我々は科学的な議論、提案、およびコメントのローゼンブラットの研究室のメンバーに感謝。 GFPトランスジェニックゼブラフィッシュ：我々はまた、親切にCKを提供するをコードするプラスミドRFP - UtrCHとデビッドグルンワルドを提供メアリーハロランに感謝したいと思います。また、グレッチェン王とゼブラフィッシュの優れたメンテナンスとケアのためのユタ大学の集中化ゼブラフィッシュのリソースのスタッフのおかげ。この作品は、JRへOD002056 - 01 DP2 NIH - NIGMS NIHのディレクターの新イノベーター賞1でサポートされていました。 GTEは、NIH集学的がん研修プログラムグラント5T32 CA03247 - 8によってサポートされていました。

ゼブラフィッシュの開発の表皮の細胞の押出中にアクチンダイナミクスの可視化のための基本的なワークフロー開発ゼブラフィッシュの表皮は、2つの別個の層、表面層（または周皮）と基底膜2を連絡し、細胞の基底層で構成されています。外側の表面層の細胞がアポトーシスを起こすと押し出し3（図1）によって組織から排除されています。リアルタイムでこのプロセスを視覚化するために、我々は緑色蛍光タンパク質（GFPを発現している1細胞期トランスジェニックゼブラフィッシュにユートロフィン、アクチン結合タンパク質（RFP - UtrCH）4,5、のカルポニン相同ドメインに融合されたRNAエンコーディング赤色蛍光タンパク質を注入する）層化上皮プロモーターサイトケラチン8 6（図2A）の下で。 RFP - UtrCHが普遍的にRNAを注入した後、動物で表現されていますが、我々は、RFPとGFPの両方が表皮（図2B）に特異的にアクチンのダイナミクスに従うことを表現する表層上皮細胞に焦点を当てる。私たちは、その後アポトーシス細胞の押し出しと画像回転するディスク共焦点顕微鏡を用いて表皮とアクチンフィラメントを誘導し、4Dのデータセットを取得するためにG418と幼虫を扱う。 事前に実験を開始<ol><li> in vitroで mMessage mMachine SP6キット（Ambion社）を用いて線状化DNAテンプレートからRNAの転写とRNeasyミニキット（キアゲン）を用いてキャップRNAを精製する。滅菌水を用いて〜60ng/ulにRNAを希釈し、注入直前まで-80℃で3 -5μlのアリコートと店舗° Cを作る。注意：繰り返しの凍結/ RNAの分解を防ぐために、融解は避けてください。 </li><li> 100 × 15ミリメートル培養プレートにE3胚の培地に2％アガロース（E3）の40mlのを注ぐと、このトレイにマイクロインジェクション金型（適応科学のツール、＃I - 34）を配置することにより、注入中に胚を保持するために金型を作る。アガロースが固化した後、アガロースで谷を公開するために金型を削除します。 4使用するため° Cまでの準備でプレートを保管してください。 </li><li>フィラメント（OD 1.0ミリメートル、ID 0.78、10cmの長さ）と、以下の設定（耐熱485、プル50、速度60、ディレイ/時間90、圧力200サターP - 97ピペットプラーとホウケイ酸ガラスを使用して注入するためのキャピラリー針を引っ張る）。注：異なる種類のガラスのは、記載されている条件の最適化が必要になります。 </li><li> 42℃でE3と店舗1mLのアリコートの1％を構成する低融点（LM）アガロース℃に株式からE3の蒸発は、アガロースの濃度を増加させることができるように注意してください。 </li><li>光/ 14時間の光と闇7の10時間の明暗サイクル定期的に、標準的な実験室条件下で大人のゼブラフィッシュを維持する。実験前の夜は、分周器によって分離槽で3メスと男性2名を配置することによって、相手に魚をセットアップする。翌朝、タンク内の水を変更し、ランプが点灯時に分周器を引き出します。 </li></ol> 1。蛍光標識アクチン結合蛋白質をコードするRNAの注入<ol><li>氷の上でRNAを解凍。 〜30ng/μlの最終的なRNA濃度のための1:1の比率でRNAを0.5％フェノールレッドを追加し、埋め戻しによって引っ張らキャピラリー針に1μlのソリューションを読み込みます。 </li><li> E3でのGFPの胚：〜75 1セルのステージ8 CKを収集する。ピペットFSTデュモン＃5は鉗子とトラフの胚5でマイクロインジェクションの金型内に胚を採取した¾パスツールピペットと優しく向き。注：注入したRNAのモザイクの発現をもたらすことができる多細胞期の胚、に注入避けるために、迅速に動作するように注意してください。 </li><li>標準的な実験解剖実体顕微鏡下で、圧力制御マイクロインジェクター（ハーバード装置PLI - 100ピコインジェクター）を使用して、胚の卵黄にRNAを注入する。赤いスポット（フェノールレッド）は、注入後の胚に見えるはずです。各実験のために少なくとも50胚を注入する。 （ゼブラフィッシュの胚9にRNAの注入についての詳細なプロトコルのための以前のJoveのプロトコルを参照してください）。注： <ol type="A"><li> 〜2nlの体積は、1細胞期胚にRNAの注入に使用する必要があります。注入されたRNAの量を決定するために、較正されたマイクロメータのスライド上にミネラルオイルを一滴にまたは接眼レンズに組み込まれたスケールバーと顕微鏡下でRNAのボーラスを分注する。 RNAの液滴は完全な球体にする必要があります。ボリューム（NLで）=4/3πr3：式を使用して配信量を計算します。楽器の射出圧力や時刻を変更して納入音量を調整します。 </li><li>ケアはまた、RNAの高濃度は胚発生に有害であることができるとして、蛍光体の可視化を可能にするRNAの最小量を注入するために注意が必要です。適切な発現レベルを決定するために、用量曲線の実験は、実験を実行する前に実行する必要があります。&lt;/ LI&gt; </ol></li><li>任意の未受精卵または破損した卵を削除し、28.5で、残りのすべての胚を配置するために胚をソート℃に</li><li> 24時間後、GFP（表皮）とRFP（アクチン）蛍光の高いレベルを持っているゼブラフィッシュ胚を選択するために蛍光解剖顕微鏡を使用してください。 28.5で選択された胚を置きます° Cアポトーシスを誘導する薬物治療を続行する準備が整うまで。 </li></ol> 2。 G418を使用してゼブラフィッシュ幼生におけるセル押出の誘導我々は、アミノグリコシド系抗生物質G418、またはジェネティシン、への暴露が未知の機構により、ゼブラフィッシュの幼虫3を開発中のアポトーシスと表皮細胞の押し出しを引き起こすことを発見した。重要なのは、この治療法は、わずか4日後の受精と古い幼虫で動作します。我々は、〜5月25日細胞はG418治療幼虫のゼブラフィッシュの上皮フィンから任意の時点で押し出し見つけることができることがわかります。アポトーシス押し出し細胞の量は魚から魚へのさまざまな種類があるため、我々は、イメージングのための複数の魚を取り付けることをお勧めします。 <ol><li>収集し、4日後の受精（DPF）E3の3ミリリットル（MLS）を含む、35 × 10mmの培養皿にGFPとRFPの蛍光の両方を示すゼブラフィッシュの幼虫を置く。一つは、このサイズの培養皿で25幼虫まで扱うことができます。 </li><li>慎重に28.5℃で4時間薬でG418とインキュベート幼虫のE3を含む1mg/mLの3mLsでメディアを交換G418は、敏感な光であることに注意してくださいので、カバーや暗所で培養皿を維持するように注意してください。 </li><li>メディアを取り出し、0.02％Tricaineを含む予め温めておいた28.5 ° C E3メディアと交換して、幼虫を取り付けに進みます。 </li></ol> 3。イメージング用取付ゼブラフィッシュの幼虫<ol><li> 1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブに3幼虫を移し、チューブの底に魚のシンク後のE3の大部分を取り除く。我々は、アガロースが固化する前に、最大3匹までが適切にマウントすることができることを見出した。 </li><li>その後、チューブ、ミックス、そして静かにピペットマテックの培養皿の底にカバーガラス上に幼虫とアガロース混合物に、1％LM -アガロース（42 ° C）のピペット120ulをカットしたピペットチップを使用する。 </li><li>オリエント迅速に、幼虫を添付インサートピンまたはタングステン針とFSTピンホルダーを使用して、彼らはストレートとマテック皿のカバーガラスに対して平らになるように。 注：私たちは通常、試料への損傷を防ぎながら、彼らがカバーガラスに対して平らになるように、最初の向き幼虫とし、L字型のピンに直接ピンを使用する。 </li><li>アガロースが固化した後、静かに0.02パーセントTricaineを含むE3で皿を埋める。注：別の方法として、G418は1mg/mL G418への長期暴露は、幼虫を殺すだろうが、誘導の押し出しを継続するイメージング皿の中でE3に追加することができます。 </li></ol> 4。回転するディスク共焦点顕微鏡を用いてセルの押出中にアクチンダイナミクスと個々の上皮細胞の挙動のイメージングを生きる我々は、ゼブラフィッシュの幼虫を開発するの表皮からアポトーシス細胞の押出のプロセス全体が約20分3を取ることを発見した。ここでは、押出プロセスを可視化するためにゼブラフィッシュ表皮の単層を介してのz平面のシリーズを収集するタイムラプスイメージングの実験をセットアップする方法を示します。我々は典型的な広視野蛍光顕微鏡は、アクチンフィラメントの著しい退色を引き起こすことを発見したとタイムラプスイメージングのために許可されていません。したがって、私たちの分解能を最大化し、退色を防止するため、我々は、回転するディスク共焦点顕微鏡を使用してください。以下に我々は、説明した原理は同じような顕微鏡のセットアップに適用することができますが、ニコンの顕微鏡でアンドールのIQのソフトウェアを使用して実験をセットアップする方法について説明します。 <ol><li>最初に、アルゴン（488nmのでGFPの励起用）とヘリウムネオン（561nmにおけるRFPの励起のための）レーザー、顕微鏡、カメラと落射蛍光ランプをオンにします。 </li><li>アンドールIQのソフトウェア（バージョン1.10.1）の中で、、画像のキャプチャとキャプチャを繰り返すことが必要数時間の間の間隔の周波数を画像にしたいの波長を含む時系列のプロトコルを作成します。 </li><li>ゆっくりと顕微鏡ステージ上に試料を含むマテック皿を置いて、幼虫に焦点を透過光で20倍対物レンズを使用してください。 </li><li>正しい位置に40X水浸対物レンズ（NA 0.8）に移動します。この目標を使用して、我々はまた、サブセルラーアクチンのダイナミクスを解決しているときに私たちは押出中に細胞の挙動を追跡することができるフィールドあたり約20〜25細胞を、フィルムができます。注：同じ取り付けと長い作動距離を持つ40X水浸対物レンズを使用する必要がありますが、イメージング戦略は、直立顕微鏡に適用することができます。 </li><li>慎重に40倍対物レンズの上に水滴を置いて、すぐに上にマテック皿を置きます。ないE：水の蒸発が問題となる場合ツァイスImmersolの浸液を使用することもできます。 </li><li>相またはDIC照明を使用して試料を識別し、GFP陽性表皮に特に焦点を当てる488nmの落射蛍光を使用してください。 </li><li>走査型共焦点モードに切り替えます。それに応じてチャネル（488nmのと561nm）のそれぞれのためのレーザー強度と露光時間を調整します。あなたの信号の最適な検出のために露出のレーザーパワーと時間のバランスをとるために、任意の光退色や毒性を防ぐために注意してください。 </li><li>細胞を押し出す識別するには、表皮というラベルのGFPを視覚化し、中央の小円形細胞を周囲の細胞の集まりで構成される、古典的なロゼットパターンのセルのグループを識別するために、落射蛍光使用。走査型共焦点モードを使用して、また中央の小円形細胞、細胞の押し出しの特徴の周りのリングのような目に見えるRFPで標識したアクチンの蓄積があるはずです。したらすぐに4D（XYZタイム）共焦点のデータセットを取得するために顕微鏡を設定、押し出し細胞を同定した。 </li><li>押し出し細胞を含む表皮の単層を、視覚化、およびステップサイズを選択するにはz平面内で上下のポイントを設定します。タイムラプスイメージングのために、繰り返しのイメージのキャプチャおよび番号の間隔を設定します。例えば、我々は、通常、1μmのステップサイズ、30分毎に1〜2分で、5 -10μmのをスパニングZ -シリーズを取得する。 </li><li>データを表示するには、我々は通常、Zシリーズの3次元投影を作成し、クイックタイム（アップル）と互換性のあるムービーファイルとしてデータセットを保存します。このように、我々はアクチンリングと時間をかけて死ぬ細胞の周囲に発生する上皮行動の収縮を視覚化することができます。 </li></ol> 5。代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/2689/2689fig1.jpg" alt="図1"/> 図1。アポトーシス細胞の押し出しの回路図。アクチンフィラメントは赤で表示され、GFP陽性上皮細胞は緑色です。 <img src="/files/ftp_upload/2689/2689fig2.jpg" alt="図2"/> 図2。実験的なワークフロー。実験のためのワークフローのA.の回路図。B。 4dpf CKの表皮におけるRFP - UtrCHの発現：GFPゼブラフィッシュ。 <img src="/files/ftp_upload/2689/2689fig3.jpg" alt="図3"/> 図3。スティル上皮細胞の押出成形の過程でライブアクチンダイナミクスを以下のタイムラプスビデオからのフレーム（Z -突起）。矢印は、2分かけて収縮すると閉じます隣接する細胞によって形成されるアクチンのリングを示す。

<ol>
	<li>Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+epithelial+cell+destined+for+apoptosis+signals+its+neighbors+to+extrude+it+by+an+actin-+and+myosin-dependent+mechanism.">An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism.</a> Curr Biol. 11, 1847-1857 (2001).</li><li>Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+development+in+bony+fish+with+particular+emphasis+on+collagen+deposition+in+the+dermis+of+the+zebrafish+(Danio+rerio).">Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio).</a> Int J Dev Biol. 48, 217-231 (2004).</li><li>Slattum, G., McGee, K. M., Rosenblatt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P115+RhoGEF+and+microtubules+decide+the+direction+apoptotic+cells+extrude+from+an+epithelium.">P115 RhoGEF and microtubules decide the direction apoptotic cells extrude from an epithelium.</a> J Cell Biol. 186, 693-702 (2009).</li><li>Burkel, B. M., Dassow, G. v. o. n., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+fluorescent+probes+for+actin+filaments+based+on+the+actin-binding+domain+of+utrophin.">Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).</li><li>Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-kinase+and+myosin+II+affect+dynamic+neural+crest+cell+behaviors+during+epithelial+to+mesenchymal+transition+in+vivo.">Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo.</a> Dev Biol. 324, 236-244 (2008).</li><li>Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fluorescent+protein+expression+in+germ-line+transmitted+transgenic+zebrafish+under+a+stratified+epithelial+promoter+from+keratin8.">fluorescent protein expression in germ-line transmitted transgenic zebrafish under a stratified epithelial promoter from keratin8.</a> Dev Dyn. 223, 204-215 (2002).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book, A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos.">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Curado, S., Stainier, D. Y., Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitroreductase-mediated+cell/tissue+ablation+in+zebrafish:+a+spatially+and+temporally+controlled+ablation+method+with+applications+in+developmental+and+regeneration+studies.">Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies.</a> Nat Protoc. 3, 948-954 (2008).</li></ol>

動物福祉の保証ゼブラフィッシュ、 ゼブラフィッシュを使用して、このプロトコルで実行されるすべての手順は、ユタ大学（動物福祉の保証＃10から07017まで）での動物実験使用委員会（IACUC）によって承認されている。

ここで説明するプロトコルは、ライブ上皮組織で押し出しのプロセスを可視化する単純で簡単な方法を示しています。このタイプの実験は、私たちは以前に固定された組織の分析に感謝しないアクチンダイナミクスの微妙な違いを調べることができる、そしてそれゆえ、一般的な免疫方法を補完する。として我々は、より我々は炎症反応や損傷した細胞の蓄積につながると期待されるアポト?...

<table border="1"><tbody><tr><th>の名前</th><th>タイプ</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント</th></tr><tr><td> RNeasyミニキット</td><td>試薬</td><td>キアゲン</td><td> 74104 </td><td></td></tr><tr><td> mMessage mMachine SP6キット</td><td>試薬</td><td>アンビオン</td><td> AM1340 </td><td></td></tr><tr><td>クロッシングタンク</td><td>ツール</td><td> Thoren水系</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピペットポンプ</td><td>ツール</td><td>ベルアートの製品</td><td> F3789 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ¾パスツールピペット</td><td>ツール</td><td> VWR </td><td> 14672-608 </td><td></td></tr><tr><td>マイクロインジェクションモールド</td><td>ツール</td><td>適応科学ツール</td><td> I - 34 </td><td></td></tr><tr><td> 100x15mm培養プレート</td><td>ツール</td><td>フィッシャー</td><td> 08-757-12 </td><td></td></tr><tr><td> Flamming /ブラウンマイクロピペットプラー</td><td>ツール</td><td>サター器械公司</td><td>モデルP97 </td><td></td></tr><tr><td>フィラメントとホウケイ酸ガラス管</td><td>ツール</td><td>サター器械公司</td><td> B1400 - 78から10 </td><td>外径1.0ミリメートル、ID 0.78ミリメートル、10cmの長さ</td></tr><tr><td>電極の保存瓶</td><td>ツール</td><td>世界の精密機器</td><td> E210 </td><td></td></tr><tr><td>フェノールレッド</td><td>試薬</td><td>シグマ</td><td> P0290 </td><td> DPBS中の0.5％ </td></tr><tr><td>圧力制御マイクロインジェクターとマニピュレーター</td><td>ツール</td><td>ハーバード装置</td><td> PLI - 100 </td><td></td></tr><tr><td> 35x10mm培養皿</td><td>ツール</td><td> Cellstar </td><td> 627から160 </td><td></td></tr><tr><td> G418（ゲネチシン） </td><td>試薬</td><td> GIBCO </td><td> 10131-035 </td><td> DHで50 mg / mLの2 0 </td></tr><tr><td>デュモン＃5鉗子</td><td>ツール</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11253〜20 </td><td></td></tr><tr><td> 12cmのピンホルダー</td><td>ツール</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 26016〜12 </td><td></td></tr><tr><td>ピンを挿入</td><td>ツール</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 26007から02および- 03 </td><td></td></tr><tr><td> 1.5カバーガラスとガラスボトム培養皿</td><td>ツール</td><td>マテック</td><td> P35G - 1.5 - 10 - C </td><td></td></tr><tr><td>低融点アガロース</td><td>試薬</td><td>フィッシャー</td><td> BP1360 - 100 </td><td></td></tr><tr><td> Tricaine </td><td>試薬</td><td>シグマ</td><td> - 5040 </td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>顕微鏡</td><td>ライカ</td><td> MZ6 </td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>顕微鏡</td><td>ニコン</td><td> SMZ645 </td><tD&gt; </td></tr><tr><td>蛍光解剖顕微鏡</td><td>顕微鏡</td><td>オリンポス</td><td> S2X12 </td><td></td></tr><tr><td>スピニングディスク共焦点顕微鏡</td><td>顕微鏡</td><td>ニコン</td><td> EclipseのTiの</td><td> Yokagawa回転するディスクのヘッドを装備</td></tr><tr><td> CCDカメラ</td><td>カメラ</td><td>アンドール</td><td> DV - 885 - VP </td><td> 1002x1004x8ミクロンの正方形ピクセル</td></tr></tbody></table>

live imaging of cell extrusion from the epidermis of developing zebrafish

上皮組織の恒常性維持は、バリア機能を中断することなく、損傷した細胞の継続的な除去が必要です。我々の研究は、死細胞がその終了に起因している可能性のある隙間を閉じながら上皮シートからそれをイジェクトするアクチンとミオシンの環を形成し、収縮する彼らのライブの隣人にシグナルを送ることを発見した、プロセスは、細胞の押し出し1と呼ばれる。ゼブラフィッシュの開発の光学的透明度は、上皮の生体内で押し出しを可視化するための優れたシステムを提供します。ここでは、幼虫のゼブラフィッシュの表皮で押し出しを誘発し、イメージする方法を説明します。押し出しを可視化するために、我々は、表皮の緑色蛍光タンパク質を発現する1細胞期トランスジェニックゼブラフィッシュの胚に、F -アクチンのために赤色蛍光タンパク質標識プローブを注入し、幼虫にG418を添加することによってアポトーシスを誘導する。私たちは、その後アポトーシス細胞の押し出しの過程でアクチンのダイナミクスと上皮細胞の挙動を観察するために回転するディスク共焦点顕微鏡でタイムラプスイメージングを使用してください。このアプローチは、私たちは生きて上皮に押出プロセスを調査することができますし、アポトーシス細胞を除去するために障害に起因する疾患状態を研究する手段を提供します。

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Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

死細胞は、バリア機能を中断することなく、隣接する細胞の協調した収縮によって上皮組織から押し出される。ゼブラフィッシュの開発の光学的透明度は、上皮の生体内で押し出しを可視化するための優れたシステムを提供します。ここでは、携帯電話の解像度で幼生ゼブラフィッシュの表皮で押し出しを誘発し、イメージする方法を説明します。

開発ゼブラフィッシュの表皮から細胞の押出のライブイメージング

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

live-imaging-cell-extrusion-from-epidermis-developing

Research

JoVE Journal

Biology

14.6K ビュー.  University of Utah. 死細胞は、バリア機能を中断することなく、隣接する細胞の協調した収縮によって上皮組織から押し出される。ゼブラフィッシュの開発の光学的透明度は、上皮の生体内で押し出しを可視化するための優れたシステムを提供します。ここでは、携帯電話の解像度で幼生ゼブラフィッシュの表皮で押し出しを誘発し、イメージする方法を説明します。

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Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

ライブゼブラフィッシュの胚における二光子軸索切断とタイムラプス共焦点イメージング

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

生物学

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

共焦点顕微鏡によるゼブラフィッシュ胚の脳のイメージングを生きる

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

アダルトゼブラフィッシュからの臓器の解剖

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

細胞運動やゼブラフィッシュ胚における個々の神経細胞と神経堤細胞のアクチン細胞骨格のライブイメージング

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

ライブゼブラフィッシュ胚における二光子ベースの光活性化

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

開発と大人の準備ショウジョウバエ</emライブイメージングのための>脳と網膜

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

アダルトゼブラフィッシュ網膜にモルフォの in vivoエレクトロポレーションに

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

アポトーシス細胞のクリアランスのイメージング中に生きる<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

初期のオートファジーイベントの細胞イメージングライブOmegasomesを以降

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.