我々は感謝してウェイン州立大学（MJA）、研究（SMV）のエージングのためのアメリカ財団、国立研究所の生体イメージングとバイオの国立研究所から独立キャリアトランジション賞（R00EB007129）への経路からの助成金からのスタートアップ資金を認めるの健康（MJA）。

1。 LnCl 3塩を使用してメタル化<ol><li> 30から265 mMの溶液を生成する水の配位子を溶かす。配位子2 - （4 - isothiocyanatobenzyl） -ジエチレントリアミン五酢酸（P - SCN - BN - DTPA）は73 mMの濃度で、このビデオで使用されていました。 </li><li> 1 M NH 4 OHを添加することにより5.5と7.0の間に配位子の溶液のpHを調整します。このビデオでは、1 M NH 4 OH液0.2 mLを使用した。 </li><li> 5000〜1000 mMの濃度の溶液を生成するために水でLnCl 3の1〜2当量を溶解する。このビデオでは、EuCl 3、GdCl 3は 111 mMの濃度で使用された。金属の過剰は、多くの場合、完了するまでメタル化を促進し、その結果、精製を簡素化するために使用されます。 </li><li>攪拌しながら、配位子の解決にLnCl 3の溶液を加える。 </li><li> LnCl 3を添加した後、0.2 M NH 4 OHを添加することにより5.5と7.0の間に得 ​​られた反応混合物のpHを調整する。 0.2 M NH 4 OH溶液0.5 mLの合計は、このビデオで使用されていました。あなたのリガンドは、酸に敏感な官能基が含まれている場合、このステップの中のpHを複数回調整する。注意 - 解決策があまりにも基本的になれば、どのベースに敏感な官能基は、イソチオシアネートと同様に、結合体化のため使用できなくなります。 </li><li> pH測定を経由して反応を監視する。 pHが一定のままである時に反応は完了です。 </li></ol> 2。 （このビデオに含まれているが、ベースに敏感な官能基のない配位子のためによくない）pHの精密検査を上げる<ol><li> ≥11にpHを調整するために反応混合物に濃NH 4 OHを追加。このステップでは、不溶性の水酸化物として任意の非錯化金属を沈殿する。 </li><li> 0.2μmのフィルターに通して上清をフィルターします。反応混合物は、フィルタをひいた場合、遠心分離の前のフィルタリングにデカントすることをお勧めします。 </li><li>透析が実行されない場合は、減圧（回転蒸発または凍結乾燥をお勧めします）の下に溶媒を除去。 </li><li>無料のランタニドが残っている場合は、手順2.1から2.3までを繰り返すことができます。 </li></ol> 3。透析精密検査<ol><li>余分な長さ（サンプルの体積の約10％）を残したまま、サンプルボリュームを保持するために（製造業者のガイドラインに従って）適切な長さに透析チューブをカット。このビデオでは、100から500ダルトンの分子量カットオフ（MWCO）膜が使用されていましたが、共役をメタル化する前に実行される場合は、大きいMWCOチューブを適宜用いることができる。また、透析カセットは、必要に応じて透析チューブの代替として使用することができます。 </li><li>メーカーのガイドラインに基づいて、適切な場合、周囲温度で15分間水にカット透析チューブを浸す。 </li><li>水（透析液）で透析リザーバーを（1 Lのビーカーがこのビデオで使用された）入力してください。透析液の量は約100倍のサンプルのことでなければなりません。 </li><li>倍管の一方の端を折ると透析の閉鎖クランプで管の折り返し部分を固定します。それは透析中に閉じたままであることを保証するために輪ゴムで閉鎖の端を巻きます。 </li><li> 0.2μmのフィルターを通して反応混合物をフィルタリングし、チューブを引き裂くように注意しながらチューブの開放端にろ液をロードする。チューブを閉じるには、十分なヘッドスペースを残してください。 </li><li>二度、閉鎖と確保、および手順3.4のようにゴムバンドで閉鎖をラップチューブの残りの開放端を折る。 </li><li>ゴムバンドを使用して透析チューブの一端をクランプするために空気を含有するガラスバイアルを取り付けます。他のクランプへの砂の入ったバイアルを取り付けます。これらのバイアルは、チューブが透析液に浸漬に留まることを保証します。 </li><li>透析液を含む透析リザーバーのフルチューブを置きます。 </li><li>周囲温度で低速（無ボルテックス）で磁気攪拌プレートを用いて透析液をかき混ぜる。 </li><li>一日の経過（このビデオでは、透析液を2.5、6.5、11.5時間で変更された）の3倍透析を変更してから、（透析の20〜28時間の合計）透析は一晩を継続することができます。 </li><li>透析液から透析チューブを取り外し、慎重にサンプルを削除する1つの閉鎖を開きます。水で3倍の透析チューブを洗浄し、サンプルと洗浄液を組み合わせる。 </li><li>減圧下で水を取り外します。凍結乾燥は、このビデオで使用されています。 </li></ol> 4。フリー金属の存在の評価<ol><li>酢酸緩衝液中で金属錯体を溶解（バッファの準備を：400 mLの水に酢酸1.4 mLを溶かし、1 M NH 4 OHで5.8にpHを調整し、500mLの総容積を生成するために水を加える）し、キシレノールを追加するオレンジ色のインジケータ（pH 5.8の緩衝液で16μM）。このビデオでは、複雑な0.3 mgをバッファ0.3 mLに溶解し、指示薬溶液の3mLを追加しました。 </li><li>紫に黄色からインジケータの色の変化の観察を経由してフリー金属の存在を検出する。 </li><li>必要に応じて、自由な金属の量は、検量線1を作成することによって定量することができる。また、染料アルセナゾIIIは、キシレノールオレンジ2の代わりに使用することができます。遊離金属が残っている場合、サンプルは、さらに前に特性評価するために透析、脱塩カラム、または高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いて精製する必要があります。 </li></ol> 5。水配位数の決定（Q） <ol><li> H 2 Oで複雑 ​​な（〜1 mm）を含むIII - EUのソリューションとD 2 Oで同じ濃度の別の溶液を調製します分析前に、D 2 O溶液は、残留H 2 Oを除去するために三回を蒸発させて、D 2 Oに溶解する必要があります。 </li><li>きれいなキュベットに水溶液を追加し、分光にキュベットを置きます。 </li><li> （〜395 nmと〜595 nmの、それぞれ）ごとに最大値を決定するために励起および発光スキャンを実行します。 </li><li>ステップ5.3、励起および発光スリット幅（5 nm）から決定した励起および発光波長、発光回数（100）、最初の遅延（0.01ミリ秒）、最大遅延（13ミリ秒）：次のパラメータを使用して燐光時間の崩壊実験を行います、および遅延の増加（0.1ミリ）。これらの条件は、ほとんどの複合体に適していますが、最大遅延値と増分値は、極端に長いまたは極端に短い減衰時間を持つ種については増減することができます。 </li><li>ステップ5.1で作成したD 2 O溶液を用いて、ステップ5.4を繰り返します。 </li><li> 5.4と5.5で得られた発光減衰データから、強度対時間の自然対数をプロット。これらの線の傾きは、減衰率（τ-1）（図2）です。このビデオでは、Microsoft Excel 2007が生データから自然対数プロットを生成するために使用されていました。ホロックスと同僚（式1）3で開発された方程式に減衰率を使用してください。あなたの配位子が金属に配位するOHまたはNH基が含まれている場合、式は使用3の前に変更する必要があります。 </li></ol> 式1： <img src="/files/ftp_upload/2844/2844eq1.jpg" alt="式（1）" /> 6。緩和測定<ol><li> T 1（縦緩和時間）またはT 2（横緩和時間）：緩和時間のアナライザで、目的のアプリケーションモードを選択します。 </li><li> Gdの異なる濃度IIIを含有する水性溶媒中での複合体を含む一連のサンプルを準備します。このビデオでは、水を溶媒として使用され、10.0、5.00、2.50、1.25、0.625、0 mMの溶液を調製した。その他の水性溶剤またはバッファが使用されますが、それは空白のような溶媒を使用することが重要であることができる。サンプルの最終容量は、使用されている楽器に固有のものです。 </li><li>器にサンプルを置き、それは楽器の温度（37℃このビデオではC）に平衡に5分間放置します。 </li><li> T 1またはT 2（T 1とT 2の代表的な曲線を図3に示されている）のための滑らかな指数曲線を得るために、ソフトウェアのパラメータを調整することにより緩和時間を（秒単位）を決定します。 </li><li>空白を含むすべてのサンプルのステップ6.3と6.4を繰り返します。 </li><li> s -1の単位で測定されたT 1またはT 2の値の逆数を計算します。 </li><li> T 1 -1またはT GdのIIIの濃度に対する2 -1の値を（mm単位の）をプロットする。ためにGdのIIIを含む複合体の吸湿性の性質から、原子吸光光度法又は誘導結合プラズマ質量分析法を用いたGdのIIIの濃度を確認する。直線とプロットをフィット。代表的なプロットを図4に示されています。 </li><li>近似直線の傾きは緩和（T 1とT 2、それぞれのためのR 1またはR 2）であり、mMの-1 s -1の単位を持っています。 </li></ol> 7。代表的な結果このプロトコールのステップのための代表的なデータを表と図のセクションに含まれています。プロトコールに記載されて水の配位数と緩和の特性評価に加えて、それは標準的な化学的手法を用いて最終製品を特徴づけることが重要です。化合物の同定は、質量分析、及びGd IIIの診断同位体パターンを示す代表的な質量スペクトルを使用して取得することができます-とEu III含有複合体を図5に示されています。さらに、非GdのIII用</sアップ&gt;ランタニド含有複合体は、NMR分光法は、製品の識別に使用することができます。複合体の純度は、HPLCや元素分析を特徴付けるために、または両方を使用することができます。 <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig1.jpg" alt="図1" /> 図1メタル化と精製の ​​ための一般的なスキーム：スキームは、メタル化し、異なる精製の ​​ルートを選んだ理由のための一般的な手順を描いた。 <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig2.jpg" alt="図2" /> 図2発光強度をプロットする：セクション5から強度対時間の自然対数の代表プロット。水とD 2 Oのソリューションのために取得した同じようなカーブから生成された線の傾きは、Euの水の配位数IIIを含有する複合体を特徴づけるために式1で使用されています。 <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig3.jpg" alt="図3" /> 図3リラクゼーションの減衰時間曲線：（左）T 1と（右）T 2取得 ​​のための代表的なデータ。これらの曲線の形状からの偏差は、信頼できないデータが生成されます。 <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig4.jpg" alt="図4" /> 図4緩和の決定：GdのIIIの濃度対1 / T 1の代表的なプロット。近似直線の傾きは緩和であり、mMの-1 s -1の単位を持っています。 <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig5.jpg" alt="図5" /> 図5マススペクトル：（左）GD III含有複合体及び（右）のEu III含有複合体の診断同位体パターンを示す代表的な質量スペクトル。黒のガウスピークは理論的な同位体の分布を表し、赤い線が実際のデータです。

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	<li>Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+determine+free+Gd+and+free+ligand+in+solution+of+Gd+chelates.+A+technical+note.">How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note.</a> Contrast Med. Mol. Imaging. 1, 184-188 (2006).</li><li>Nagaraja, T. N., Croxen, R. L., Panda, S., Knight, R. A., Keenan, K. A., Brown, S. L., Fenstermacher, J. D., Ewing, J. 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G., Terreno, E., Aime, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+containing+nanosized+systems+for+MR-molecular+imaging+applications.">Metal containing nanosized systems for MR-molecular imaging applications.</a> Coord. Chem. Rev. 252, 2424-2443 (2008).</li><li>Caravan, P., Ellison, J. J., McMurry, T. J., Lauffer, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gadolinium(III)+chelates+as+MRI+contrast+agents:+structure,+dynamics,+and+applications.">Gadolinium(III) chelates as MRI contrast agents: structure, dynamics, and applications.</a> Chem. Rev. 99, 2293-2352 (1999).</li><li>Lauffer, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paramagnetic+metal+complexes+as+water+proton+relaxation+agents+for+NMR+imaging:+theory+and+design.">Paramagnetic metal complexes as water proton relaxation agents for NMR imaging: theory and design.</a> Chem. Rev. 87, 901-927 (1987).</li><li>Yoo, B., Pagel, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+responsive+MRI+contrast+agents+for+molecular+imaging.">An overview of responsive MRI contrast agents for molecular imaging.</a> Front. Biosci. 13, 1733-1752 (2008).</li><li>Pandya, S., Yu, J., Parker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+emissive+europium+and+terbium+complexes+for+molecular+imaging+and+sensing.">Engineering emissive europium and terbium complexes for molecular imaging and sensing.</a> Dalton Trans. 23, 2757-2766 (2006).</li><li>Nwe, K., Xu, H., Regino, C. A. S., Bernardo, M., Ileva, L., Riffle, L., Wong, K. J., Brechbiel, M. 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K., Kolodziej, A., Looby, R. J., Sun, W. -. C., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lysine+walk+to+high+relaxivity+collagen-targeted+MRI+contrast+agents.">A lysine walk to high relaxivity collagen-targeted MRI contrast agents.</a> Chem. Commun. , 430-432 (2009).</li><li>Le&#243;n-Rodr&#237;guez, L. M. D., Kovacs, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+synthesis+and+chelation+chemistry+of+DOTA-peptide+conjugates.">The synthesis and chelation chemistry of DOTA-peptide conjugates.</a> Bioconjugate Chem. 19, 391-402 (2008).</li><li>Boswell, C. A., Eck, P. K., Regino, C. A. S., Bernardo, M., Wong, K. J., Milenic, D. E., Choyke, P. L., Brechbiel, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis,+characterization,+and+biological+evaluation+of+integrin+&#945;V&#946;3-targeted+PAMAM+dendrimers.">Synthesis, characterization, and biological evaluation of integrin &#945;V&#946;3-targeted PAMAM dendrimers.</a> Mol. Pharm. 5, 527-539 (2008).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

ランタニド系造影剤4-14を含んで出版物の増加を考えると、それはケアが、準備、精製、および再現性と比較可能な結果を確保するために製品の特性で撮影されていることが重要です。これらの複合体は、しばしば精製し、その常磁性の性質とバイオコンジュゲーションのために使用される可能性のある官能基の感受性に起因する有機分子の相対的な特徴づけるために挑戦と考えられ?...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬および器具</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th></tr><tr><td> EuCl 3•6H 2 O </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 203254 - 5G </td></tr><tr><td> P - SCN - BN - DTPA </td><td> Macrocyclics </td><td> B - 305 </td></tr><tr><td>アンモニウム水酸化</td><td> EMD </td><td> AX1303 - 3 </td></tr><tr><td>スペクトラ/ポアバイオテックセルロースエステル（CE）透析膜 - 500 D分画分子量</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 68-671-24 </td></tr><tr><td>ミリポアICマイレクス- LGフィルターユニット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> SLLG C13 NL </td></tr><tr><td>キシレノールオレンジ四ナトリウム塩</td><td>アルファAesar </td><td> 41379 </td></tr><tr><td>酢酸</td><td>フルカ</td><td> 49199 </td></tr><tr><td> D 2 O </td><td>ケンブリッジアイソトープラボラトリーズ、（株） </td><td> DLM - 4 - 25 </td></tr><tr><td>浄水器</td><td>エルガ</td><td> Purelabウルトラ</td></tr><tr><td>高速液体クロマトグラフィーと質量分析</td><td>島津</td><td> LCMS - 2010EV </td></tr><tr><td>緩和時間のアナライザ</td><td>ブルカー</td><td> mq60ミニスペック</td></tr><tr><td>紫外可視分光光度計</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 20-624-00092 </td></tr><tr><td>凍結乾燥機</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 10-030-133 </td></tr><tr><td> pHメータ</td><td>ハンナインスツルメンツ</td><td> HI 221 </td></tr><tr><td>蛍光光度計</td><td>ホリバジョバンイボン</td><td> Fluoromax - 4 </td></tr><tr><td>マシューモンローによる分子量の計算のバージョン6.46は、2009年10月17日ダウンロード</td><td> <a href="http://ncrr.pnl.gov/software/">http://ncrr.pnl.gov/software/</a> </td><td>分子量の計算</td></tr></tbody></table>

preparation, purification, and characterization of lanthanide complexes for use as contrast agents for magnetic resonance imaging

Polyaminopolycarboxylateベースのリガンドは、一般的にランタニドイオンをキレートするために使用され、結果として得られる複合体は、磁気共鳴画像（MRI）用造影剤として有用である。多くの市販のリガンドは、アミン反応性の活性エステルとイソチオシアネート基又はチオール反応性マレイミドを介して高分子と生体分子への彼らは、高速、高純度を可能にする官能基を含んでいるために特に有用であり、かつ高収率共役。これらのリガンドのメタル化は、コンジュゲーション化学、メタル化の手順の微妙な違いの分野における一般的な知識と考えている間に金属の出発物質を選択する際に考慮する必要があります。さらに、精製および特性評価のための複数のオプションが存在し、最も効果的な手順の選択は、部分的に出発原料の選択に依存します。これらの微妙な違いは、多くの場合、パブリッシュしたプロトコルでは無視されています。ここで、私たちの目標は、メタル化、精製、およびMRI（図1）のための造影剤として使用することができるランタニド錯体の特性評価のための一般的な方法を示すことです。我々は、この出版物は、生物医学科学者は、出発原料と精製方法の選択を緩和し、一般的に使用される反応の彼らのレパートリーにランタニド錯体形成反応を組み込むことが可能になることを期待しています。

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Preparation, Purification, and Characterization of Lanthanide Complexes for Use as Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging

我々は、メタル化、精製、及びランタニド錯体の特性を示しています。ここで説明する複合体は、磁気共鳴イメージング法を用いて、これらの分子のトラッキングを有効に高分子に結合させることができる。

磁気共鳴イメージングのための準備、精製、および造影剤として使用するための希土類錯体のキャラクタリゼーション

Polyaminopolycarboxylate-based ligands are commonly used to chelate lanthanide ions, and the resulting complexes are 
useful as contrast agents for ...

preparation-purification-characterization-lanthanide-complexes-for

Research

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Biology

14.9K ビュー.  Wayne State University. 我々は、メタル化、精製、及びランタニド錯体の特性を示しています。ここで説明する複合体は、磁気共鳴イメージング法を用いて、これらの分子のトラッキングを有効に高分子に結合させることができる。

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Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative medicine. A non-invasive method to monitor the transplanted stem cells repeatedly in vivo would greatly enhance our ability to understand the mechanisms that control stem cell death and identify trophic factors and signaling pathways that improve stem cell engraftment. MR imaging has been proven to be an effective tool for the in vivo depiction of stem cells with near microscopic anatomical resolution. In order to detect stem cells with MR, the cells have to be labeled with cell specific MR contrast agents. For this purpose, iron oxide nanoparticles, such as superparamagnetic iron oxide particles (SPIO), are applied, because of their high sensitivity for cell detection and their excellent biocompatibility. SPIO particles are composed of an iron oxide core and a dextran, carboxydextran or starch coat, and function by creating local field inhomogeneities, that cause a decreased signal on T2-weighted MR images. This presentation will demonstrate techniques for labeling of stem cells with clinically applicable MR contrast agents for subsequent non-invasive in vivo tracking of the labeled cells with MR imaging.

For the evaluation of new stem cell therapies it is important to non-invasively track the injected cells in vivo. This video will show you how to label human mesenchymal and embryonic stem cells with iron oxide based contrast agents in vivo for subsequent MR imaging in vivo.

MRイメージングと生体内追跡非侵襲のための酸化鉄ナノ粒子で標識ヒトES細胞とhMSCs

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

生物学

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

光イメージングによる非侵襲的検出のための蛍光色素で標識幹細胞

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of the predominant imaging modalities to assess the restoration of the injured myocardium. Furthermore, ex-vivo labeling agents, such as iron-oxide nanoparticles, have been employed to track and localize the transplanted stem cells. However, this method does not monitor a fundamental cellular biology property regarding the viability of transplanted cells. It has been known that manganese chloride (MnCl2) enters the cells via voltage-gated calcium (Ca2+) channels when the cells are biologically active, and accumulates intracellularly to generate T1 shortening effect. Therefore, we suggest that manganese-guided MRI can be useful to monitor cell viability after the transplantation of hESC into the myocardium.
In this video, we will show how to label hESC with MnCl2 and how those cells can be clearly seen by using MRI in vitro. At the same time, biological activity of Ca2+-channels will be modulated utilizing both Ca2+-channel agonist and antagonist to evaluate concomitant signal changes.

In this video, we are showing how to label human embryonic stem cells (hESC) with manganese chloride (MnCl2) which can enter cells via voltage-gated calcium channels when the cells are biologically active. Additionally, we show the use of MnCl2 as cellular MRI contrast agent to determine the in vitro viability of hESC.

磁気共鳴イメージングのためのヒト胚性幹細胞のin vitroでラベリングの

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

This protocol highlights the principles and practical applications of Phase and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

位相コントラストおよび微分干渉コントラスト（DIC）顕微鏡

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

の単離と精製ショウジョウバエ</em磁気ビーズソート別>末梢ニューロン

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

モデル遺伝生物として使用するためのメダカ胚のマイクロインジェクション

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Quantifying Mixing using Magnetic Resonance Imaging

Mixing is a unit operation that combines two or more components into a homogeneous mixture. This work involves mixing two viscous liquid streams using an in-line static mixer. The mixer is a split-and-recombine design that employs shear and extensional flow to increase the interfacial contact between the components. A prototype split-and-recombine (SAR) mixer was constructed by aligning a series of thin laser-cut Poly (methyl methacrylate) (PMMA) plates held in place in a PVC pipe. Mixing in this device is illustrated in the photograph in Fig. 1. Red dye was added to a portion of the test fluid and used as the minor component being mixed into the major (undyed) component. At the inlet of the mixer, the injected layer of tracer fluid is split into two layers as it flows through the mixing section. On each subsequent mixing section, the number of horizontal layers is duplicated. Ultimately, the single stream of dye is uniformly dispersed throughout the cross section of the device.
 Using a non-Newtonian test fluid of 0.2% Carbopol and a doped tracer fluid of similar composition, mixing in the unit is visualized using magnetic resonance imaging (MRI). MRI is a very powerful experimental probe of molecular chemical and physical environment as well as sample structure on the length scales from microns to centimeters. This sensitivity has resulted in broad application of these techniques to characterize physical, chemical and/or biological properties of materials ranging from humans to foods to porous media 1, 2. The equipment and conditions used here are suitable for imaging liquids containing substantial amounts of NMR mobile 1H such as ordinary water and organic liquids including oils. Traditionally MRI has utilized super conducting magnets which are not suitable for industrial environments and not portable within a laboratory (Fig. 2). Recent advances in magnet technology have permitted the construction of large volume industrially compatible magnets suitable for imaging process flows. Here, MRI provides spatially resolved component concentrations at different axial locations during the mixing process. This work documents real-time mixing of highly viscous fluids via distributive mixing with an application to personal care products.

Magnetic resonance imaging (MRI) provides a powerful tool to evaluate the effectiveness of process equipment during operation. We discuss the use of MRI to visualize mixing in a static mixer. The application is relevant to personal care products, but can be applied to a broad range of food, chemical, biomass and biological fluids.

磁気共鳴イメージングを使用してミキシング定量化

Mixing is a unit operation that combines two or more components into a homogeneous mixture.  This work involves mixing two viscous liquid streams using an ...

Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 complexes consist of 14 protein subunits including Ino80, a SNF2-like ATPase, which serves both as the catalytic subunit and the scaffold for assembly of the complexes. Functions of the other subunits and the mechanisms by which they contribute to the INO80 complex&#39;s chromatin remodeling activity remain poorly understood, in part due to the challenge of generating INO80 subassemblies in human cells or heterologous expression systems. This JOVE protocol describes a procedure that allows purification of human INO80 chromatin remodeling subcomplexes that are lacking a subunit or a subset of subunits. N-terminally FLAG epitope tagged Ino80 cDNA are stably introduced into human embryonic kidney (HEK) 293 cell lines using Flp-mediated recombination. In the event that a subset of subunits of the INO80 complex is to be deleted, one expresses instead mutant Ino80 proteins that lack the platform needed for assembly of those subunits. In the event an individual subunit is to be depleted, one transfects siRNAs targeting this subunit into an HEK 293 cell line stably expressing FLAG tagged Ino80 ATPase. Nuclear extracts are prepared, and FLAG immunoprecipitation is performed to enrich protein fractions containing Ino80 derivatives. The compositions of purified INO80 subcomplexes can then be analyzed using methods such as immunoblotting, silver staining, and mass spectrometry. The INO80 and INO80 subcomplexes generated according to this protocol can be further analyzed using various biochemical assays, which are described in the accompanying JOVE protocol. The methods described here can be adapted for studies of the structural and functional properties of any mammalian multi-subunit chromatin remodeling and modifying complexes.

This protocol describes a procedure for generating and purifying wild type and mutant versions of the human INO80 chromatin remodeling complex. Epitope tagged versions of INO80 subunits are stably expressed in HEK293 cells, and complete complexes and complexes lacking specific sets of subunits are purified by immunoaffinity chromatography.

発生と人間INO80クロマチンリモデリング複合体とSubcomplexesの精製

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

三次元ハイドロゲルでイメージングをFRET

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Synthesis of 68Ga Core-doped Iron Oxide Nanoparticles for Dual Positron Emission Tomography /(T1)Magnetic Resonance Imaging

Here, we describe a microwave synthesis to obtain iron oxide nanoparticles core-doped with 68Ga. Microwave technology enables fast and reproducible synthetic procedures. In this case, starting from FeCl3 and citrate trisodium salt, iron oxide nanoparticles coated with citric acid are obtained in 10 min in the microwave. These nanoparticles present a small core size of 4.2 &#177; 1.1 nm and a hydrodynamic size of 7.5 &#177; 2.1 nm. Moreover, they have a high longitudinal relaxivity (r1) value of 11.9 mM-1&#183;s-1 and a modest transversal relaxivity value (r2) of 22.9 mM-1&#183;s-1, which results in a low r2/r1 ratio of 1.9. These values enable positive contrast generation in magnetic resonance imaging (MRI) instead of negative contrast, commonly used with iron oxide nanoparticles. In addition, if a 68GaCl3 elution from a 68Ge/68Ga generator is added to the starting materials, a nano-radiotracer doped with 68Ga is obtained. The product is obtained with a high radiolabeling yield (&#62; 90%), regardless of the initial activity used. Furthermore, a single purification step renders the nano-radiomaterial ready to be used in vivo.

Synthesis of 68Ga Core-doped Iron Oxide Nanoparticles for Dual Positron Emission Tomography /T1Magnetic Resonance Imaging

Here, we present a protocol to obtain 68Ga core-doped iron oxide nanoparticles via fast microwave-driven synthesis. The methodology renders PET/(T1)MRI nanoparticles with radiolabeling efficiencies higher than 90% and radiochemical purity of 99% in a 20-min synthesis.

二重陽電子放出断層レントゲン写真撮影のため68Ga コアをドープした酸化鉄ナノ粒子の合成/(T1) 磁気共鳴イメージング

Here, we describe a microwave synthesis to obtain iron oxide nanoparticles core-doped with 68Ga. Microwave technology enables fast and reproducible ...