嗅覚系は、軸索の成長パターンと形態を研究する<em&gt;インビボ</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

the-olfactory-system-as-model-to-study-axonal-growth-patterns

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

10.8K ビュー.  University of Göttingen. We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

ビデオ: The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of Alzheimer's disease (AD) and is found in Lewy body dementia, inclusion body myositis and cerebral amyloid angiopathy 1-4. Amylopathies progressively develop with time. For this reason simple organisms with short lifespans may help to elucidate molecular aspects of these conditions. Here, we describe experimental protocols to study A&beta;-mediated neurodegeneration using the worm Caenorhabditis elegans. Thus, we construct transgenic worms by injecting DNA encoding human A&beta;42 into the syncytial gonads of adult hermaphrodites. Transformant lines are stabilized by a mutagenesis-induced integration. Nematodes are age synchronized by collecting and seeding their eggs. The function of neurons expressing A&beta;42 is tested in opportune behavioral assays (chemotaxis assays). Primary neuronal cultures obtained from embryos are used to complement behavioral data and to test the neuroprotective effects of anti-apoptotic compounds.

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

We describe methods to study aspects of amylopathies in the worm C. elegans. We show how to construct worms expressing human A&beta;42 in neurons and how to test their function in behavioral assays. We further show how to obtain primary neuronal cultures that can be used for pharmacological testing.

A<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</emAmylopathyの研究のための&gt;モデルシステム

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

神経科学

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

小脳顆粒ニューロンの遺伝子操作<em&gt;体外</em&gt;と<em&gt;インビボ</em&gt;ニューロンの形態と移行を研究するために、

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

無傷の鋤鼻器官と副嗅球のex vivoでの準備

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

A Free-breathing fMRI Method to Study Human Olfactory Function

The study of human olfaction is a highly complex and valuable field with applications ranging from biomedical research to clinical evaluation. Currently, evaluation of the functions of the human central olfactory system with functional magnetic resonance imaging (fMRI) is still a challenge because of several technical difficulties. There are some significant variables to take into account when considering an effective method for mapping the function of the central olfactory system using fMRI, including proper odorant selection, the interaction between odor presentation and respiration, and potential anticipation of or habituation to odorants. An event-related, respiration-triggered olfactory fMRI technique can accurately administer odorants to stimulate the olfactory system while minimizing potential interference. It can effectively capture the precise onsets of fMRI signals in the primary olfactory cortex using our data post-processing method. The technique presented here provides an efficient and practical means for generating reliable olfactory fMRI results. Such a technique can ultimately be applied in the clinical realm as a diagnostic tool for diseases associated with olfactory degeneration, including Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s disease, as we begin to further understand the complexities of the human olfactory system.

We present the technical challenges and solutions for obtaining reliable functional magnetic resonance imaging (fMRI) data from the human central olfactory system. This includes special considerations in olfactory fMRI paradigm design, descriptions of fMRI data acquisition with an MRI-compatible olfactometer, odorant selection, and a special software tool for data post-processing.

ヒトの嗅覚機能を研究する自由呼吸fMRI法

The study of human olfaction is a highly complex and valuable field with applications ranging from biomedical research to clinical evaluation. Currently, ...

Facial Nerve Surgery in the Rat Model to Study Axonal Inhibition and Regeneration

This protocol describes consistent and reproducible methods to study axonal regeneration and inhibition in a rat facial nerve injury model. The facial nerve can be manipulated along its entire length, from its intracranial segment to its extratemporal course. There are three primary types of nerve injury used for the experimental study of regenerative properties: nerve crush, transection, and nerve gap. The range of possible interventions is vast, including surgical manipulation of the nerve, delivery of neuroactive reagents or cells, and either central or end-organ manipulations. Advantages of this model for studying nerve regeneration include simplicity, reproducibility, interspecies consistency, reliable survival rates of the rat, and an increased anatomic size relative to murine models. Its limitations involve a more limited genetic manipulation versus the mouse model and the superlative regenerative capability of the rat, such that the facial nerve scientist must carefully assess time points for recovery and whether to translate results to higher animals and human studies. The rat model for facial nerve injury allows for functional, electrophysiological, and histomorphometric parameters for the interpretation and comparison of nerve regeneration. It thereby boasts tremendous potential toward furthering the understanding and treatment of the devastating consequences of facial nerve injury in human patients.

This protocol describes a reproducible approach to facial nerve surgery in the rat model, including descriptions of various inducible patterns of injury.

軸索抑制と再生を研究するラットモデルにおける顔面神経外科

This protocol describes consistent and reproducible methods to study axonal regeneration and inhibition in a rat facial nerve injury model. The facial ...

Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is centered on culturing small pieces of embryonic or early postnatal rodent brains inside a 3-D hydrogel formed by the rat tail tendon-derived type I collagen with specific porosity. Tissue pieces are cultured inside the hydrogel and confronted to specific brain fragments or genetically-modified cell aggregates to produce and secrete molecules suitable for creating a gradient inside the porous matrix. The steps of this protocol are simple and reproducible but include critical steps to be considered carefully during its development. Moreover, the behavior of growing axons can be monitored and analyzed directly using a phase-contrast microscope or mono/multiphoton fluorescence microscope after fixation by immunocytochemical methods.

Here, we provide a method for analyzing the behavior of growing axons in 3D matrices, mimicking their natural development.

神経系発達中の軸の成長と挙動を解析する3Dコラーゲンベースのヒドロゲルの生成

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is ...

Coculture of Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia, as an In Vitro Model of Adult Axonal Regeneration

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory bulb. Throughout adult life, they are key for axonal growing of newly generated olfactory neurons, from the lamina propria to the ONL. Due to their pro-regenerative properties, these cells have been used to foster axonal regeneration in spinal cord or optic nerve injury models.
We present an in vitro model to assay and measure OEG neuroregenerative capacity after neural injury. In this model, reversibly immortalized human OEG (ihOEG) is cultured as a monolayer, retinas are extracted from adult rats and retinal ganglion neurons (RGN) are cocultured onto the OEG monolayer. After 96 h, axonal and somatodendritic markers in RGNs are analyzed by immunofluorescence and the number of RGNs with axon and the mean axonal length/neuron are quantified.
This protocol has the advantage over other in vitro assays that rely on embryonic or postnatal neurons, that it evaluates OEG neuroregenerative properties in adult tissue. Also, it is not only useful for assessing the neuroregenerative potential of ihOEG but can be extended to different sources of OEG or other glial cells.

We present an in vitro model to assess olfactory ensheathing glia (OEG) neuroregenerative capacity, after neural injury. It is based on a coculture of axotomized adult retinal ganglion neurons (RGN) on OEG monolayers and subsequent study of axonal regeneration, by analyzing RGN axonal and somatodendritic markers.

アキソトマイズ化ラットレチナル神経節ニューロンの嗅覚エンシアシンググリアの共培養、成人軸索再生のインビトロモデルとしての

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory ...

Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development

Neurons undergo dynamic changes in their structure and function during brain development to form appropriate connections with other cells. The rodent cerebellum is an ideal system to track the development and morphogenesis of a single cell type, the cerebellar granule neuron (CGN), across time. Here, in vivo electroporation of granule neuron progenitors in the developing mouse cerebellum was employed to sparsely label cells for subsequent morphological analyses. The efficacy of this technique is demonstrated in its ability to showcase key developmental stages of CGN maturation, with a specific focus on the formation of dendritic claws, which are specialized structures where these cells receive the majority of their synaptic inputs. In addition to providing snapshots of CGN synaptic structures&#160;throughout cerebellar development, this technique can be adapted to genetically manipulate granule neurons in a cell-autonomous manner to study the role of any gene of interest and its effect on CGN morphology, claw development, and synaptogenesis.

Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development

Here we describe a method to visualize synaptogenesis of granule neurons in the mouse cerebellum over the time course of postnatal brain development when these cells refine their synaptic structures and form synapses to integrate themselves into the overall brain circuit.

in vivo生後エレクトロポレーションによる小脳顆粒ニューロンの形態とシナプス発生の研究

Neurons undergo dynamic changes in their structure and function during brain development to form appropriate connections with other cells. The rodent ...

Optimizing the Setup and Conditions for Ex Vivo Electroretinogram to Study Retina Function in Small and Large Eyes

Measurements of retinal neuronal light responses are critical to investigating the physiology of the healthy retina, determining pathological changes in retinal diseases, and testing therapeutic interventions. The ex vivo electroretinogram (ERG) allows the quantification of contributions from individual cell types in the isolated retina by addition of specific pharmacological agents and evaluation of tissue-intrinsic changes independently of systemic influences. Retinal light responses can be measured using a specialized ex vivo ERG specimen holder and recording setup, modified from existing patch clamp or microelectrode array equipment. Particularly, the study of ON-bipolar cells, but also of photoreceptors, has been hampered by the slow but progressive decline of light responses in the ex vivo ERG over time. Increased perfusion speed and adjustment of the perfusate temperature improve ex vivo retinal function and maximize response amplitude and stability. The ex vivo ERG uniquely allows the study of individual retinal neuronal cell types. In addition, improvements to maximize response amplitudes and stability allow the investigation of light responses in retina samples from large animals, as well as human donor eyes, making the ex vivo ERG a valuable addition to the repertoire of techniques used to investigate retinal function.

Optimizing the Setup and Conditions for Ex Vivo Electroretinogram to Study Retina Function in Small and Large Eyes

Modification of existing multielectrode array or patch clamp equipment makes the ex vivo electroretinogram more widely accessible. Improved methods to record and maintain ex vivo light responses facilitate the study of photoreceptor and ON-bipolar cell function in the healthy retina, animal models of eye diseases, and human donor retinas.

大小眼の網膜機能を研究するための Ex Vivo 網膜電図のセットアップと条件の最適化

Measurements of retinal neuronal light responses are critical to investigating the physiology of the healthy retina, determining pathological changes in ...

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones -the sensory structures located at the distal tips of developing axons- execute this process. Studying the structure and dynamics of the growth cone is crucial to understanding axonal development and the interactions with the surrounding central nervous system (CNS) that enable it to form neural circuits. This is essential when devising methods to reintegrate axons into neural circuits following injury in fundamental research and pre-clinical contexts. Thus far, the general understanding of growth cone dynamics is primarily founded on studies of neurons cultured in two dimensions (2D). Although undoubtedly fundamental to the current knowledge of growth cone structural dynamics and response to stimuli, 2D studies misrepresent the physiological three-dimensional (3D) environment encountered by neuronal growth cones in intact CNS tissue. More recently, collagen gels were employed to overcome some of these limitations, enabling the investigation of neuronal development in 3D. However, both synthetic 2D and 3D environments lack signaling cues within CNS tissue, which direct the extension and pathfinding of developing axons. This protocol provides a method for studying axons and growth cones using organotypic brain slices, where developing axons encounter physiologically relevant physical and chemical cues. By combining fine-tuned in utero and ex utero electroporation to sparsely deliver fluorescent reporters along with super-resolution microscopy, this protocol presents a methodological pipeline for the visualization of axon and growth cone dynamics in situ. Furthermore, a detailed toolkit description of the analysis of long-term and live-cell imaging data is included.

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

This protocol demonstrates a straightforward and robust method to study in situ axon growth and growth cone dynamics. It describes how to prepare ex vivo physiologically relevant acute brain slices and provides a user-friendly analysis pipeline.

その場で 急性 エクスビボ 胚性脳スライス培養における軸索成長および成長円錐ダイナミクスの可視化

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones ...