我々の技術は、インビボ炎症状態における肺蓄積ヒト免疫細胞の正確なイメージングを可能にし、T細胞肺ホーミングのプロセスに関するエキサイティングな洞察を提供する。このプロトコルは、T細胞肺ホーミングに関する翻訳研究をサポートし、それによって炎症性またはアレルギー性肺疾患の最適化された治療のための新しい標的の同定に役立つかもしれない。特に、T細胞肺ホーミングに対する疾患特異的免疫細胞特性、肺組織組織、および炎症性ミリューの影響を考慮する能力は、この方法を非常に有利にする。
全体的に見て、我々の技術は、多くの場合、活性化免疫細胞の圧倒的な組織蓄積によって駆動される慢性炎症性肺疾患の分野で免疫学的研究のために高い価値があります。少なくとも16グラム、6週齢、麻酔付きC57黒6Jマウスでつま先ピンチへの応答の欠如を確認した後、マイクロピペットを使用して、調製したパパイン溶液10マイクロリットルを1日1回連続で1回連続でマウスの1つの鼻孔にゆっくりと送達する。最後のパパイン投与の翌日、ヒト末梢血下のFicoll培地の層10ミリリットルは、遠心分離による密度勾配分離のためにPBSで1〜2の比率で事前希釈された健康なボランティアからである。
末梢単核血球またはPBMC相間層を新しい50ミリリットルチューブに移し、遠心分離によって細胞を採取する。次に、メーカーのプロトコルに従ってCD4陽性細胞の磁気マイクロビーズ分離を行います。ビーズ単離CD4陽性T細胞を、PBS濃度の少なくとも500マイクロリットル当たり最大10倍から7番目のT細胞で再懸濁した。
37°Cで10分間、適切な赤色光励起細胞増殖色素を細胞にラベル付けします。インキュベーションの終わりに、氷の上で5分間10%FBSを補充した5巻のRPMI培地で標識反応を逮捕し、続いて培地で3回のスリングを行う。ヒトCD4陽性T細胞をパパイン暴露されたレシピエントマウスに養子に移す場合、 蛍光標識されたT細胞をPBSのミリリットル濃度当たり7番目の細胞に1回10回再中断し、100マイクロリットルの細胞をレシピエント動物1匹あたり30ゲージの針を備えた1ミリリットルの注射器にロードし、1つのシリンジから細胞の全容を尾静脈に注入する細胞懸濁液の排出を防止するために細胞送達の5秒後。
養子細胞転移の3時間後、各安楽死マウスの右心室をカテーテルに接続した21ゲージカニューレで穿刺し、左心室に切開する。5ミリモルEDTAを補った20ミリリットルの氷冷PBSと肺をゆっくりと浸透させ、続いて2ミリリットルの氷冷4%パラホルムアルデヒドを加える。すべての固定剤が組織を通して洗い流されたら、唾液腺を取り除き、胸部ヒョイド筋肉を切断して、気管の下で鉗子を滑らせてエアチューブ組織を露出させる。
露出した気管の最初の穿刺を30ゲージ針で行ってから、針を鈍い30ゲージのカテーテルに置き換えて、組織へのさらなる損傷を防ぎます。針ホルダーを使用して挿入されたカテーテルと気管の間の接合部を密封し、肺の完全な展開まで約37°C0.75%アガロースで気道を慎重に満たします。カテーテルと気管の間の緊密な接合は、肺を生理学的な大きさに拡大し、イメージングのための組織アーキテクチャを維持するために重要である。
アガロースが完全に固まったら、カテーテルを取り外し、4%パラホルデドエで満たされた暗い2ミリリットルのチューブに肺を慎重に移します。次に、連続的な回転の下で連続的なエタノールインキュベーションで組織を脱水し、毎分31回転、摂氏4度で、インキュベーションごとに4時間示した。完全な脱水後、サンプルをエチルシンナメートに移し、組織が半透明になるまで室温で一晩インキュベートします。
光シート蛍光顕微鏡では、有機溶剤の安定した接着剤を少量使用して、肺を顕微鏡のサンプルホルダーに貼り付け、肺ローブを直立した位置にホルダーにセットします。サンプルホルダーをチャンバーに入れ、計器ソフトウェアで実験に適したレーザーを選択します。次に、光学の下のスライダーを使用して、オルガン全体または関心のある特定のセクションを均一に明らかにするシート幅を設定します。
スライダーを使用して、選択したレーザーごとにレーザー伝送制御下のレーザー強度を設定し、[適用]をクリックします。[高度な測定設定] を使用して、左右のライト シートを結合して、均質に照らされたイメージを作成します。スキャン範囲で測定するZスタックの開始位置と終了位置を定義し、ステップサイズを5マイクロメートルに設定してから、自動保存を選択してファイルを自動的に保存し、画像をキャプチャするための測定を開始します。
すべての画像が取得されたら、3Dポストイメージング解析ソフトウェアで「卓越」ボタンをアクティブにし、1つのZスタックから最初の画像をロードして、選択したZスタックの他のすべての画像の開く3D再構成と自動3D再構成を開始し、[表示調整]で各チャンネルの強度、黒レベル、コントラストを調整します。異なるサンプル間で肺組織内のヒト細胞の蓄積を比較するには、[編集]および[3D をトリミング]を選択して、特定のボリュームを持つ肺立方体を定義します。定義された肺立方体内のラベル付きセルを定量化するには、ツールバーの「新しいスポットを追加」を開き、「自動作成をスキップして手動で編集」をクリックし、640 ナノメートル・チャネルを選択します。
半径スケールを 10.00 ミクロンに設定し、[選択] をクリックし、[編集] の下でマウスの左ボタンをクリックして各蛍光セルをドットで個別にマークします。カウントされたセルの総数が統計に表示されます。画像をキャプチャするには、スナップショット ツールを使用するか、アニメーション ツールを使用してビデオをキャプチャします。
微生物ベースの細胞濃縮およびそれに続く蛍光標識は、典型的には、少なくとも95%のCD4陽性純度とフローサイトメトリーによって決定されるこれらの細胞の正常な標識をもたらす。エチルシンナメートベースの組織クリアリングは、屈折率のマッチングが成功したことを示す高レベルの臓器透明化を達成する。肺組織の自動蛍光シグナルは、平均強度投影または表面モードで表示することができる光シート顕微鏡検査によって肺の解剖学的構造を画像化するのに役立つツールを提供する。
従来の顕微鏡法と比較して、光シート顕微鏡法は、全臓器イメージングとその後の3D再構成の利点を提供し、色素標識された増殖の同定および可視化を可能にし、全器官の文脈でヒトT細胞を移し、さらに、パパイン暴露動物の炎症肺組織内で選択的蓄積するために移されたヒトT細胞の好みは、ヒトCD4陽性細胞が腸管内のレシピエントから取得することができないという事実によってさらに支持される。異なる条件間のヒトCD4陽性T細胞の肺蓄積の定量および比較のために、標識された細胞はまた、実証されるように定義された体積のいくつかの肺キューブで数えることができる。肺灌流、膨張、組織のクリアリングを含む慎重な組織調製は、高解像度の光シート顕微鏡画像の最適化された生成のために非常に重要です。
さらに、移されたヒトリンパ球のダイアペデスが成功したことを確認するために、このプロトコルは、マウス気管支肺胞洗浄体内のヒトリンパ球のフロー細胞量測定と容易に組み合わせることができる。生体内の状態で個々の患者から誘導された免疫細胞を監視する能力は、特定の疾患または治療によって刻印された免疫細胞における機能的変化の同定をサポートする。
