健康科学研究促進助成金の中西部の大学からの資金によってサポートされていたこの作品は、研究とスポンサープログラム学内グラントのオフィスKJLに授与EEHと中西部の大学に授与。

このプロトコルは、実験動物の管理と使用に関するAVMA動物福祉の原則に準拠しており、中西部の大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されています。 麻酔、機器、およびメディアの作製<ol><li>約1.5（ペット店で入手可能）のどちらか、市販の脱塩剤を使用した水道水のLまたは24時間水スタンドをさせることにより、脱塩素。 3 1Lのビーカーを取得し、水を脱塩素500ミリリットルでそれぞれを埋める。すべての手順の前に魚を保持するための1と回復のための1にラベルを付けます。第3のビーカーに、トリカインメタン100μg/ mlを追加します。これは魚が麻酔をされる中でビーカーになる。 </li><li>氷浅いトレイを埋める、培地を温める（RPMI 1640,10％FBS（ウシ胎児血清）、50μg/ mlのゲンタマイシン、100μg/ mlのカナマイシン、25mMのHEPES）RTにし、清潔な宝石商ピンセットを集める。イメルによるクリーンピンセット70％エタノールでのヒントを歌うとエタノールを燃焼させること、ブンゼンバーナーを通過する。 </li><li> 10倍の倍率、または顕微鏡（個人的な好みに完全に依存）を解剖 - 手順は2で、商業、卓上照明付きルーペで、倍率なしで実行するかどうかを決定します。 </li></ol> 2.体外培養物を確立<ol><li>保持ビーカーに魚や場所の所望の数をキャッチ。麻酔のビーカーに、単一の魚を移す。それは個別に魚を麻酔するのが最善です。 </li><li>魚の水泳と鰓の動きを観察することによって麻酔の影響を監視します。麻酔が進行すると、鰓の動きが遅くなり、魚は不規則に、頻繁に逆さまに泳ぎます。とすぐに鰓の動きが止まるように麻酔魚を検討してください。これは魚の死をもたらす可能性がある麻酔浴に長期間魚を放置しないでください。 </li><li>麻酔ビーカーと転送から魚を削除氷に、ピンセットを持つ手に直面して尾を水平に魚を置く。技術で、複数の魚が外植片を作るために使用される場合に経験した場合、この時点で麻酔をビーカー内の次の魚を配置することを検討。 </li><li>スケールを除去するために、位置ピンセットは、スケールの端に先端が魚に平行である。スケールは魚の体から昇格させるために少し魚の側にピンセットの平らな面を押します。摘む、ピンセットで規模を持ち、組織培養皿で（反転なし）の場所。鰓地域、側線、フィンを避け、（それぞれの側から6）大の大人から12のスケールの最大値を除去し、手順を繰り返します。 </li><li>回復ビーカーに魚を置き、麻酔の影響から回復することを確認するために監視する。この時点で、魚が個々のタンクに戻って転送することができる。魚が完全なスケールの再生を可能にするために、少なくとも21日間回復できるようにします。 </li><li>応じてガラスボトムディッシュあたり6スケール - 実験デザイン、プラスチック製の35mm組織培養処理皿当たり20スケールまたは4にまで配置します。スケールは皿からスケールを剥離しないように、静かにメディアを追加する前に皿に接着させる。 注：メディアが最初皿に添加される前に経験により、複数の魚を処理することができる。 </li><li>各35ミリメートル皿に完全なメディア（上記1.2を参照のこと）の1.2ミリリットルを追加します。 </li><li>好ましくは、または追加の処理なし所望の時間、5％CO 2で28℃、外植文化をインキュベートする。また、加熱された顕微鏡ステージ上またはビデオ顕微鏡のための生きた細胞培養チャンバ内の文化をインキュベートする。 </li></ol> 3.明とビデオ顕微鏡<ol><li>顕微鏡ステージ上に、最初は細胞シートを含むポジション料理は4X対物レンズを用いて焦点を合わせる。 注：より高い倍率は実験に応じて、使用することができる。の位置をマーク各細胞シート及び/又はステージ上皿の向きがほぼ同じ方向にシートを経時的に画像を撮影が容易になる。 </li><li>各実験プロトコルに従って、種々の時点でのインキュベーターと写真から料理を取り外し、静止画像のみが実験的な時間枠にわたって必要とされている場合は、インキュベーターに戻し置く。 </li><li>ビデオ顕微鏡の実行中に、次のように注意を払う： <ol><li>位置移行細胞シートは、ビデオの継続時間の視野に残るように、視野内の目盛り/新興の細胞シート。 注：これは、細胞が、スケールの下から移行方法を観察中にいくつかの経験がかかる場合があります。短いビデオでは、これは長いビデオのためのより関心の低い。 </li><li>短い時間枠の場合は、RTでインキュベートする。より長い時間枠（18+時間）については、温度を維持するために加熱されたステージまたはインキュベーションチャンバーを使用してpHバランス、培養mの蒸発を最小限にするedium。 </li></ol></li></ol>免疫蛍光顕微鏡4.固定<ol><li>準備し、28℃に予熱暖かいすべてのソリューション。ガラスボトム35mmの組織培養皿を用いて、上記のように、蛍光下で角膜表示するために、外植片培養物を成長させる。また、ガラスチャンバースライドを使用しています。 </li><li>各ディッシュに1.1倍PBS中の4％パラホルムアルデヒドの0.8ミリリットルを追加します。最初の培養培地を削除しないでください。 溶液を除去するために吸引し、次いで室温で5分間インキュベートする。 </li><li>各ディッシュに1.1倍PBS中の4％パラホルムアルデヒドの0.8ミリリットルを追加します。溶液を除去するために吸引し、次いで室温で5分間インキュベートする。 </li><li> 1X PBS 0.5 mlを、0.2％トリトンX-100を添加することにより、外部のリガンドまたは外部のエピトープ、透過化細胞を使用しない場合。溶液を除去するために吸引し、次いで室温で5分間インキュベートする。 </li><li> 1×PBS中0.5ミリリットルの1％のBSAを追加し（4℃で）1（RTで）時間またはO / Nインキュベートする。 注：実験条件に依存して、のphalloidinこの工程で添加することができる。 </li><li>インキュベーション後、吸引して溶液を除去し、抗体染色を進める。 4℃で4週間 - 3用の1×PBS中の1％BSAを2ml - あるいは、少なくとも1を加算して培養皿を格納する。 </li></ol> 5.免疫蛍光プロトコル<ol><li>製造業者の推奨に従って一次および二次抗体溶液を準備します。 NOTE：ポリクローナル500および1：製造業者の推奨を使用できない場合は、（1×PBS中の1％BSA）で一次抗体の良い出発希釈は1 1,000モノクローナル抗体について、二次抗体のための良い出発希釈は1：千。信号が強く、バックグラウンドが問題となる場合には、信号が低く、弱い場合、より高い製造業者から入手したオリジナルの株式のこれらの希釈液を調整します。 </li><li> 1×PBS溶液中の1％BSAを吸引する。一次抗体溶液0.5mlを加え、（4℃で）またはO / N（RTで）1時間インキュベートする。 </li&gt; <li> 、一次抗体溶液を除去清潔に置き、1.5 mlマイクロチューブを標識し、-20℃で凍結する。 注：必要に応じてこれは、一次抗体の再利用が可能になります。 </li><li>各洗浄後、PBSを除去し、廃棄、1×PBSで5回 - ディッシュ3を洗ってください。 </li><li>二次抗体溶液の0.5ミリリットルを追加します。必要であれば、このステップの間に（どのメーカーの推奨濃度以下）蛍光標識ファロイジンを追加します。 （4℃で）またはO / N（RTで）1時間インキュベートする。 NOTE：蛍光標識ファロイジンの使用は、アクチンフィラメントの可視化を可能にする。我々は488標識ファロイジンは我々のゼブラフィッシュ角膜実質において最適に動作するが、他のフルオロフォアを使用することができることを見出した。 </li><li>二次抗体溶液を除去し、廃棄する。 </li><li>各洗浄後、PBSを除去し、廃棄、1×PBSで5回 - ディッシュ3を洗ってください。 注：皿4℃争うことができない場合に、光からカバーし、保存することができますすぐにワット。 （ - 30分20）、その後の直前次のステップに進むようにPBSを削除する1×PBSは、細胞が完全に乾くけどRTに暖かいないように格納する前に皿に追加されたことを確認してください。 </li><li>準備ができたら、観察する2追加するには - 皿に、実験的なニーズに応じて、DAPIの有無にかかわらず、封入剤の3滴を、室温で10分間放置します。 注：我々はDAPIで市販の、グリセロールベースの​​封入剤を使用していますが、他の取り付けメディアを使用することができます。皿に座って取り付け媒体10分を許可すると、皿の底からカバーガラスを容易に除去することが容易になります。 </li><li>インキュベーション後、軽く緩め、カバースリップを除去するための皿の側面に絞る。スライド上に、下に、細胞をスライドガラス上に取り付けメディアの追加のドロップを追加し、カバースリップを配置。 注： - 2日スライドよりも長い1保持する必要がある場合に明確な爪のポリッシュを使用してスライドにカバースリップを密封することを検討してください。 </li><li>蛍光顕微鏡下でスライドを観察します。 注：私たちの画像のほとんどは、油浸下40Xまたは63X対物レンズを用いて撮影したが、使用される特定の対物レンズは、実験プロトコルに依存します。 </li></ol>

<ol>
	<li>Burton, K., Park, J. H., Taylor, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratocytes+generate+traction+forces+in+two+phases.">Keratocytes generate traction forces in two phases.</a> Molecular Biology of the Cell. 10, 3745-3769 (1999).</li><li>Keren, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+shape+determination+in+motile+cells.">Mechanism of shape determination in motile cells.</a> Nature. 453, 475-480 (2008).</li><li>Lacayo, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+large-scale+cell+morphology+and+movement+from+local+actin+filament+growth+dynamics.">Emergence of large-scale cell morphology and movement from local actin filament growth dynamics.</a> PLOS Biology. 5, 233 (2007).</li><li>Lee, J., Ishihara, A., Theriot, J. A., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+locomotion+for+simple-shaped+cells.">Principles of locomotion for simple-shaped cells.</a> Nature. 362, 167-171 (1993).</li><li>Kolega, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Movement+of+Cell+Clusters.">The Movement of Cell Clusters.</a> J. Cell Sci. 49, 15-32 (1981).</li><li>Kolega, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+mechanical+tension+on+protrusive+activity+and+microfilament+and+intermediate+filament+organization+in+an+epidermal+epithelium+moving+in+culture.">Effects of mechanical tension on protrusive activity and microfilament and intermediate filament organization in an epidermal epithelium moving in culture.</a> The Journal of Cell Biology. 102, 1400-1411 (1986).</li><li>Rapanan, J. L., Cooper, K. E., Leyva, K. J., Hull, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+migration+of+primary+zebrafish+keratocytes.">Collective cell migration of primary zebrafish keratocytes.</a> Experimental Cell Research. 326, 155-165 (2014).</li><li>Richardson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+Zebrafish+as+a+Model+System+for+Cutaneous+Wound-Healing+Research.">Adult Zebrafish as a Model System for Cutaneous Wound-Healing Research.</a> Journal of Investigative Dermatology. 133, 1655-1665 (2013).</li><li>Cheon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+pro-inflammatory+cytokines+and+metalloproteinase-1+by+TGF-b1+in+synovial+fibroblasts+from+rheumatoid+arthritis+and+normal+individuals.">Increased expression of pro-inflammatory cytokines and metalloproteinase-1 by TGF-b1 in synovial fibroblasts from rheumatoid arthritis and normal individuals.</a> Clinica., &amp; Experimental Immunology. 127, 547-552 (2002).</li><li>Sandeman, S. R., Faragher, R. G. A., Allen, M. C. A., Liu, C., Lloyd, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+MMP-2+expression+and+secretion+change+with+increasing+serial+passage+of+keratocytes+in+culture.">Does MMP-2 expression and secretion change with increasing serial passage of keratocytes in culture.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 122, 157-167 (2001).</li><li>Schnaper, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+extracellular+matrix+proteins+and+decreased+expression+of+matrix+proteases+after+serial+passage+of+glomerular+mesangial+cells.">Increased expression of extracellular matrix proteins and decreased expression of matrix proteases after serial passage of glomerular mesangial cells.</a> Journal of Cell Science. 109, 2521-2528 (1996).</li><li>Tondreau, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+study+of+matrix+metalloproteinase/tissue+inhibitor+of+metalloproteinase+production+by+mesenchymal+stromal+cells+in+response+to+inflammatory+cytokines:+the+role+of+their+migration+in+injured+tissues.">In vitro study of matrix metalloproteinase/tissue inhibitor of metalloproteinase production by mesenchymal stromal cells in response to inflammatory cytokines: the role of their migration in injured tissues.</a> Cytotherapy. 11, 559-569 (2009).</li><li>Zimmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+rheumatoid+arthritis+synovial+fibroblasts+from+primary+culture+-+primary+culture+cells+markedly+differ+from+fourth-passage+cells.">Isolation and characterization of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts from primary culture - primary culture cells markedly differ from fourth-passage cells.</a> Arthritis Research. 3, 72-76 (2001).</li><li>McDonald, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+keratocyte+explant+cultures+as+a+wound+healing+model+system:+differential+gene+expressio.,+&amp;+morphological+changes+support+epithelial&#8211;mesenchymal+transition.">Zebrafish keratocyte explant cultures as a wound healing model system: differential gene expressio., &amp; morphological changes support epithelial&#8211;mesenchymal transition.</a> Experimental Cell Research. 319, 1815-1827 (2013).</li><li>Tan, B., Pascual, A., de Beus, A., Cooper, K., Hull, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFb+(transforming+growth+factor+b)+and+keratocyte+motility+in+24-hour+zebrafish+explant+cultures.">TGFb (transforming growth factor b) and keratocyte motility in 24-hour zebrafish explant cultures.</a> Cell Biology International. 35, 1131-1139 (2011).</li><li>Barut, B. A., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Realizing+the+potential+of+zebrafish+as+a+model+for+human+disease.">Realizing the potential of zebrafish as a model for human disease.</a> Physiological Genomics. 2, 49-51 (2000).</li><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nature Reviews Genetics. 8, 353-367 (2007).</li><li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hooked!+Modeling+human+disease+in+zebrafish.">Hooked! Modeling human disease in zebrafish.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122, 2337-2343 (2012).</li><li>Etchin, J., Kanki, J. P., Look, A. T., Westerfield, M., Detric, H. W., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Cell Biology. 105, 309-337 (2011).</li><li>Li, P., White, R. M., Zon, L. I., Westerfield, M., White, H. W., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Cell Biology. 105, 403-417 (2011).</li><li>Yen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+heterogeneity+and+mutational+burden+of+engineered+melanomas+in+zebrafish+models.">The genetic heterogeneity and mutational burden of engineered melanomas in zebrafish models.</a> Genome Biology. 14, R113 (2013).</li><li>Bouzaffour, M., Dufourcq, P., Lecaudey, V., Haas, P., Vriz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf+and+Sdf-1+Pathways+Interact+during+Zebrafish+Fin+Regeneration.">Fgf and Sdf-1 Pathways Interact during Zebrafish Fin Regeneration.</a> PLoS One. 4, e5824 (2009).</li><li>Dufourcq, P., Vriz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemokine+SDF-1+regulates+blastema+formation+during+zebrafish+fin+regeneration.">The chemokine SDF-1 regulates blastema formation during zebrafish fin regeneration.</a> Development Genes and Evolution. 216, 635-639 (2006).</li><li>Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf+signaling+instructs+position-dependent+growth+rate+during+zebrafish+fin+regeneration.">Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration.</a> Development. 132, 5173-5183 (2005).</li><li>Hyde, D. R., Godwin, A. R., Thummel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Electroporation+of+Morpholinos+into+the+Regenerating+Adult+Zebrafish+Tail+Fin.">In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin.</a> Journal of Visualized Experiments. 61, e3632 (2012).</li><li>Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromanipulation+of+Gene+Expression+in+the+Adult+Zebrafish+Brain+Using+Cerebroventricular+Microinjection+of+Morpholino+Oligonucleotides.">Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides.</a> Journal of Visualized Experiments. 75, e50415 (2013).</li><li>Konantz, J., Antos, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+Genetic+Morpholino+Approach+Using+Cardiac+Ventricular+Injection+to+Transfect+Multiple+Difficult-to-target+Tissues+in+the+Zebrafish+Larva.">Reverse Genetic Morpholino Approach Using Cardiac Ventricular Injection to Transfect Multiple Difficult-to-target Tissues in the Zebrafish Larva.</a> Journal of Visualized Experiments. 88, e51595 (2014).</li><li>Rambabu, K. M., Rao, S. H., Rao, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+expression+of+transgenes+in+adult+zebrafish+by+electroporation.">Efficient expression of transgenes in adult zebrafish by electroporation.</a> BMC Biotechnology. 5, 29 (2005).</li><li>Rapanan, J. L., Cooper, K. E., Leyva, K. J., Hull, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=During+collective+migration,+leader+keratocytes+generate+tension+in+sheet+and+may+become+follower+or+individually+migrating+cells.">During collective migration, leader keratocytes generate tension in sheet and may become follower or individually migrating cells.</a> Experimental Cell Research. In press, (2014).</li><li>Safferling, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+revised:+A+novel+reepithelialization+mechanism+revealed+by+in+vitro+and+in+silico+models).">Wound healing revised: A novel reepithelialization mechanism revealed by in vitro and in silico models).</a> The Journal of Cell Biology. 203, 691-709 (2013).</li><li>McDonald, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinases+and+collective+cell+migration+in+24+primary+zebrafish+explant+cultures:+MMP13+plays+an+inhibitory+role+and+MMP14+may+respond+to+stretch+during+reepithelialisation.">Matrix metalloproteinases and collective cell migration in 24 primary zebrafish explant cultures: MMP13 plays an inhibitory role and MMP14 may respond to stretch during reepithelialisation.</a> Cell Biology International Reports. 20, 24-36 (2013).</li><li>Haage, A., Nam, D. H., Ge, X., Schneider, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase-14+is+a+mechanically+regulated+activator+of+secreted+MMPs+and+invasion.">Matrix metalloproteinase-14 is a mechanically regulated activator of secreted MMPs and invasion.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2014).</li><li>Sire, J. -. Y., Girondot, M., Babiar, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marking+zebrafish,+Danio+rerio+(cyprinidae),+using+scale+regeneration.">Marking zebrafish, Danio rerio (cyprinidae), using scale regeneration.</a> The Journal of Experimental Zoology. 286, 297-304 (2000).</li><li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Teleost+skin,+an+ancient+mucosal+surface+that+elicits+gut-like+immune+responses.">Teleost skin, an ancient mucosal surface that elicits gut-like immune responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, 13097-13102 (2013).</li><li>Keren, K., Yam, P. T., Kinkhabwala, A., Mogilner, A., Theriot, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+fluid+flow+in+rapidly+moving+cells.">Intracellular fluid flow in rapidly moving cells.</a> Nature Cell Biology. 11, 1219-1224 (2009).</li><li>Bereiter-Hahn, J., Strohmeier, R., Kunzenbacher, I., Beck, K., Voth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locomotion+of+Xenopus+epidermis+cells+in+primary+culture.">Locomotion of Xenopus epidermis cells in primary culture.</a> Journal of Cell Science. 52, 289-311 (1981).</li><li>Nishikawa, A., Shimizu-Nishikawa, K., Miller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+characterization,+and+in+vitro+culture+of+larval+and+adult+epidermal+cells+of+the+frog+Xenopus+laevis.">Isolation, characterization, and in vitro culture of larval and adult epidermal cells of the frog Xenopus laevis.</a> In Vitro Cellula., &amp; Developmental Biology. 26, 1128-1134 (1990).</li><li>Schober, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+adhesion+kinase+modulates+tension+signaling+to+control+actin+and+focal+adhesion+dynamics.">Focal adhesion kinase modulates tension signaling to control actin and focal adhesion dynamics.</a> The Journal of Cell Biology. 176, 667-680 (2007).</li></ol>

著者らは、開示することは何もない。

培地の添加の前に、3分間 - 角膜実質細胞移植片培養を成功させるために最も重要なステップは、スケールが約2の培養皿に付着させている。スケールの約75％が、シート（各実験のために確立培養の数はそれに応じて調整する必要がある）に付着し成長する。角膜実質細胞シートは、魚から除去し、いくつかの理由のために培養にあらゆる規模の周りに形成しない。まず、外植のDAPI染色は、?...

<html>細胞運動性の研究は、伝統的に、個別に移動する細胞に集中している。魚や両生類外植片からの培養された角膜実質1-6に近づく実験的および数学的モデリングの両方を使用して、細胞運動のメカニズムを研究するための強力なモデル系であることが判明している。均一な形状、速度、および方向を維持しながら、個別に移動する細胞に対する実験研究は、細胞の急速な、滑らかな滑走運動によって補助される。特に、胚形成、創傷治癒、および転移の間に、細胞間結合を維持しながら、しかし、 インビボにおいて 、細胞は、しばしば集合的に移動する。したがって、集合的な細胞移動、細胞遊走のフィールド内の研究の成長とますます顕著領域である。これらの細胞の集合的な移行は、最近7に記載されており、それは創傷治癒モデルにおいて、集団の細胞遊走を研究するための強力なシステムにする多くのユニークな特徴を有している。 ove_content &quot;&gt;スケールが麻酔され、成体ゼブラフィッシュから引き抜かれると、いくつかの上皮組織は、スケールの下側に取り付けられたままである。細胞培養培地は、これらの上皮細胞、または角膜を添加する場合、スケールからの集合的な単位として急速に移行する。ザ·移植片培養は、細胞が無傷の上皮を再確立するために離れて外植片から、彼らは、創傷床の暫定マトリックス全体に同じように移行するモデル治癒上皮創傷、と見ることができる。最近のデータは、このex vivoでの文化を模倣し、多くの機能を示唆しているin vivoで成体ゼブラフィッシュにおける創傷治癒。創傷閉鎖率は8 エキソビボ系7で観察されるものと同様の移動速度に変換する。また、 インビボでの創傷治癒モデル、ワルファリンによる治療は、止血率に影響を及ぼさないことを示唆している治癒、免疫応答を低下させるヒドロコルチゾンでの処置は再上皮8を遅らせていない間</SUP&gt;。スケールは動物から除去されたとき、ゼブラフィッシュが出血しないように、止血は主要なプレーヤーではない。私たちは外植で免疫細胞を発見したが、我々は彼らが集団的細胞遊走に与えるかもしれない影響を研究していません。 ここで紹介するプロトコルは、多くの生物学的アッセイで使用するための一貫性と再現性を確保するゼブラフィッシュ角膜実質植片培養を確立する方法について説明します。これらの外植片培養は、いくつかの理由のために集団的細胞移動のためのin vitroモデルでは特に魅力的である。まず、ゼブラフィッシュ角膜実質は外植文化を確立する時間以内に使用される主要な細胞である。したがって、これらの細胞は、初代細胞9-13の通路に関連付けられた形態学的および遺伝子発現の変化を受けていない。第二に、このシステムは、創傷への応答、間葉trの上皮の一部として、14が負傷に応答して、再上皮化の研究のためのモデルを表すと遺伝子発現の変化および細胞骨格再配列14,15によって証明されるようにansition（EMT）プロセスが開始される。したがって、未処理の細胞において生じる遺伝子発現と運動性の背景の変化が特徴づけおよび処置変化を解釈するためのコンテキストを提供してきた。また、魚の角膜実質とヒトケラチノサイトは、機能的に同等である。両方は、それぞれの種の主要な上皮細胞である上皮創傷治癒において重要な役割を果たしている。第三に、大人のゼブラフィッシュは、黒色腫および他の癌19-21、8,14および組織再生22-24治癒皮膚の創傷を含むヒト疾患16-18の様々なモデル系として認識を得ている。 このモデルシステムの技術的利点は、同じように魅力的である。突然変異体およびトランスジェニック系統が増え、非営利、集中型の施設から利用できます。具体的には、ゼブラフィッシュ変異プロジェクト（ZMP）ウェルカム·トラスト·サンガー研究所では、ゼブラフィッシュゲノム中のすべてのタンパク質をコードする遺伝子中にノックアウト対立遺伝子を作成することを目指しています。現在、彼らは特徴付け24088アレルで、11892遺伝子、ゲノムの約45％に変異している。また、ZMPは提案を受け入れ、無償でノックアウトを生成します。幼虫と大人のゼブラフィッシュ25-28における遺伝子ノックダウンの最近の方法は、トランスジェニックアプローチが問題か、非現実的であるために発生上重要な遺伝子の機能を研究するための柔軟性を提供する。 〜145ミクロン/ hrの運動性の彼らの非常に急速な速度に起因する間もなく文化29の設立後、アッセイは（通常は24時間以内に）迅速に完了することができます。実験は迅速に完了することができ、培養物を室温で十分に成長するにつれ、ビデオ顕微鏡を含む哺乳動物細胞遊走アッセイに関連する技術的なハードルのいくつかは回避される。また、研究予算を締めるの時代に、zebrafISHは、容易かつ安価に維持されている。 外植片の構造と動作は複雑である。スケールが除去されると、魚が出血しないように、表面的な表皮層よりもはるかに規模で除去するとは考えにくい。角膜実質細胞の大部分は抗E-カドヘリン抗体14を染色するために表示されるスケールは、最初に魚から除去されるときに、外植片における優勢な細胞型であるように見える。さらに、免疫蛍光14によってビメンチン染色の欠如によって判断されるように、最初の培養における線維芽細胞の証拠はない。しかし、繰り返しスケール除去と、（ ビデオ1を参照） を植片における多数の好中球があるように思われる。 LPSにさらされたとき、我々は、それらのサイズ、急速に運動性、および細胞シートのうち、それらの移動の形態学的観察に基づいて、好中球のような、これらの細胞を同定した（データは示さず）。さらに、これらの細胞は明るくウィットを染色好中球サイトゾル因子ならびにとともに、それらがその表面上に豊富なFcRを有することを示す二次IgG抗体の様々な抗体（データは示していない）時間。複数の細胞層が外植片内に存在する。共焦点顕微鏡は、上、下、及び細胞角膜実質細胞シート間の可視好中球スケール付近の角膜実質層以上の前縁付近単層の存在を明らかにする。 初期の時点では、〜145ミクロン/ hrの初期レートでの外植片から角膜実質の集合的な移行を開始する多層外植分極しの端に、上の細胞。外植片によって覆われる領域が急速に増加し、シート内で、張力を拡散セルにつながる、前縁の進行速度の低下。リーダーとフォロワー細胞との間の迅速な相互変換は、シート7内で自然発生的に形成されたホールの形成及び閉鎖時の前縁で観察される。として外植片を用いて開始EMTプロセスは、シート断片を継続し、角膜実質細胞は、特殊化した、迅速な運動性を失う。遺伝子発現とEMTと一致して形態変化、創傷治癒、および炎症反応は外植は約10日間14のための実行可能な検討されて培養7日以内に発生する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="777">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:320px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:267px;">35 mm Glass Bottom Culture Dishes (Poly-D Lysine Coated)&#160;</td>
			<td style="width:71px;">MatTek</td>
			<td style="width:119px;">P35GC-1.5-14-C</td>
			<td style="width:320px;">1.5 mm&#160; thickness is best for coverslip removal.&#160; 14 mm diameter provides more culture area.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Swiss Jewelers Style Forceps, Integra, Miltex 17-303</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">21909-460</td>
			<td style="width:320px;">We find that narrow, fine forceps work the best for scale removal.&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

zebrafish keratocyte explants to study collective cell migration and reepithelialization in cutaneous wound healing

それらの固有の運動特性のために、魚の角膜実質細胞は、外植片培養物から解離長い単一細胞移動のメカニズムを研究するために使用されている。植片が確立されている場合しかし、これらの細胞はまた、個体が、移行を研究するための魅力的なモデルを角膜実質にする機能の多くを維持し、一括して移動：運動性の急速な速度、垂直アクチンケーブルとの広範なアクチンに富むラメラ、かつ比較的一定の速度をと移動の方向。初期の外植片では、集合的に移行するものと個別に移動する細胞の迅速な相互変換は、移行のモードを決定する際に、細胞 - 細胞接着の役割の研究を可能にし、移動の二つのモードの間の分子リンクを強調している。間葉への移行上皮が発生し、創傷治癒および炎症に関連する遺伝子が差次的に発現されるように、後に外植片中の細胞を迅速かつ集合的に移行する能力を失う。したがって、角膜実質細胞の外植片、皮膚創傷治癒の間に起こる遺伝子発現の変化の定義されたプログラムのコンテキストで集合的細胞移動のメカニズムを研究するための独自のシステムを表すことができ、再上皮化のためのインビトロモデルとして働くことができる。変異体およびトランスジェニックゼブラフィッシュ系統の様々な、利用可能な外植片は、異なる遺伝的背景を持つ魚から確立されることを可能にする。これは、これらのプロセス内の異なるタンパク質の役割を一意にアドレス指定することを可能にする。ここで概説プロトコルは、集団細胞遊走に関連する種々のアッセイで使用するためにこれらの外植文化を確立するための簡単​​かつ効果的な方法を記載する。

図1に示すように、角膜実質細胞のシートは、移植片培養を確立するための時間以内にスケール直下からの移行を観察することができる。時折、集合的に移行するシートから離れて壊れて個別に移行する角膜実質を観察することができる。外植片が以前に摘み取られ​​ていた魚から確立されたように加えて、シートを通って移動する豊富な好中球があります。より長い培養期間...

Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing at JoVE.com

Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing

ゼブラフィッシュ角膜実質は植片から細胞シートに移行し、上皮の創傷治癒の文脈における集団的細胞移動のメカニズムの研究のためのin vitroモデルを提供する。これらのプロトコルの詳細集団細胞遊走アッセイにおいて使用するための一次外植片培養を確立するための効果的な方法。

ゼブラフィッシュ角膜実質外植片は皮膚創傷治癒における集団細胞の移動および再上皮化を研究するために

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell ...

zebrafish-keratocyte-explants-to-study-collective-cell-migration

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.9K ビュー.  Midwestern University. ゼブラフィッシュ角膜実質は植片から細胞シートに移行し、上皮の創傷治癒の文脈における集団的細胞移動のメカニズムの研究のためのin vitroモデルを提供する。これらのプロトコルの詳細集団細胞遊走アッセイにおいて使用するための一次外植片培養を確立するための効果的な方法。 

ビデオ: Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and inflammatory responses. Given the current interest in the role of mesenchymal stromal cells in mediating tissue repair, we are interested in quantifying the migratory capacity of these cells, and understanding how migratory capacity may be altered after damage. Optimization of a rigorously quantitative migration assay that is both easy to customize and cost-effective to perform is key to answering questions concerning alterations in cell migration in response to various stimuli. Current methods for quantifying cell migration, including scratch assays, trans-well migration assays (Boyden chambers), micropillar arrays, and cell exclusion zone assays, possess a range of limitations in reproducibility, customizability, quantification, and cost-effectiveness. Despite its prominent use, the scratch assay is confounded by issues with reproducibility related to damage of the cell microenvironment, impediments to cell migration, influence of neighboring senescent cells, and cell proliferation, as well as lack of rigorous quantification. The optimized scratch assay described here demonstrates robust outcomes, quantifiable and image-based analysis capabilities, cost-effectiveness, and adaptability to other applications.

The capacity to migrate is a key function of many different cell types, including mesenchymal stromal cells (MSCs). However, quantifying alterations in migratory capacity after damage is challenging. This protocol describes an easily adaptable migration assay that uses rigorous statistics to quantify changes in MSC migratory capacity after damage.

可溶性タバコの煙抽出物によって損傷した後のマウス間葉系幹細胞の移動の変化を検出するために創傷スクラッチアッセイの最適化

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

発生生物学

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

幹細胞様<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚外植片を早期神経発達の特徴を研究するために<em&gt;インビトロ</em&gt;と<em&gt;インビボ</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

分析<em&gt;インビボ</emゼブラフィッシュ胚における細胞移植とタイムラプスイメージングを使用して&gt;細胞移動

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading to cirrhosis with hepatocellular dysfunction. Among multiple hepatic insults, alcohol abuse can lead to significant health problems including liver failure and hepatocellular carcinoma. Nonetheless, the identity of endogenous cellular sources that regenerate hepatocytes in response to alcohol has not been properly investigated. Moreover, few studies have effectively modeled hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury. We recently reported on establishing an ethanol (EtOH)-induced fibrotic liver model in zebrafish in which hepatic progenitor cells (HPCs) gave rise to hepatocytes upon near-complete hepatocyte loss in the presence of fibrogenic stimulus. Furthermore, through chemical screens using this model, we identified multiple small molecules that enhance hepatocyte regeneration. Here we describe in detail the procedures to develop an EtOH-induced fibrotic liver model and to perform chemical screens using this model in zebrafish. This protocol will be a critical tool to delineate the molecular and cellular mechanisms of how hepatocyte regenerates in the fibrotic liver. Furthermore, these methods will facilitate potential discovery of novel therapeutic strategies for chronic liver disease in vivo.

Sustained fibrosis with deposition of excessive extracellular matrix proteins leads to cirrhosis. Alcohol abuse is one of the main causes of severe liver disease. We established an ethanol-induced zebrafish fibrotic liver model to study the mechanisms and strategies of promoting hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury.

前駆細胞が媒介する肝細胞の再生を研究するためにゼブラフィッシュにおけるエタノール誘発性線維症肝臓モデルの開発

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene therapy in organ-cultured corneas. The diabetic corneal disease is a complication of diabetes with frequent abnormalities of corneal nerves and epithelial wound healing. We have also documented significantly altered expression of several putative epithelial stem cell markers in human diabetic corneas. To alleviate these changes, adenoviral gene therapy was successfully implemented using the upregulation of c-met proto-oncogene expression and/or the downregulation of proteinases matrix metalloproteinase-10 (MMP-10) and cathepsin F. This therapy accelerated wound healing in diabetic corneas even when only the limbal stem cell compartment was transduced. The best results were obtained with combined treatment. For possible patient transplantation of normalized stem cells, an example is also presented of the optimization of gene transduction in stem cell-enriched cultures using polycationic enhancers. This approach may be useful not only for the selected genes but also for the other mediators of corneal epithelial wound healing and stem cell function.

An example of adenoviral gene therapy in the human diabetic organ-cultured corneas is presented towards the normalization of delayed wound healing and markedly reduced epithelial stem cell marker expression in these corneas. It also describes the optimization of this process in stem cell-enriched limbal epithelial cultures.

糖尿病性角膜症のためのアデノウイルス遺伝子治療：ヒト臓器培養角膜と​​輪部上皮細胞における創傷治癒に及ぼす影響と細胞マーカーの発現を幹

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The M&#252;ller glia re-enter the cell cycle and produce neuronal progenitor cells that undergo subsequent rounds of cell divisions and differentiate into the lost neuronal cell types. Both M&#252;ller glia and neuronal progenitor cell nuclei replicate their DNA and undergo mitosis in distinct locations of the retina, i.e. they migrate between the basal Inner Nuclear Layer (INL) and the Outer Nuclear Layer (ONL), respectively, in a process described as Interkinetic Nuclear Migration (INM). INM has predominantly been studied in the developing retina. To examine the dynamics of INM in the adult regenerating zebrafish retina in detail, live-cell imaging of fluorescently-labeled M&#252;ller glia/neuronal progenitor cells is required. Here, we provide the conditions to isolate and culture dorsal retinas from Tg[gfap:nGFP]mi2004 zebrafish that were exposed to constant intense light for 35 h. We also show that these retinal cultures are viable to perform live-cell imaging experiments, continuously acquiring z-stack images throughout the thickness of the retinal explant for up to 8 h using multiphoton microscopy to monitor the migratory behavior of gfap:nGFP-positive cells. In addition, we describe the details to perform post-imaging analysis to determine the velocity of apical and basal INM. To summarize, we established conditions to study the dynamics of INM in an adult model of neuronal regeneration. This will advance our understanding of this crucial cellular process and allow us to determine the mechanisms that control INM.

Zebrafish retinal regeneration has mostly been studied using fixed retinas. However, dynamic processes such as interkinetic nuclear migration occur during the regenerative response and require live-cell imaging to investigate the underlying mechanisms. Here, we describe culture and imaging conditions to monitor Interkinetic Nuclear Migration (INM) in real-time using multiphoton microscopy.

多光子顕微鏡によるライブセルイメージングのための大人のトランスジェニックゼブラフィッシュ網膜外植片の文化

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

A Device for Performing Cell Migration/Wound Healing in a 96-Well Plate

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor metastasis. In this assay, cells are grown to form a confluent monolayer and a mechanical wound is created by scratching with a device. Then the migration rate of the cells towards the denuded area can be monitored by imaging. Our 8-channel mechanical wounder is designed to tackle most of the problems associated with the cell migration assay. Firstly, our wounder can be easily sterilized by autoclaving or with common disinfectants. Secondly, the individual adjustable pins allow even contact with the cell culture plate so that sharp and reproducible wounds can be created. Thirdly, the guiding bars on both sides of the wounder ensure consistent wounding position in each well. The use of disposable plastic pipette tips for wounding can further provide better handling of the wounder as well as to minimize cross-contamination. In conclusion, our cell wounder can provide researchers with a user friendly and reproducible device for performing the cell migration assay using the standard 96-well culture plate.

Here, we present a protocol to perform a semi-high throughput cell migration assay on a 96-well cell culture plate. This protocol is a fast, simple and economical method to create consistent scratch wounds on a cell monolayer.

96ウェルプレートに細胞遊走/創傷治癒を行う装置

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in zebrafish during different developmental stages. To investigate the role of endoglin(eng) in vessel formation during the development of hereditary hemorrhagic telangiectasia&#160;(HHT), morpholino-mediated targeted knockdown of eng in zebrafish are used to study its temporal expression and associated functions. Here, whole-mount in situ RNA hybridization (WISH) is employed for the analysis of eng and its downstream genes in zebrafish embryos. Also, tube formation assays are performed in HHT patient-derived induced pluripotent stem cell-differentiated&#160;endothelial cells (iPSC-ECs; with eng mutations). A specific signal amplifying system using the whole amount In Situ Hybridization &#8211; WISH provides higher resolution and lower background results compared to traditional methods. To obtain a better signal, the post-fixation time is adjusted to 30 min after probe hybridization. Because fluorescence staining is not sensitive in zebrafish embryos, it is replaced with diaminobezidine (DAB) staining here. In this protocol, HHT&#160;patient-derived iPSC lines containing an eng mutation are differentiated into endothelial cells. After coating a plate with basement membrane matrix for 30 min at 37 &#176;C, iPSC-ECs are seeded as a monolayer into wells and kept at 37 &#176;C for 3 h. Then, the tube length and number of branches are calculated using microscopic images. Thus, with this improved WISH protocol, it is shown that reduced eng expression affects endothelial progenitor formation in zebrafish embryos. This is further confirmed by tube formation assays using iPSC-ECs derived from a patient with HHT. These assays confirm the role for eng in early vascular development.

Presented here is a protocol for whole-mount in situ RNA hybridization analysis in zebrafish and tube formation assay in patient-derived induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells to study the role of endoglin in vascular formation.

iPSC-ICにおけるゼブラフィッシュ胚の全山ハイブリダイゼーションとチューブ形成アッセイは血管開発におけるエンドリンの役割を研究する

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

A Drosophila Model to Study Wound-induced Polyploidization

Polyploidy is a frequent phenomenon whose impact on organismal health and disease is still poorly understood. A cell is defined as polyploid if it contains more than the diploid copy of its chromosomes, which is a result of endoreplication or cell fusion. In tissue repair, wound-induced polyploidization (WIP) has been found to be a conserved healing strategy from fruit flies to vertebrates. WIP has several advantages over cell proliferation, including resistance to oncogenic growth and genotoxic stress. The challenge has been to identify why polyploid cells arise and how these unique cells function. Provided is a detailed protocol to study WIP in the adult fruit fly epithelium where polyploid cells are generated within 2 days after a puncture wound. Taking advantage of D. melanogaster&#39;s extensive genetic tool kit, the genes required to initiate and regulate WIP, including Myc, have begun to be identified. Continued studies using this method can reveal how other genetic and physiological variables including sex, diet, and age regulate and influence WIP&#39;s function.

A Drosophila Model to Study Wound-induced Polyploidization

Wound-induced polyploidization is a conserved tissue repair strategy where cells grow in size instead of dividing to compensate for cell loss. Here is a detailed protocol on how to use the fruit fly as a model to measure ploidy and its genetic regulation in epithelial wound repair.

創傷による多重化を研究する ショウジョウバエ モデル

Polyploidy is a frequent phenomenon whose impact on organismal health and disease is still poorly understood. A cell is defined as polyploid if it ...

Murine Excisional Wound Healing Model and Histological Morphometric Wound Analysis

The murine excisional wound model has been used extensively to study each of the sequentially overlapping phases of wound healing: inflammation, proliferation and remodeling. Murine wounds have a histologically well-defined and easily recognizable wound bed over which these different phases of the healing process are measurable. Within the field, it is common to use an arbitrarily defined &#8220;middle&#8221; of the wound for histological analyses. However, wounds are a three-dimensional entity and often not histologically symmetrical, supporting the need for a well-defined and robust method of quantification to detect morphometric defects with a small effect size. In this protocol, we describe the procedure for creating bilateral, full-thickness excisional wounds in mice as well as a detailed instruction on how to measure morphometric parameters using an image processing program on select serial sections. The two-dimension measurements of wound length, epidermal length, epidermal area, and wound area are used in combination with the known distance between sections to extrapolate the three-dimension epidermal area covering the wound, overall wound area, epidermal volume and wound volume. Although this detailed histological analysis is more time and resource consuming than conventional analyses, its rigor increases the likelihood of detecting novel phenotypes in an inherently complex wound healing process.

This protocol describes how to generate bilateral, full-thickness excisional wounds in mice and how to subsequently monitor, harvest, and prepare the wounds for morphometric analysis. Included is an in-depth description of how to use serial histological sections to define, precisely quantify and detect morphometric defects.