نشكر أعضاء روزنبلات المختبر العلمي للمناقشات والاقتراحات والتعليقات. نود أيضا أن نشكر الذين قدموا ماري هالوران يرجى الترميز البلازميد RFP - UtrCH وجرونوالد ديفيد الذي قدم CK : GFP الزرد المعدلة وراثيا. أيضا بفضل جريتشين الملك وموظفي الموارد اسماك الزرد المركزية في جامعة ولاية يوتا لصيانة ممتازة ورعاية الزرد. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة ، جائزة NIGMS NIH المدير الجديد المبتكر 1 DP2 OD002056 - 01 إلى JR. كان مدعوما من قبل GTE التدريب NIH السرطان المتعدد التخصصات 5T32 برنامج منح CA03247 - 8.

الأساسية لسير العمل في التصور من خلال حيوية أكتين النتوء خلية في البشرة من اسماك الزرد النامية وتتألف البشرة من الزرد النامية من طبقتين متميزة ، الطبقة السطحية (أو محيط بالأدمة) وطبقة من الخلايا القاعدية التي تتصل الغشاء القاعدي 2. خلايا طبقة السطح الخارجي يخضع موت الخلايا المبرمج ويتم التخلص من النسيج بواسطة البثق 3 (الشكل 1). تصور هذه العملية في الوقت الحقيقي ، ونحن حقن البروتين RNA أحمر فلوري ترميز تنصهر إلى المجال للتناظر calponin utrophin ، وهو بروتين ملزمة أكتين (RFP - UtrCH) 4،5 ، في خلية واحدة ، معربا عن المرحلة الزرد المعدلة وراثيا ببروتين أخضر (GFP ) تحت cytokeratin طبقية المروج ظهائر 8 6 (الشكل 2A). على الرغم من أنه أعرب عن بتواجد مطلق RFP - UtrCH في الحيوان بعد حقن الحمض النووي الريبي ، ونحن نركز على خلايا البشرة السطحية التي تعبر عن كل من طلب تقديم العروض وGFP لمتابعة أكتين ديناميات تحديدا في البشرة (الشكل 2B). ثم اننا نتعامل مع اليرقات G418 للحث على أفكارك قذف الخلية وصورة شعيرات أكتين البشرة وباستخدام مجهر القرص الغزل والحصول على مجموعات البيانات مبائر 4D. قبل بدء التجربة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في المختبر نسخ الحمض النووي الريبي DNA من قالب خطي باستخدام mMachine mMessage SP6 مجموعة (Ambion) وتنقية باستخدام الحمض النووي الريبي توج RNeasy البسيطة مجموعة (Qiagen). يخفف من الحمض النووي الريبي ل~ 60ng/ul باستخدام الماء المعقم ، وجعل 3 5μl aliquots وتخزينها في -80 درجة مئوية لتصبح جاهزة للحقن. ملاحظة : تجنب تكرار تجميد / الذوبان لمنع تدهور الحمض النووي الريبي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل قالب لعقد أجنة خلال الحقن عن طريق سكب 40mL agarose من 2 ٪ في المتوسط ​​الجنين E3 (E3) في لوحة الثقافة 15mm × 100 ووضع قالب microinjection (التكيفية أدوات العلم ، # I - 34) في هذا الدرج. مرة واحدة وقد عززت agarose ، إزالة العفن لفضح أجران في agarose. متجر لوحة في 4 درجات مئوية لتصبح جاهزة للاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب شعري للحقن الإبر باستخدام الزجاج البورسليكات مع شعيرات (OD 1.0mm ، ID 0.78 ، طول 10cm) وبولير سوتر الماصة P - 97 في الإعدادات التالية (هيت 485 ، سحب 50 ، سرعة 60 ، والتأخر / الوقت 90 ، 200 ضغط ). ملاحظة : هناك أنواع مختلفة من الزجاج وسوف تتطلب التحسين من الشروط المذكورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يشكلون 1 ٪ قليلة الذوبان (LM) agarose في aliquots 1mL E3 وتخزين حوالي 42 درجة مئوية. كن حذرا كما تبخر E3 من مخزون يمكن أن تزيد من تركيز agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على الزرد الكبار تحت ظروف المختبر القياسية ، مع ضوء العادية / دورة الظلام للضوء 14 ساعة و 10 ساعة من الظلام 7. في الليلة التي سبقت تجربة إعداد الأسماك للتزاوج من خلال وضع 3 إناث والذكور 2 في خزان مفصولة المفرق. في صباح اليوم التالي ، وتغيير المياه في الخزان وسحب مقسم عندما تتسلط الأضواء على. </li></ol> 1. حقن البروتين RNA ترميز أكتين الكلمات الدلالية Fluorescently تجليد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد على الحمض النووي الريبي. إضافة الفينول الأحمر 0.5 ٪ إلى الحمض النووي الريبي في نسبة 1:1 لتركيز النهائي من الحمض النووي الريبي 30ng/μl ~ وتحميل حل 1μl في إبرة الشعرية سحبت عن طريق ملء الخلفي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ~ جمع 75 1 8 خلايا المرحلة CK : GFP الأجنة في E3. الماصة للالماصة باستور جمع الأجنة في القالب microinjection مع 5 ¾ وتوجيه بلطف الأجنة في الحوض الصغير مع دومون FST # 5 ملقط. ملاحظة : احرص على العمل بسرعة لتجنب الحقن في مرحلة الجنين متعددة الخلايا ، مما يؤدي إلى التعبير عن فسيفساء من حقن الحمض النووي الريبي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت stereomicroscope مختبر تشريح القياسية ، حقن الحمض النووي الريبي في صفار من أجنة باستخدام microinjector الضغوط التي تسيطر عليها (هارفارد جهاز PLI - 100 - الحاقن بيكو). وينبغي أن يكون بقعة حمراء (أحمر الفينول) تكون مرئية في الجنين بعد الحقن. ضخ ما لا يقل عن 50 الأجنة لكل تجربة. (انظر البروتوكول إن الرب السابق لبروتوكول مفصلة عن حقن الحمض النووي الريبي في الأجنة الزرد 9). ملاحظة : <ol type="A" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي استخدام حجم ~ 2nl للحقن في واحدة من الحمض النووي الريبي خلايا الأجنة المرحلة. لتحديد كمية من الحمض النووي الريبي حقن ، الاستغناء a بلعة من الحمض النووي الريبي في قطرة من الزيت المعدني على شريحة ميكرون معايرة أو تحت المجهر مع شريط النطاق في صلب العدسات. ينبغي أن يكون قطرة من الحمض النووي الريبي كرة مثالية. حساب المبلغ الذي ألقاه باستخدام المعادلة : المجلد (في هولندا) = 4/3πr 3. ضبط حجم تسليمها عن طريق تغيير ضغط الحقن أو الوقت على الصك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي أيضا الحرص على حقن بأقل كمية من الحمض النووي الريبي الذي يسمح التصور من fluorophore ، وتركيزات عالية من الحمض النووي الريبي يمكن أن تكون سامة إلى الجنين النامي. المناسبة لتحديد مستوى التعبير ، ينبغي إجراء تجربة جرعة منحنى قبل تشغيل التجربة. &lt;/ لى&gt; </ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فرز الأجنة لإزالة أي بويضة غير مخصبة أو تالفة ، وإخضاع جميع الأجنة المتبقية على 28،5 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 24 ساعة ، واستخدام المجهر الفلورسنت تشريح لتحديد الأجنة الزرد التي لديها مستوى عال من GFP (البشرة) وRFP مضان (أكتين). وضع الأجنة في المختارة 28.5 درجة مئوية حتى جاهزة للشروع في العلاج الدوائي للحث على موت الخلايا المبرمج. </li></ol> 2. تحريض النتوء خلية في يرقات اسماك الزرد باستخدام G418 لقد وجدنا أن التعرض للمضادات الحيوية أمينوغليكوزيد G418 ، أو Geneticin ، وأسباب موت الخلايا المبرمج وقذف خلايا البشرة في وضع اليرقات الزرد 3 عبر آليات غير معروفة. الأهم من ذلك ، هذا العلاج يعمل فقط على اليرقات التي هي 4 أيام آخر الإخصاب وكبار السن. فإننا نجد أنه يمكن العثور على خلايا ~ 25/05 البثق في أي وقت من الأوقات من زعنفة الظهارية من الزرد G418 اليرقات المعالجة. وكمية الخلايا أفكارك البثق يمكن أن تختلف من الأسماك بالصيد ، نوصي تصاعد الأسماك متعددة للتصوير. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع ومكان آخر التسميد 4 يوم (DPF) يرقات الزرد العارضة كلا GFP ومضان RFP في صحن × 35 10MM الثقافة التي تحتوي على 3 مل (MLS) من E3. يمكن للمرء أن علاج ما يصل إلى 25 في هذه اليرقات حجم الطبق الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال بعناية مع وسائل الإعلام من 3mLs E3 1mg/mL تحتوي على يرقات واحتضان G418 في المخدرات لمدة 4 ساعات على 28،5 درجة مئوية. علما بأن G418 هو الضوء الحساسة ، حتى تأخذ الرعاية للحفاظ على طبق الثقافة مغطاة أو في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وسائل الإعلام واستبدالها قبل تحسنت 28.5 ° C تحتوي على وسائل الاعلام E3 Tricaine 0.02 ٪ ، والشروع في تركيب اليرقات. </li></ol> 3. تصاعد يرقات اسماك الزرد للتصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3 نقل اليرقات إلى أنبوب 1.5 مل إيبندورف وإزالة معظم E3 بعد غرق الأسماك إلى قاع الأنبوب. لقد وجدنا أن يمكن أن تصل إلى 3 الحيوانات شنت بشكل صحيح قبل agarose يتصلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تلميح باستخدام الماصة قطع ، 120ul الماصة من 1 ٪ LM - agarose (42 درجة مئوية) في أنبوب المزيج ، ثم الماصة بلطف واليرقات على خليط من agarose ساترة في قعر طبق الثقافة ماتيك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام حامل FST دبوس دبوس مع ادخال ابرة او التنغستن المرفقة ، بسرعة توجيه اليرقات بحيث تكون مستقيمة وثابتة ضد ساترة للطبق ماتيك. ملاحظة : نحن نستخدم عادة دبوس على التوالي لتوجيه أول اليرقات وبعد ذلك يعلقون على شكل حرف L لضمان أن تكون مسطحة ضد ساترة ، بينما منع الأضرار التي لحقت العينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة في agarose وقد عززت ، وملء الطبق برفق مع E3 تحتوي على 0.02 ٪ Tricaine. ملاحظة : بدلا من ذلك ، يمكن أن تضاف إلى E3 G418 في صحن التصوير على مواصلة حمل قذف ، على الرغم من التعرض الطويل الأمد للG418 1mg/mL سوف تقتل اليرقات. </li></ol> 4. يعيش تصوير حيوية أكتين الفردية والسلوكيات الخلايا الظهارية خلال النتوء خلية باستخدام مجهر القرص غزل متحد البؤر لقد وجدنا أن العملية برمتها من قذف الخلية أفكارك من البشرة من يرقات النامية الزرد يستغرق نحو 20 دقيقة 3. نحن هنا لشرح كيفية الإعداد تجربة تصوير مرور الزمن لجمع سلسلة من الطائرات ض من خلال طبقة واحدة من البشرة الزرد لتصور عملية قذف. لقد وجدنا أن المجاهر نموذجية widefield الفلورسنت photobleaching سببا هاما من خيوط الأكتين وعدم السماح للتصوير timelapse. لذلك ، لتحقيق أقصى قدر من قرارنا ومنع photobleaching ، ونحن نستخدم المجهر القرص الغزل مبائر. أدناه ونحن تصف كيفية إعداد التجربة باستخدام برنامج الذكاء Andor مع نيكون المجهر ، على الرغم من أنه يمكن تطبيق هذه المبادئ لمناقشة المجهر مجموعة عمليات مماثلة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أولا ، بدوره على الأرجون (لاستثارة GFP في 488nm) وHeNe (لاستثارة RFP في 561nm) ليزر ، المجهر ، وكاميرا ومصباح epifluorescent. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضمن برامج الذكاء Andor (الإصدار 1.10.1) ، بروتوكول إنشاء سلسلة زمنية تحتوي على موجات تريد صورة ، يجب أن تواتر الفترات الفاصلة بين يلتقط الصورة وعدد مرات تكرارها في الالتقاط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بلطف مكان الطبق ماتيك تحتوي العينة على المسرح الخاص واستخدام المجهر هدفا 20X مع الضوء ينتقل إلى التركيز على اليرقات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل مياه الغمر 40X الهدف (NA 0.8) في الموضع الصحيح. باستخدام هذا الهدف ، نستطيع أن الفيلم ما يقرب من 20-25 في مجال الخلايا ، والتي تسمح لنا لمتابعة السلوكيات الخلوي أثناء قذف في حين حل أيضا ديناميات الأكتين الفرعية الخلوية. ملاحظة : تصاعد نفسه ، ويمكن تطبيق استراتيجيات التصوير المجاهر لتستقيم ، على الرغم من يجب استخدام الغمر بالماء 40X موضوعية مع مسافة طويلة في العمل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المكان بعناية قطرة من الماء على الجزء العلوي من الهدف بسرعة 40X ومكان الطبق ماتيك على القمة. ليسه : يمكن أيضا حل زايس الغمر Immersol ان تستخدم اذا كان تبخر الماء هو المشكلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد العينة باستخدام المرحلة أو إنارة مدينة دبي للإنترنت واستخدام ثم epifluorescence 488nm إلى التركيز تحديدا على البشرة GFP إيجابية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل إلى وضع المسح مبائر. ضبط كثافة الليزر وزمن التعرض لكل من القنوات (488nm 561nm و) تبعا لذلك. الحرص على تحقيق التوازن في السلطة ليزر ووقت التعرض للكشف الأمثل للإشارة ، ومنع أي photobleaching أو سمية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحديد الخلايا البثق ، استخدم epifluorescence لتصور GFP المسمى البشرة وتحديد مجموعة من الخلايا في نمط ريدة الكلاسيكية ، والتي تتكون من مجموعة من الخلايا المحيطة زنزانة صغيرة مستديرة في وسطها. باستخدام مبائر وضع المسح الضوئي ، وينبغي أن يكون هناك أيضا تراكم أكتين RFP المسمى مرئية كما حلقة حول الخلية جولة صغيرة في الوسط ، وهي السمة المميزة للقذف الخلية. ذات مرة كنت قد حددت خلية البثق والمسارعة لتشكيل لاكتساب المجهر 4D (XYZ وقت) مبائر قواعد البيانات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين نقطة العلوي والسفلي داخل الطائرة ض لتصور طبقة واحدة من البشرة ، بما في ذلك خلية البثق ، وحدد حجم الخطوة. لمرور الوقت مجموعة التصوير ، وفترات لالتقاط الصور وعدد من التكرار. على سبيل المثال ، فإننا عادة ما يكون الحصول على سلسلة Z - 5 - 10μm الممتدة ، مع حجم ميكرون الخطوة 1 ، كل دقيقة 1-2 لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لعرض البيانات ، ونحن جعل عادة 3 - D التوقعات من سلسلة z وحفظ البيانات على النحو ملف الفيلم متوافق مع الزمن السريع (أبل). بهذه الطريقة ، يمكننا تصور تقلص حلقة أكتين الظهارية والسلوكيات التي تحدث في جميع أنحاء الخلية تموت مع مرور الوقت. </li></ol> 5. ممثل النتائج <img src="/files/ftp_upload/2689/2689fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> الشكل 1. تخطيطي للقذف الخلية أفكارك. وتظهر خيوط الأكتين في الحمراء ، وخلايا البشرة GFP الإيجابية الأخضر. <img src="/files/ftp_upload/2689/2689fig2.jpg" alt="الشكل 2"/> الشكل 2. التجريبية سير العمل. ألف تخطيطي لسير العمل في التجربة. باء. التعبير عن RFP - UtrCH في البشرة من CK 4dpf : GFP الزرد. <img src="/files/ftp_upload/2689/2689fig3.jpg" alt="الشكل 3"/> الشكل 3. ومع الإطارات (Z - إسقاطات) من فيلم مرور الزمن الذي يلي يعيش أكتين ديناميكية أثناء عملية قذف الخلايا الظهارية. الأسهم تدل على حلقة الأكتين التي شكلتها الخلايا المجاورة التي العقود ويغلق على مدار 2 دقيقة.

<ol>
	<li>Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+epithelial+cell+destined+for+apoptosis+signals+its+neighbors+to+extrude+it+by+an+actin-+and+myosin-dependent+mechanism.">An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism.</a> Curr Biol. 11, 1847-1857 (2001).</li><li>Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+development+in+bony+fish+with+particular+emphasis+on+collagen+deposition+in+the+dermis+of+the+zebrafish+(Danio+rerio).">Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio).</a> Int J Dev Biol. 48, 217-231 (2004).</li><li>Slattum, G., McGee, K. M., Rosenblatt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P115+RhoGEF+and+microtubules+decide+the+direction+apoptotic+cells+extrude+from+an+epithelium.">P115 RhoGEF and microtubules decide the direction apoptotic cells extrude from an epithelium.</a> J Cell Biol. 186, 693-702 (2009).</li><li>Burkel, B. M., Dassow, G. v. o. n., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+fluorescent+probes+for+actin+filaments+based+on+the+actin-binding+domain+of+utrophin.">Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).</li><li>Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-kinase+and+myosin+II+affect+dynamic+neural+crest+cell+behaviors+during+epithelial+to+mesenchymal+transition+in+vivo.">Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo.</a> Dev Biol. 324, 236-244 (2008).</li><li>Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fluorescent+protein+expression+in+germ-line+transmitted+transgenic+zebrafish+under+a+stratified+epithelial+promoter+from+keratin8.">fluorescent protein expression in germ-line transmitted transgenic zebrafish under a stratified epithelial promoter from keratin8.</a> Dev Dyn. 223, 204-215 (2002).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book, A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos.">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Curado, S., Stainier, D. Y., Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitroreductase-mediated+cell/tissue+ablation+in+zebrafish:+a+spatially+and+temporally+controlled+ablation+method+with+applications+in+developmental+and+regeneration+studies.">Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies.</a> Nat Protoc. 3, 948-954 (2008).</li></ol>

رعاية الحيوان ضمان وقد تمت الموافقة على تنفيذ جميع الإجراءات في هذا البروتوكول باستخدام الزرد ، دانيو rerio ، عن طريق رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة (IACUC) في جامعة ولاية يوتا (ضمان رعاية الحيوان # 10-07017).

بروتوكول الموصوفة هنا يوضح طريقة بسيطة ومباشرة لتصور عملية البثق في منديل الظهارية حية. هذا النوع من التجربة تسمح لنا دراسة ديناميات أكتين الدقيقة لا تقدر سابقا في تحليل الأنسجة الثابتة ، وبالتالي يكمل أساليب مناعي مشترك. يمكننا استخدام هذا البروتوكول في تركيبة مع ?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم </th><th> نوع </th><th> شركة </th><th> رقم كتالوج </th><th> تعليقات </th></tr><tr><td> RNeasy ميني كيت </td><td> الكاشف </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td><td></td></tr><tr><td> mMessage mMachine SP6 كيت </td><td> الكاشف </td><td> Ambion </td><td> AM1340 </td><td></td></tr><tr><td> عبور الدبابات </td><td> أداة </td><td> Thoren الأنظمة المائية </td><td></td><td></td></tr><tr><td> والمضخة الماصة </td><td> أداة </td><td> منتجات بيل فنون </td><td> F3789 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ¾ باستور الماصة </td><td> أداة </td><td> VWR </td><td> 14672-608 </td><td></td></tr><tr><td> Microinjection مقلب </td><td> أداة </td><td> أدوات التكيف العلوم </td><td> I - 34 </td><td></td></tr><tr><td> 100x15mm الثقافة بلايت </td><td> أداة </td><td> الصياد </td><td> 08-757-12 </td><td></td></tr><tr><td> Flamming / براون Micropipet بولير </td><td> أداة </td><td> سوتر آلات الشركة </td><td> نموذج P97 </td><td></td></tr><tr><td> زجاج البورسليكات الشعيرات الدموية مع الشعيرة </td><td> أداة </td><td> سوتر آلات الشركة </td><td> B1400 - 78-10 </td><td> OD 1.0mm ، ID 0.78mm ، وطول 10cm </td></tr><tr><td> جرة التخزين الكهربائي </td><td> أداة </td><td> العالم آلات دقيقة </td><td> E210 </td><td></td></tr><tr><td> الفينول الأحمر </td><td> الكاشف </td><td> سيغما </td><td> P0290 </td><td> 0.5 ٪ في DPBS </td></tr><tr><td> الضغط والتحكم Microinjector Micromanipulator </td><td> أداة </td><td> جهاز هارفارد </td><td> PLI - 100 </td><td></td></tr><tr><td> 35x10mm الثقافة الطبق </td><td> أداة </td><td> Cellstar </td><td> 627-160 </td><td></td></tr><tr><td> G418 (Geneticin) </td><td> الكاشف </td><td> GIBCO </td><td> 10131-035 </td><td> 50 ملغ / مل في DH 2 0 </td></tr><tr><td> دومون # 5 الملقط </td><td> أداة </td><td> أدوات العلوم غرامة </td><td> 11253-20 </td><td></td></tr><tr><td> 12cm حامل الدبوس </td><td> أداة </td><td> أدوات العلوم غرامة </td><td> 26016-12 </td><td></td></tr><tr><td> إدراج دبابيس </td><td> أداة </td><td> أدوات العلوم غرامة </td><td> 26007-02 و- 03 </td><td></td></tr><tr><td> صحن زجاج الثقافة القاع مع 1.5 ساترة </td><td> أداة </td><td> ماتيك </td><td> P35G - 1.5 - 10 - C </td><td></td></tr><tr><td> انخفاض تذوب Agarose </td><td> الكاشف </td><td> الصياد </td><td> BP1360 - 100 </td><td></td></tr><tr><td> Tricaine </td><td> الكاشف </td><td> سيغما </td><td> A - 5040 </td><td></td></tr><tr><td> تشريح مجهر </td><td> مجهر </td><td> لايكا </td><td> MZ6 </td><td></td></tr><tr><td> تشريح مجهر </td><td> مجهر </td><td> نيكون </td><td> SMZ645 </td><tد&gt; </td></tr><tr><td> فلوري مجهر تشريح </td><td> مجهر </td><td> اوليمبوس </td><td> S2X12 </td><td></td></tr><tr><td> الغزل القرص مجهر متحد البؤر </td><td> مجهر </td><td> نيكون </td><td> كسوف تي </td><td> تجهيزه مع قرص Yokagawa رئيس الغزل </td></tr><tr><td> كاميرا CCD </td><td> كاميرا </td><td> Andor </td><td> DV - 885 - VP </td><td> 1002x1004x8 ميكرون مربع بكسل </td></tr></tbody></table>

live imaging of cell extrusion from the epidermis of developing zebrafish

استتبابي صيانة الأنسجة الطلائية المستمر يتطلب إزالة الخلايا التالفة من دون تعطيل وظيفة الحاجز. ووصف عملية دراستنا وجدنا أن الخلايا الميتة إرسال إشارات إلى جيرانهم العيش في تشكيل وعقد حلقة من الأكتين والميوسين التي يقذف بها من ورقة الظهارية في حين إغلاق أي ثغرات يمكن أن تكون قد نتجت عن خروجها ، قذف الخلية 1. الوضوح البصري الزرد النامية يوفر نظاما ممتازا لتصور البثق في العيش ظهائر. نحن هنا وصف الأسلوب للحث على صورة وقذف في البشرة الزرد اليرقات. لتصور البثق ، ونحن حقن بروتين فلوري الأحمر المسبار المسمى لأكتين F - الأجنة في مرحلة واحدة خلايا معدلة وراثيا الزرد التعبير عن بروتين الفلورية الخضراء في البشرة ويحفز موت الخلايا المبرمج عن طريق إضافة إلى G418 اليرقات. ثم نستخدم الوقت الفاصل بين التصوير على القرص الغزل مبائر المجهر لمراقبة ديناميات أكتين والسلوكيات الخلايا الظهارية أثناء عملية قذف الخلية أفكارك. هذا الأسلوب يتيح لنا للتحقيق في عملية قذف في ظهائر العيش وسوف توفر وسيلة لدراسة الحالات المرضية الناجمة عن الفشل في القضاء على الخلايا أفكارك.

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish at JoVE.com

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

خلايا الموت تنبثق من الأنسجة الطلائية التي تقلص متضافرة من الخلايا المجاورة دون تعطيل وظيفة الحاجز. الوضوح البصري الزرد النامية يوفر نظاما ممتازا لتصور البثق في العيش ظهائر. نحن هنا وصف أساليب للحث على صورة وقذف في البشرة الزرد اليرقات في القرار الخلوية.

يعيش التصوير من النتوء خلية من البشرة من اسماك الزرد النامية

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

live-imaging-cell-extrusion-from-epidermis-developing

Research

JoVE Journal

Biology

14.6K Views.  University of Utah. خلايا الموت تنبثق من الأنسجة الطلائية التي تقلص متضافرة من الخلايا المجاورة دون تعطيل وظيفة الحاجز. الوضوح البصري الزرد النامية يوفر نظاما ممتازا لتصور البثق في العيش ظهائر. نحن هنا وصف أساليب للحث على صورة وقذف في البشرة الزرد اليرقات في القرار الخلوية.

Video: Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

ثنائي الفوتون axotomy والوقت الفاصل بين التصوير مبائر يعيش في الأجنة الزرد

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

يعيش تصوير الدماغ الجنينية اسماك الزرد بواسطة الميكروسكوب متحد البؤر

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

تشريح هيئات من اسماك الزرد الكبار

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

يعيش التصوير في القدرة على الحركة والهيكل الخلوي أكتين خلية من الخلايا العصبية الفردية والخلايا العصبية في الأجنة كريست اسماك الزرد

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

ثنائي الفوتون المستندة إلى تنشيط ضوئي في الأجنة الحية اسماك الزرد

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

إعداد وتطوير الكبار ذبابة الفاكهة الأمخاخ والشبكية للتصوير لايف

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

في الجسم الحي من Electroporation Morpholinos في شبكية العين اسماك الزرد الكبار

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

يعيش التصوير من تخليص الخلية أفكارك أثناء<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; مرحلة التطور الجنيني

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

يعيش التصوير خلية من الأحداث الالتهام الذاتي المبكر: Omegasomes وما بعدها

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.