この文書に含まれている映像のために細胞培養を提供するための博士テリーSchochetに、細胞培養をめっきし、維持するためにケビン宮代に感謝。さらに、aRNAの手順で入力するためのケビン宮代、ピーターバックリー、およびティーナPertizにありがとう。この作業のための資金は国立老化研究所、精神保健及びペンシルベニア州の連邦からの人事ファクトファインダーファンドの国立研究所からだった。

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	<li>Davis, J. E., Eberwine, J. H., Hinkle, D. A., Marciano, P. G., Meaney, D. F., McIntonsh, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+considerations+regarding+single-cell+gene+expression+profiling+for+brain+injury.">Methodological considerations regarding single-cell gene expression profiling for brain injury.</a> Neurochemical Research. 29, 1113-1121 (2004).</li><li>Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+molecular+biology.">Single-cell molecular biology.</a> Nature Neuroscience. 4, 1155-1156 (2001).</li><li>Kamme, F., Salunga, R., Yu, J., Tran, D., Zhu, J., Luo, J., Bittner, A., Guo, H., Miller, N., Wan, J., Erlander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+microarray+analysis+in+hippocampus+CA1:+Demonstration+and+Validation+of+Cellular+Heterogeneity.">Single-cell microarray analysis in hippocampus CA1: Demonstration and Validation of Cellular Heterogeneity.</a> The Journal of Neuroscience. 23, 3607-3607 (2003).</li><li>Hinkle, D., Glanzer, J., Sarabi, A., Pajunen, T., Zielinski, J., Belt, B., Miyashiro, K., McIntosh, T., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+neurons+as+experimental+systems+in+molecular+biology.">Single neurons as experimental systems in molecular biology.</a> Progress in Neurobiology. 72, 129-142 (2004).</li><li>Ginsberg, S. D., Elarova, I., Ruben, M., Tan, F., Counts, S. E., Eberwine, J. H., Trojanowski, J. Q., Hemby, S. E., Mufson, E. J., Che, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+gene+expression+analysis:+Implications+for+Neurodegenerative+and+Neuropsychiatric+Disorders.">Single-cell gene expression analysis: Implications for Neurodegenerative and Neuropsychiatric Disorders.</a> Neeurochemical Research. 29, 1053-1064 (2004).</li><li>Eberwine, J., Spencer, K., Miyashirto, K., Mackler, S., Finnell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+DNA+synthesis+in+situ:+methods+and+applications.">Complementary DNA synthesis in situ: methods and applications.</a> Methods Enxymol. 216, 80-100 (1992).</li><li>Eberwine, J., Yeh, H., Miyashiro, K., Cao, Y., Nair, S., Finnell, R., Zettel, M., Coleman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gene+expression+in+single+live+neurons.">Analysis of gene expression in single live neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, 3010-3014 (1992).</li><li>Kelz, M. B., Dent, G. W., Therianos, S., Marciano, P. G., McIntosh, T. K., Coleman, P. D., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+antisense+RNA+amplification+and+microarray+analysis+as+a+tool+for+studying+neurological+degeneration+and+restoration.">Single-cell antisense RNA amplification and microarray analysis as a tool for studying neurological degeneration and restoration.</a> Sci. Aging Knowledge Eviron. 1, re1-re1 (2002).</li><li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture.">Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> Brain Research. 126, 397-425 (1977).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> P-1000 &#38; P-97 Pipette Cookbook. , (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> MinElute Handbook For MinElute Reaction Cleanup Kit. , 28-29 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Megascript kit. , 7-8 .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> MEGAclear kit. , 4-5 .</li><li>Eberwine, J., Kacharmina, J. E., Andrews, C., Miyashiro, K., McIntosh, T., Becker, K., Barrett, T., Hinkle, D., Dent, G., Marciano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+expression+analysis+of+tissue+sections+and+single+cells.">mRNA expression analysis of tissue sections and single cells.</a> The Journal of Neuroscience. 21, 8310-8314 (2001).</li><li>Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA.">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87, 1663-1667 (1990).</li><li>Miyashiro, K., Dichter, M., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+nature+and+differential+distribution+of+mRNAs+in+hippocampal+neuritis:+Implications+for+neuronal+functioning.">On the nature and differential distribution of mRNAs in hippocampal neuritis: Implications for neuronal functioning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 10800-10804 (1994).</li><li>Sul, J., Wo, C. K., Zeng, F., Jochems, J., Lee, M. T., Kim, T. K., Peritz, T., Buckley, P., Cappelleri, D. J., Maronski, M., Kim, M., Kumar, V., Meaney, D., Kim, J., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+transfer+produces+a+predictable+cellular+phenotype.">Transcriptional transfer produces a predictable cellular phenotype.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 7624-7629 (2009).</li><li>Sow, F. B., Gallup, J. M., Sacco, R. E., Ackerman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+revisited+as+a+tool+for+transcriptomic+analysis:+Application+of+an+excel-based+qPCR+preparation+software+(PREXCEL-Q).">Laser capture microdissection revisited as a tool for transcriptomic analysis: Application of an excel-based qPCR preparation software (PREXCEL-Q).</a> Int. J. Biomed. Sci. 5, (2010).</li><li>Vandewoestyne, M., Deforce, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+in+forensic+research:+a+review.">Laser capture microdissection in forensic research: a review.</a> Int J Legal Med. 124, (2010).</li><li>Eberwine, J., Bartfai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+transcriptomics+of+hypothalamic+warm+sensitive+neurons+that+control+core+body+temperature+and+fever+response+Signaling+asymmetry+and+an+extension+of+chemical+neuroanatomy.">Single cell transcriptomics of hypothalamic warm sensitive neurons that control core body temperature and fever response Signaling asymmetry and an extension of chemical neuroanatomy.</a> Pharmacol. Ther. , (2010).</li></ol>

博士はEberwineは博士Eberwineが、株主であるLBS技術にライセンスされているaRNAの特許の発明者です。

注意事項とトラブルシューティング<ul><li>あなたは前と後に標的細胞が単離されたことを示す画像と、残りの半影はそのまま残されたものになるとよいでしょう。 </li><li>あなたが収穫されるためあまり解決策は、ピペットを入力している場合は、3ウェイルアーロックフィッティングとチューブに正圧を保持するシリンジ用プランジャーを使用することができます。任意のボリュームは、処理の種類によって異なりますが、最大5μlのは、ほとんどのアプリケーションで問題ないはずです。 </li></ul>分子生物学的手法の一般的なヒント<ul><li>渦すべての株式のチューブを、反応に添加する前に、それらをスピンダウン。 NEVER渦酵素。 </li><li>徹底的にバッファが適切な濃度であることを保証するために酵素を加える前に反応を混ぜる。 </li><li>可能であればstratacoolerを使用して-20℃で酵素の在庫を保管してください。そうでない場合は、、右使用前に取り外して氷上に保持し、-20℃にすぐに戻ります</li><li>常にピペッティングエラーを減らすために複数の反応を準備する時、マスターミックスのこと。サンプル数に基づいて必要な量を計算すると10-20％を追加。 </li><li>店舗RNA -80 ° Cを遅らせる劣化へ。 RNAは酸性条件下で発生するRNAのa​​purinationを遅らせるためにバッファに格納されている最も安定しています。 </li></ul> aRNAの手順の一般的な概要図4Aは、aRNAの手順の最初のラウンドを示しています。第一鎖の反応では、T7 - oligo（dT）プライマーのポリ- T部分は、ポリA尾部に結合することによってmRNA種（長い白い長方形）のために選択されます。いくつかのマイクロRNAは、ポリアデニル化されると、このプロシージャによって取得されます。さらに重要なことは、しかし、細胞の中で最も豊富なRNAは、リボソームRNAは、しません。このオリゴは、テンプレートとしてmRNAを用いたcDNA（長い灰色の長方形）の相補鎖を合成する逆転写酵素のためのプライマーとして機能します。 T7 -オリゴ（dT）プライマーのT7の部分は、開始mRNAに配列をアンチセンスでフレーム内のT7 RNAポリメラーゼプロモーターが組み込まれています。これは、in vitroでの転写反応の後半で使用されています。 次に、前の手順で作成した発現/ DNAハイブリッド中のmRNAは、ラギング鎖のDNA合成で作成された岡崎フラグメントと同様のRNA&quot;プライマー&quot;を（小さな白い長方形）を作成RNアーゼHによって部分的に加水分解される。 DNAポリメラーゼは、私がテンプレートとしてmRNAに相補的なDNAを使用してプライムDNA合成にRNA断片を使用しています。それは次のRNA断片に到達すると、その5&#39;から3&#39;ヌクレアーゼ活性は、リボヌクレオチドを​​除去し、デオキシリボヌクレオチドに置き換えます。 DNAリガーゼは、リーディング鎖の交換が​​完了していない任意の鎖を連結するために追加されます。 RNA断片は、DNAポリメラーゼIが作成するための最初のプライマーとして役立ったところ、T4 DNAポリメラーゼは、エリアを埋めるために追加されて平滑末端に二重次にIVT反応を実行する前に精製される二本鎖cDNAを。 IVT反応では、T7 RNAポリメラーゼは、鋳型としてセンス鎖を使って二重鎖cDNAと合成するアンチセンスRNA分子（長い黒い長方形）に組み込まれたT7プロモータに結合する。これは、アンチセンスRNA分子の数千が各二本鎖cDNA分子（図4A）から生成される増幅のステップとして機能します。 図4Bに示すように第二ラウンドは、、出発RNAはアンチセンス（黒く塗りつぶした矩形）であるとT7 -オリゴの標的にされたポリアデニル化した尾部を欠いているので、最初のラウンドのそれとは若干異なる逆転写反応から始まり、最初のラウンドで（dT）プライマー。したがって、この反応は、ランダムプライマー（小さなグレーの長方形）と続いて変性RNAを発揮する。第二鎖の反応は、前述の逆転写反応で作成したセンスRNAの3&#39;末端にポリA配列に結合するT7 -オリゴ（dT）プライマーでプライミングされています。別のIVT反応は、最初のラウンドと同様に実行されます。この第二ラウンドは、通常、単一の細胞から増幅3回を達成するには、少なくとも一回繰り返されます。 アプリケーション我々はこの記事で紹介されていることの技術は多数のアプリケーションに変換することができます。単一細胞の単離のプロトコールは、急性スライスで使用するために変更することができます。14技術的に困難なものの、同じ原則が、この代替の準備に適用されます。ピペットのサイズが若干調整されている場合はさらに、細胞の生理機能の録音は、収穫が生理的な出力の背後にある分子メカニズムの十分に制御された調査を許可する前に行うことができます。別の若干の修正は15が 、このアプリケーションでは。細胞体からプロセスを分離することになってピペットで細胞体を収集し、新鮮なピペットで戻って、100から300に識別dendritを収集するESまたはコレクションチューブあたり軸索。。16 一度細胞が収穫されて、mRNAの存在量と組成の比較は、同一の細胞集団内でも異なるとの間で行うことができます。第三ラウンドにビオチン- UTPを組み込んだaRNAのは、これらの相対的なmRNAの存在量を決定するためにマイクロアレイ解析が可能になります。オリジナルのmRNAの人口の組成物はまた、次世代シーケンシングを使用してaRNAの手順の後に決定することができます。増幅されたaRNAを、前者のように後者の細胞型の表現型の変化を誘導するために、ひとつの細胞型からのmRNAの完全なセットが異なる細胞型にトランスフェクトされた細胞の表現型の変換の研究を確認するためにも使用できます。手順ラボが開発し、TIPeRとして知られている。17これらの研究は、病気の状態や細胞の表現型とそのような研究を研究するために特に有用であるが、ラボで現在進行中です。 RT - PCRや定量PCRは、細胞特異的遺伝子の発現を確認するために増幅された材料で行うことができます。さらに、トランスフェクションまたは形質導入の効率性の評価は、単一細胞レベルで行うことができます。 利点と制限事項抽象的に記載されているように、分析のための単一細胞の単離は、異種細胞集団の解析で見られる平均化の効果がなくなります。これらの平均化の効果は、豊富な転写を過剰表現して平均化し、多くの発現量の低い転写産物の検出を防止することにより、単一細胞内のmRNAの存在量を偽る。フローサイトメトリーは、個々のセルを並べ替えるために使用されますが、この方法は、細胞特異的マーカーと高価な機器の知識が必要です。18レーザーキャプチャーマイクロダイセクションはどちらUVやIRレーザーキャプチャーマイクロダイセクションシステムと単一のセル、さらには細胞内取り込みを可能にするだけの目的の細胞を必要とすることができます非常に薄い切片の表面に位置する。19はフローサイトメトリーと同様に、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションはまた、高価な機器が必要です。 上記の電極ベースのコレクションの技術の主な利点の1つは、その貴重な電気生理学的データが同じセルで実行される機能性とトランスクリプトーム解析を可能にする、収穫の前に目的の細胞から得ることができるからである。私たちの技術の20の欠点があるそれは、マニピュレーターを使用して経験を必要としないこと。マイクロマニピュレータに精通して研究者らは、このテクニックは非常に直感的にわかりますが、そのような経験を持つ個人が必要な細かい動きに慣れる必要があります。 任意の増幅技術に内在するには、サイズと塩基組成に基づいて特定の転写産物の選択的増幅です。4,6,7ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）などの逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT - PCR）、cDNAの迅速増幅のようなベースのテクニックは線形増幅のaRNAの増幅法の結果、一方の端（RACE）の転写産物の指数関数的増幅の結果、。このように、aRNAの手順の主要な利点の一つは、より指数関数的に増幅するのではなく、唯一の直線的に増幅過程で発生したエラーやバイアスを増幅することによってmRNAの転写産物の相対的存在量を維持する能力にあるエラーやバイアスは言った。 マイクロアレイ解析と相まってaRNAの手順は、処理または未処理同様のまたは別の形態の単セル間のmRNAの存在量の比較ができます。さらに、増幅された材料は、次世代シーケンシングのために提出することができます。5,8がしかし、、手続きのためのランダムプライマーを使用することとは対照的に、オリゴ- dTプライミング手順はの偏見の増幅上記以来、このような分析には注意が必要mRNAおよび各ラウンドで、その後の増幅された物質のわずかな短縮で、一般的に、結果の3&#39;末端。ケアは、いくつかの偽の不在コールが若干短縮増幅された物質から発生することができるように標準的な方法とマイクロアレイの結果を分析することに注意してください。さらに、シーケンシングの結果は確かに全5提供する間、&quot;オリジナルのmRNAのほとんどのシーケンスを、5&#39;いくつかのmRNAのシーケンスが見逃される可能性があります。これらの理由により、増幅のラウンド数を制限する必要があります。

A correction was made to <a href="http://http://www.jove.com/video/2634/transcriptome-analysis-of-single-cells">Transcriptome Analysis of Single Cells</a>. There were errors in the volumes used in the aRNA Amplification section.

Erratum: Transcriptome Analysis of Single Cells

<table><tbody><tr><td>Spiegelgas coverslips</td><td>Carolina Biological</td><td>63-3029</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 35x10 mm culture dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-90</td><td></td></tr><tr><td>Water for cell culture</td><td>Lonza Inc.</td><td>17-724Q</td><td>For making solutions used for cell culture and rinsing coverslips</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine MW70-150K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6407</td><td></td></tr><tr><td>Laminin, ultrapure</td><td>BD Biosciences</td><td>354239</td><td></td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0252</td><td></td></tr><tr><td>MEM with Earle&amp;rsquo;s salts and glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>41090-101</td><td>For plating cells</td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Horse serum</td><td>Invitrogen</td><td>16050</td><td></td></tr><tr><td>Cytosine beta-D-arabinofuranoside</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1768</td><td></td></tr><tr><td>MEM with Earle&amp;rsquo;s salts and L-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>11095-098</td><td>For growing cells</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>B27 serum-free supplement</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillary tubes (1.5mm O.D, 100mm length)</td><td>Kimble Chase</td><td>34500 99</td><td>Any borosilicate glass pipette will work as long as the proper bore size is attained. </td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14175</td><td>Any solution will work as long as the components won&amp;rsquo;t interfere with any future processing (i.e. no Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; or Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;)</td></tr><tr><td>1ml syringe</td><td>BD Biosciences</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Needle</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Gauge depends on the diameter of the pipettes</td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>Amersham</td><td>28-4065-51</td><td></td></tr><tr><td>dt-T7 oligo</td><td>Custom</td><td>Midland Certified</td><td></td></tr><tr><td>Second strand buffer (5x)</td><td>Invitrogen</td><td>Y01129</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td></td><td></td><td>Supplied with second strand buffer</td></tr><tr><td>E.coli DNA Ligase</td><td>Invitrogen</td><td>100002324</td><td></td></tr><tr><td>DNA polymerase I</td><td>Invitrogen</td><td>100004926</td><td></td></tr><tr><td>Rnase H</td><td>Invitrogen</td><td>18021-071</td><td></td></tr><tr><td>Megascript T7 kit</td><td>Ambion</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>Random primers</td><td>BMB</td><td>11034731001</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III Reverse Transcriptase</td><td>Invitrogen</td><td>56575</td><td>in kit (18080-044) comes with first strand buffer (Y02321) and DTT</td></tr><tr><td>MEGAclear Kit</td><td>Ambion</td><td>1908</td><td></td></tr><tr><td>MinElute Reaction Cleanup Kit</td><td>Qiagen</td><td>28206</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA polymerase</td><td>Invitrogen</td><td>100004994</td><td></td></tr><tr><td>Rnasin</td><td>Promega Corp.</td><td>N251B</td><td></td></tr><tr><td>Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit</td><td>Ambion</td><td>AMIL1791</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown micropipette puller</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-87</td><td>Sutter has many other models, many are discussed in the cookbook</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>Many other micromanipulators will work such as the newer Eppendorf models</td></tr><tr><td>Pipette Holder</td><td>Warner Instruments</td><td>MP-S15A</td><td>Will vary with micromanipulator and pipette O.D.</td></tr><tr><td>Bioanalyzer RNA 6000 Nano Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td></td></tr></tbody></table>

transcriptome analysis of single cells

多くの遺伝子発現解析の技術は文化の組織ホモジネートまたは細胞からの細胞の不均一な集団から分離された材料に依存している。1,2,3の脳の場合には、このような海馬などの領域はそれぞれに、異なる細胞型の複雑な配置が含まれています異なるmRNAプロファイル。単一の細胞を回収する能力は、細胞集団間および内の分子の違いに綿密な調査で、より可能になります。我々は、さらなる処理のために細胞を採取するための簡便かつ迅速な方法を説明します。多くの場合、電気生理学で使用されているピペットは（誤嚥を使用して）目的の細胞を分離し、便利な分子生物学的手法の任意の数のさらなる処理のためのエッペンドルフチュー​​ブに、それを堆積させるために利用されています。我々のプロトコルは、細胞培養または急性スライスからさらには個々の細胞からの樹状突起の収穫に変更することができます。 我々はまた、単一のセルのアイソレーションの主要な下流のアプリケーションとしてaRNAの増幅法を説明します。このメソッドは、逆転写反応またはリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（PCR）などの他の遺伝子発現解析の手法に代わるものとして私たちの研究室で以前に開発されました。4,5,6,7,8この手法ではのリニア増幅を提供するポリアデニル化RNAは、材料の唯一のフェムトグラムから始まり、アンチセンスRNAのマイクログラム量で生じる。直線的に増幅された材料は、単離細胞のトランスクリプトームの成分の相対量のPCRの指数増幅よりも正確な推定を提供します。基本的な手順は、増幅の二回で構成されています。簡単に言うと、T7 RNAポリメラーゼプロモーターのサイトは、mRNA転写物から作成された二本鎖cDNAに組み込まれています。 in vitro転写一晩（IVT）反応は、T7 RNAポリメラーゼは、二本鎖cDNAから多くのアンチセンス転写産物を生成する実行されます。第二ラウンドでは、このプロセスを繰り返しますが、出発原料からいくつかの技術的な違いがアンチセンスRNAである。それは、増幅の3つのラウンドで、その結果、第二ラウンドを繰り返すことが標準です。多くの場合、in vitro転写反応の第三ラウンドは、生成されたアンチセンスRNAをハイブリダイズし、マイクロアレイで検出することができるようにビオチン化ヌクレオシド三リン酸を使用して実行されます。7,8

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Transcriptome Analysis of Single Cells

この記事では、ラット初代ニューロン培養とaRNAの増幅を使用して、その後のトランスクリプトーム解析から単一細胞の収穫のための簡単​​な方法を説明します。このアプローチは、任意の細胞型への一般化です。

単一細胞のトランスクリプトーム解析

Many gene expression analysis techniques rely on material isolated from heterogeneous populations of cells from tissue homogenates or cells in ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

29.7K ビュー.  University of Pennsylvania. この記事では、ラット初代ニューロン培養とaRNAの増幅を使用して、その後のトランスクリプトーム解析から単一細胞の収穫のための簡単​​な方法を説明します。このアプローチは、任意の細胞型への一般化です。

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Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those populations. Single-cell gene expression measurements can help assess the role of noise in gene expression, identify correlations in the expression of pairs of genes, and reveal subpopulations of cells that respond differently to a stimulus. Here, we describe a procedure to measure the expression of up to 96 genes in single mammalian cells isolated from a population growing in tissue culture. Cells are sorted into lysis buffer by fluorescence-activated cell sorting (FACS), and the mRNA species of interest are reverse-transcribed and amplified. Gene expression is then measured using a microfluidic real-time PCR machine, which performs up to 96 qPCR assays on up to 96 samples at a time. We also describe the generation and use of PCR amplicon standards to enable the estimation of the absolute number of each transcript. Compared with other methods of measuring gene expression in single cells, this approach allows for the quantification of more distinct transcripts than RNA FISH at a lower cost than RNA-Seq.

We describe a method to sort single mammalian cells and to quantify the expression of up to 96 target genes of interest in each cell. This method includes the use of internal qPCR standards to enable the estimation of absolute transcript counts.

内部標準でFACSおよび定量PCRを用いた単一細胞遺伝子発現プロファイリング

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

遺伝学

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is inherently a single-cell assay, however prior to molecular analysis, the target cells are often prospectively isolated in bulk, thereby losing single-cell resolution. Single-cell gene expression analysis provides a means to understand molecular differences between individual cells in heterogeneous cell populations. In bulk cell analysis an overrepresentation of a distinct cell type results in biases and occlusions of signals from rare cells with biological importance. By utilizing FACS index sorting coupled to single-cell gene expression analysis, populations can be investigated without the loss of single-cell resolution while cells with intermediate cell surface marker expression are also captured, enabling evaluation of the relevance of continuous surface marker expression. Here, we describe an approach that combines single-cell reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) and FACS index sorting to simultaneously characterize the molecular and immunophenotypic heterogeneity within cell populations.
In contrast to single-cell RNA sequencing methods, the use of qPCR with specific target amplification allows for robust measurements of low-abundance transcripts with fewer dropouts, while it is not confounded by issues related to cell-to-cell variations in read depth. Moreover, by directly index-sorting single-cells into lysis buffer this method, allows for cDNA synthesis and specific target pre-amplification to be performed in one step as well as for correlation of subsequently derived molecular signatures with cell surface marker expression. The described approach has been developed to investigate hematopoietic single-cells, but have also been used successfully on other cell types.
In conclusion, the approach described herein allows for sensitive measurement of mRNA expression for a panel of pre-selected genes with the possibility to develop protocols for subsequent prospective isolation of molecularly distinct subpopulations.

Bulk gene expression measurements cloud individual cell differences in heterogeneous cell populations. Here, we describe a protocol for how single-cell gene expression analysis and index sorting by Florescence Activated Cell Sorting (FACS) can be combined to delineate heterogeneity and immunophenotypically characterize molecularly distinct cell populations.

組合せの単一セルは分子を特徴付ける方法・肺浸潤異質性ひと幹と前駆細胞集団

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

Combining Laser Capture Microdissection and Microfluidic qPCR to Analyze Transcriptional Profiles of Single Cells: A Systems Biology Approach to Opioid Dependence

Profound transcriptional heterogeneity in anatomically adjacent single cells suggests that robust tissue functionality may be achieved by cellular phenotype diversity. Single-cell experiments investigating the network dynamics of biological systems demonstrate cellular and tissue responses to various conditions at biologically meaningful resolution. Herein, we explain our methods for gathering single cells from anatomically specific locations and accurately measuring a subset of their gene expression profiles. We combine laser capture microdissection (LCM) with microfluidic reverse transcription quantitative polymerase chain reactions (RT-qPCR). We also use this microfluidic RT-qPCR platform to measure the microbial abundance of gut contents.

This protocol explains how to collect single neurons, microglia, and astrocytes from the central nucleus of the amygdala with high accuracy and anatomic specificity using laser capture microdissection. Additionally, we explain our use of microfluidic RT-qPCR to measure a subset of the transcriptome of these cells.

レーザーキャプチャー微小解剖とマイクロ流体qPCRを組み合わせて単一細胞の転写プロファイルを解析する:オピオイド依存へのシステム生物学アプローチ

Profound transcriptional heterogeneity in anatomically adjacent single cells suggests that robust tissue functionality may be achieved by cellular ...

Isolation of Adipose Tissue Nuclei for Single-Cell Genomic Applications

Brown and beige fat are specialized adipose tissues that dissipate energy for thermogenesis by UCP1 (Uncoupling Protein-1)-dependent and independent pathways. Until recently, thermogenic adipocytes were considered a homogeneous population. However, recent studies have indicated that there are multiple subtypes or subpopulations that are distinct in developmental origin, substrate use, and transcriptome. Despite advances in single-cell genomics, unbiased decomposition of adipose tissues into cellular subtypes has been challenging because of the fragile nature of lipid-filled adipocytes. The protocol presented was developed to circumvent these obstacles by effective isolation of single nuclei from adipose tissue for downstream applications, including RNA sequencing. Cellular heterogeneity can then be analyzed by RNA sequencing and bioinformatic analyses.

This publication describes a protocol for the isolation of nuclei from mature adipocytes, purification by fluorescence-activated sorting, and single-cell level transcriptomics.

単細胞ゲノムアプリケーションのための脂肪組織核の分離

Brown and beige fat are specialized adipose tissues that dissipate energy for thermogenesis by UCP1 (Uncoupling Protein-1)-dependent and independent ...

An Approach to Study Shape-Dependent Transcriptomics at a Single Cell Level

Different types of cardiac hypertrophy have been associated with an increased volume of cardiac myocytes (CMs), along with changes in CM morphology. While the effects of cell volume on gene expression are well known, the effects of cell shape are not well understood. This paper describes a method that has been designed to systematically analyze the effects of CM morphology on gene expression. It details the development of a novel single-cell trapping strategy that is then followed by single-cell mRNA sequencing. A micropatterned chip has also been designed, which contains 3000 rectangular-shaped fibronectin micropatterns. This makes it possible to grow CMs in distinct length:width aspect ratios (AR), corresponding to different types of heart failure (HF). The paper also describes a protocol that has been designed to pick up single cells from their pattern, using a semi-automated micro-pipetting cell picker, and individually inject them into a separate lysis buffer. This has made it possible to profile the transcriptomes of single CMs with defined geometrical morphotypes and characterize them according to a range of normal or pathological conditions: hypertrophic cardiomyopathy (HCM) or afterload/concentric versus dilated cardiomyopathy (DCM) or preload/eccentric. In summary, this paper presents methods for growing CMs with different shapes, which represent different pathologies, and sorting these adherent CMs based on their morphology at a single-cell level. The proposed platform provides a novel approach to high throughput and drug screening for different types of HF.

This paper presents methods for growing cardiac myocytes with different shapes, which represent different pathologies, and sorting these adherent cardiac myocytes based on their morphology at a single cell level. The proposed platform provides a novel approach to high throughput and drug screening for different types of heart failure.

単一細胞レベルでの形状依存性転写論の研究方法

Different types of cardiac hypertrophy have been associated with an increased volume of cardiac myocytes (CMs), along with changes in CM morphology. While ...

Reusable Single Cell for Iterative Epigenomic Analyses

Current single-cell epigenome analyses are designed for single use. The cell is discarded after a single use, preventing analysis of multiple epigenetic marks in a single cell and requiring data from other cells to distinguish signal from experimental background noise in a single cell. This paper describes a method to reuse the same single cell for iterative epigenomic analyses. 
In this experimental method, cellular proteins are first anchored to a polyacrylamide polymer instead of crosslinking them to protein and DNA, alleviating structural bias. This critical step allows repeated experiments with the same single cell. Next, a random primer with a scaffold sequence for proximity ligation is annealed to the genomic DNA, and the genomic sequence is added to the primer by extension using a DNA polymerase. Subsequently, an antibody against an epigenetic marker and control IgG, each labeled with different DNA probes, are bound to the respective targets in the same single cell. 
Proximity ligation is induced between the random primer and the antibody by adding a connector DNA with complementary sequences to the scaffold sequence of the random primer and the antibody-DNA probe. This approach integrates antibody information and nearby genome sequences in a single DNA product of proximity ligation. By enabling repeated experiments with the same single cell, this method allows an increase in data density from a rare cell and statistical analysis using only IgG and antibody data from the same cell. The reusable single cells prepared by this method can be stored for at least a few months and reused later to broaden epigenetic characterization and increase data density. This method provides flexibility to researchers and their projects.

The present protocol describes a single-cell method for iterative epigenomic analyses using a reusable single cell. The reusable single cell allows analyses of multiple epigenetic marks in the same single cell and statistical validation of the results.

反復エピゲノム解析のための再利用可能な単一細胞

Current single-cell epigenome analyses are designed for single use. The cell is discarded after a single use, preventing analysis of multiple epigenetic ...

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental biology. It has been successfully used to identify rare cell populations, discover novel marker genes, and decode spatial and temporal developmental information. The single cell method has also evolved from the microfluidic based Fluidigm C1 technology to the droplet-based solutions in the last two to three years. Here we used the heart as an example to demonstrate how to profile the mouse embryonic tissue cells using the droplet based scRNA-Seq method. In addition, we have integrated two strategies into the workflow to profile multiple samples in a single experiment. Using one of the integrated methods, we have simultaneously profiled more than 9,000 cells from eight heart samples. These methods will be valuable to the developmental biology field by providing a cost-effective way to simultaneously profile single cells from different genetic backgrounds, developmental stages, or anatomical locations.

Here we presented a multiplexed single cell mRNA sequencing method to profile gene expression in mouse embryonic tissues. The droplet-based single cell mRNA sequencing (scRNA-Seq) method in combination with multiplexing strategies can profile single cells from multiple samples simultaneously, which significantly reduces reagent costs and minimizes experimental batch effects.

マウス胚細胞の多重化単細胞mRNAシーケンシング解析

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental ...

発生生物学

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in vivo is of importance. Pol II kinetics have been measured using biochemical or molecular methods.1-3 In recent years, with the development of new visualization methods, it has become possible to follow transcription as it occurs in real time in single living cells.4 Herein we describe how to perform analysis of Pol II elongation kinetics on a specific gene in living cells.5, 6 Using a cell line in which a specific gene locus (DNA), its mRNA product, and the final protein product can be fluorescently labeled and visualized in vivo, it is possible to detect the actual transcription of mRNAs on the gene of interest.7, 8 The mRNA is fluorescently tagged using the MS2 system for tagging mRNAs in vivo, where the 3'UTR of the mRNA transcripts contain 24 MS2 stem-loop repeats, which provide highly specific binding sites for the YFP-MS2 coat protein that labels the mRNA as it is transcribed.9 To monitor the kinetics of transcription we use the Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) method. By photobleaching the YFP-MS2-tagged nascent transcripts at the site of transcription and then following the recovery of this signal over time, we obtain the synthesis rate of the newly made mRNAs.5 In other words, YFP-MS2 fluorescence recovery reflects the generation of new MS2 stem-loops in the nascent transcripts and their binding by fluorescent free YFP-MS2 molecules entering from the surrounding nucleoplasm. The FRAP recovery curves are then analyzed using mathematical mechanistic models formalized by a series of differential equations, in order to retrieve the kinetic time parameters of transcription.

RNA polymerase II transcriptional kinetics are measured on specific genes in living cells. mRNAs transcribed from the gene of interest are fluorescently tagged and using Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) the in vivo kinetics of transcriptional elongation are obtained.

単一生細胞におけるmRNAの転写の動態を測定

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

生物学

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

定量的RT-PCRによって個々のヒト胚性幹細胞のプロファイリング

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Droplet Barcoding-Based Single Cell Transcriptomics of Adult Mammalian Tissues

The analysis of single cell gene expression across thousands of individual cells within a tissue or microenvironment is a valuable tool for identifying cell composition, discrimination of functional states, and molecular pathways underlying observed tissue functions and animal behaviors. However, the isolation of intact, healthy single cells from adult mammalian tissues for subsequent downstream single cell molecular analysis can be challenging. This protocol describes the general processes and quality control checks necessary to obtain high-quality adult single cell preparations from the nervous system or skin that enabled subsequent unbiased single cell RNA sequencing and analysis. Guidelines for downstream bioinformatic analysis are also provided.

This protocol describes the general processes and quality control checks necessary for preparing healthy adult mammalian single cells for droplet-based, high throughput single cell RNA-Seq preparations. Sequencing parameters, read alignment, and downstream single-cell bioinformatic analysis are also provided.

哺乳類の成体の液滴バーコード ベースの単一細胞トランスクリプトーム

The analysis of single cell gene expression across thousands of individual cells within a tissue or microenvironment is a valuable tool for identifying ...

単一細胞のトランスクリプトーム解析

要約

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内部標準でFACSおよび定量PCRを用いた単一細胞遺伝子発現プロファイリング

組合せの単一セルは分子を特徴付ける方法・肺浸潤異質性ひと幹と前駆細胞集団

レーザーキャプチャー微小解剖とマイクロ流体qPCRを組み合わせて単一細胞の転写プロファイルを解析する:オピオイド依存へのシステム生物学アプローチ

単細胞ゲノムアプリケーションのための脂肪組織核の分離

単一細胞レベルでの形状依存性転写論の研究方法

反復エピゲノム解析のための再利用可能な単一細胞

マウス胚細胞の多重化単細胞mRNAシーケンシング解析

単一生細胞におけるmRNAの転写の動態を測定

定量的RT-PCRによって個々のヒト胚性幹細胞のプロファイリング

哺乳類の成体の液滴バーコードベースの単一細胞トランスクリプトーム

単一細胞のトランスクリプトーム解析

要約

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内部標準でFACSおよび定量PCRを用いた単一細胞遺伝子発現プロファイリング

組合せの単一セルは分子を特徴付ける方法・肺浸潤異質性ひと幹と前駆細胞集団

レーザーキャプチャー微小解剖とマイクロ流体qPCRを組み合わせて単一細胞の転写プロファイルを解析する:オピオイド依存へのシステム生物学アプローチ

単細胞ゲノムアプリケーションのための脂肪組織核の分離

単一細胞レベルでの形状依存性転写論の研究方法

反復エピゲノム解析のための再利用可能な単一細胞

マウス胚細胞の多重化単細胞mRNAシーケンシング解析

単一生細胞におけるmRNAの転写の動態を測定

定量的RT-PCRによって個々のヒト胚性幹細胞のプロファイリング

哺乳類の成体の液滴バーコード ベースの単一細胞トランスクリプトーム

哺乳類の成体の液滴バーコードベースの単一細胞トランスクリプトーム